鼻腔黏膜免疫佐劑鞭毛蛋白的研究進(jìn)展*

李 旭, 黃思劍, 李健倫, 牟 漫, 張榮輝, 鐘茂華△

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院感染免疫與腫瘤微環(huán)境研究所,武漢 430065 2武漢科技大學(xué)附屬武昌醫(yī)院病理科,武漢 430063

自2020年年初起,由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎在全球大流行,對(duì)人類(lèi)健康和社會(huì)生活構(gòu)成全球性威脅。新型冠狀病毒肺炎的全球大流行再次警醒我們:人類(lèi)依然面臨著傳染病的巨大威脅。傳染病是由細(xì)菌、病毒、真菌等多種病原體入侵人體后造成的局部或全身性損傷。疫苗接種是預(yù)防傳染病最有效的措施。包括HIV、流感、麻疹、新型冠狀病毒在內(nèi)的大多數(shù)病原主要通過(guò)黏膜途徑入侵機(jī)體。黏膜表面的分泌型IgA具有抑制病原在黏膜表面的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)、粘附的作用以及獨(dú)特的胞內(nèi)中和等功能[1];黏膜部位的T細(xì)胞具有直接殺傷病原感染細(xì)胞、分泌細(xì)胞因子抑制病原增殖的功能。因而,通過(guò)疫苗接種預(yù)先誘導(dǎo)有效的黏膜免疫應(yīng)答是預(yù)防傳染病的有效手段。研究表明經(jīng)鼻腔免疫可以誘導(dǎo)有效的黏膜免疫應(yīng)答。然而,大多數(shù)疫苗尤其是亞單位疫苗經(jīng)鼻腔接種后難以誘導(dǎo)有效的黏膜免疫應(yīng)答,需要借助佐劑的輔助作用。黏膜佐劑作為一種免疫增強(qiáng)劑,不僅可以增強(qiáng)抗原的免疫原性,提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平,還可通過(guò)降低抗原用量、減少接種次數(shù)從而提高疫苗的安全性、降低疫苗的成本。

鞭毛蛋白(flagellin)是細(xì)菌鞭毛絲狀體的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是一種獨(dú)特的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),能夠激活Toll樣受體5(Toll-like receptor 5,TLR5)及NLRC4兩條信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎性因子及趨化因子的釋放,進(jìn)而募集和活化樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC),激活宿主的天然免疫進(jìn)而啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答?；谏鲜雒庖邔W(xué)特性,鞭毛蛋白的佐劑活性得到了廣泛而深入的研究。本文就鞭毛蛋白的分子結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)的信號(hào)通路、作為疫苗佐劑的應(yīng)用及機(jī)制作一綜述。

1 鞭毛蛋白的分子結(jié)構(gòu)

大多數(shù)革蘭陰性菌均具有鞭毛。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官,由基體、鉤狀體和絲狀體組成。絲狀體是由鞭毛蛋白呈螺旋狀纏繞而成的中空管狀結(jié)構(gòu)。鞭毛蛋白折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu),其N(xiāo)末端(約170個(gè)氨基酸)和C末端(約100個(gè)氨基酸)高度保守,組成α螺旋結(jié)構(gòu)域,即D0、D1結(jié)構(gòu)域;中央?yún)^(qū)在氨基酸組成和大小方面差別很大,為高變區(qū),構(gòu)成帶有β折疊的D2、D3結(jié)構(gòu)域(圖1)。保守區(qū)負(fù)責(zé)鞭毛的組裝、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)以及免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。高變區(qū)為鞭毛蛋白的抗原優(yōu)勢(shì)表位區(qū),參與蛋白質(zhì)折疊、宿主細(xì)胞粘附、入侵及逃避宿主免疫反應(yīng),與鞭毛穩(wěn)定性及細(xì)菌毒力相關(guān)。

A:細(xì)菌表面鞭毛;B:鞭毛蛋白單體結(jié)構(gòu),D0、D1為保守區(qū),D2、D3為高變區(qū)圖1 鞭毛及鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic gram for flagella and flagellin

2 鞭毛蛋白的信號(hào)通路

鞭毛蛋白能夠激活TLR5及NLRC4兩條信號(hào)通路。TLR5是模式識(shí)別受體Toll樣受體家族中的一員,為單次跨膜蛋白,主要識(shí)別細(xì)胞外鞭毛蛋白并激活下游信號(hào)。它由胞外區(qū)的富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine rich repeat,LRR)以及胞質(zhì)內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/interleukin-1 receptor)組成,主要表達(dá)于DC、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。TLR5通路的激活與保守結(jié)構(gòu)域尤其是D1結(jié)構(gòu)域密切相關(guān),其關(guān)鍵識(shí)別位點(diǎn)為89～96位氨基酸殘基(QRIRELAV)[2-3]。這段氨基酸的缺失或突變將導(dǎo)致TLR5活性的喪失。

TLR5通過(guò)LRR識(shí)別單體鞭毛蛋白后形成同源二聚體,其胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域被激活并募集銜接分子MyD88,并通過(guò)MyD88 N末端的死亡結(jié)構(gòu)域招募帶有相同結(jié)構(gòu)域的IRAK4,相繼激活I(lǐng)RAK1和TRAF6。在泛素連接酶TRAF6的作用下使蛋白激酶TAK1與結(jié)合蛋白TAB1和TAB2形成一個(gè)復(fù)合體,兩條下游信號(hào)通路被激活。其中一條為MAPK途徑,當(dāng)MAPK被激活后,癌基因產(chǎn)物Jun和Fos轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),使轉(zhuǎn)錄因子AP-1被激活,促發(fā)炎癥反應(yīng)。另一條途徑由TAK1復(fù)合體啟動(dòng)IKK激酶復(fù)合體,后者進(jìn)而促進(jìn)IκB分子磷酸化及泛素化降解,使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。在上述2條信號(hào)通路的共同作用下,IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子及DC表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)被上調(diào)(圖2左)[4-5]。

NLRC4/IPAF炎癥小體是NLR家族中的一員,是鞭毛素蛋白的另外一條信號(hào)通路。當(dāng)革蘭陰性菌通過(guò)三型分泌系統(tǒng)(T3SS)將鞭毛蛋白注入宿主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),可被NLRC4所識(shí)別。在通過(guò)募集帶有相同CARD結(jié)構(gòu)域的銜接分子ASC后,與半胱氨酸天冬氨酸水解酶(Caspase-1)相互作用,導(dǎo)致Caspase-1被激活,被激活的Caspase-1通過(guò)蛋白水解作用促進(jìn)IL-18和IL-1β的前體被裂解為成熟的IL-18和IL-1β(圖2右)[6-7]。

3 鞭毛蛋白作為佐劑在疫苗中的研究進(jìn)展

3.1 鞭毛蛋白在鼠疫疫苗中的研究進(jìn)展

鼠疫是由革蘭陰性菌鼠疫耶爾森菌引起的烈性傳染病,通過(guò)蚤類(lèi)叮咬、飛沫、胃腸道等途徑傳播,以發(fā)展速度快、死亡率高為特征。人鼠疫包括:腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥型鼠疫三大臨床類(lèi)型。其中,肺鼠疫的危害最大且傳染性極強(qiáng),主要通過(guò)接觸患者或吸入飛沫感染。目前在用的鼠疫疫苗是用鼠疫弱毒菌株生產(chǎn)的活疫苗,采用皮上劃痕接種。由于現(xiàn)用的鼠疫疫苗的有效性和安全性均存在不足,研究者們正在研發(fā)更加安全、高效的疫苗,其中安全性良好的亞單位疫苗最受青睞。免疫原性強(qiáng)、可誘導(dǎo)保護(hù)性抗體應(yīng)答的莢膜抗原F1以及抗原V通常作為鼠疫亞單位疫苗的靶標(biāo)。美國(guó)維克森林大學(xué)的Steven B.Mizel團(tuán)隊(duì)多年來(lái)一直致力于以鞭毛蛋白為佐劑、F1/V為免疫原的鼠疫黏膜疫苗的研發(fā)。該團(tuán)隊(duì)首先在2006年報(bào)道了鞭毛蛋白的黏膜佐劑活性:鞭毛蛋白與抗原F1混合滴鼻免疫,可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度、長(zhǎng)時(shí)效的F1特異性血清IgG應(yīng)答并產(chǎn)生80%以上的攻毒保護(hù)率;鞭毛蛋白與融合蛋白F1/V混合滴鼻免疫,可在獼猴體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度的F1/V特異性血清IgG應(yīng)答[8]。該團(tuán)隊(duì)于2009年報(bào)道了將鞭毛蛋白與F1/V進(jìn)行基因工程融合,構(gòu)建了融合蛋白flagellin/F1/V;經(jīng)2輪滴鼻免疫后,該蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的F1及V特異性的IgG滴度達(dá)106以上,并產(chǎn)生100%的攻毒保護(hù)[9]。后續(xù)Ⅰ期臨床研究結(jié)果顯示,flagellin/F1/V的安全性良好,在受試者體內(nèi)能夠誘導(dǎo)有效的抗體應(yīng)答[10]及T細(xì)胞應(yīng)答[11]。

TLR5識(shí)別細(xì)胞外鞭毛蛋白,通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域同型募集銜接分子MyD88啟動(dòng)下游信號(hào)(左);入侵細(xì)胞內(nèi)的鞭毛蛋白被胞質(zhì)內(nèi)的NLRC4所識(shí)別,通過(guò)形成炎癥小體,促進(jìn)促炎相關(guān)細(xì)胞因子分泌(右)圖2 鞭毛蛋白的TLR5及NLRC4兩條信號(hào)通路Fig.2 TLR5 and NLRC4 signaling pathways of flagellin

3.2 鞭毛蛋白在口腔疾病——齲齒疫苗中的研究進(jìn)展

齲齒是一種由細(xì)菌感染引起的慢性進(jìn)展性口腔疾病,發(fā)病人群范圍廣,對(duì)人類(lèi)健康及公共衛(wèi)生危害巨大。隨著對(duì)齲患認(rèn)識(shí)的逐步提高,抗齲疫苗的研發(fā)得到越來(lái)越多的關(guān)注,有望成為未來(lái)控制齲患的主要手段。多國(guó)科學(xué)家經(jīng)過(guò)數(shù)十年的深入研究,認(rèn)為變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是主要的致齲病原菌,而其代謝產(chǎn)生的乳酸使牙釉質(zhì)脫鈣進(jìn)而侵害牙本質(zhì)和牙髓為其致齲機(jī)制[12]。免疫學(xué)研究則證明機(jī)體主要的防齲效應(yīng)因子是口腔唾液中的特異性IgA抗體,主要疫苗抗原靶標(biāo)包括變異鏈球菌纖維樣表面粘附素(PAc)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)以及葡聚糖結(jié)合蛋白(GBP)[13-15]。誘導(dǎo)這些抗原靶標(biāo)特異的口腔黏膜IgA應(yīng)答是研發(fā)有效抗齲疫苗的關(guān)鍵。

鄢慧民研究員領(lǐng)導(dǎo)的黏膜免疫學(xué)科組,長(zhǎng)期致力于黏膜IgA功能、黏膜佐劑以及黏膜疫苗的研究和應(yīng)用,開(kāi)展了一系列以重組鞭毛蛋白為黏膜佐劑的齲齒疫苗的研究工作。該團(tuán)隊(duì)首先報(bào)道了鞭毛蛋白作為鼻黏膜佐劑能有效增強(qiáng)DNA疫苗pGJA-P/VAX的免疫原性,誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生PAc特異性的高滴度血清及唾液IgA應(yīng)答,顯著降低齲壞程度[16]。隨后,該研究團(tuán)隊(duì)將重組鞭毛蛋白佐劑與免疫原重組PAc(rPAc)進(jìn)行基因工程融合,獲得了高效誘導(dǎo)rPAc特異性的口腔黏膜IgA應(yīng)答,具有高效防齲、抑齲效果的第一代抗齲疫苗——KF-rPAc[17-18]。在此基礎(chǔ)上,該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步優(yōu)化了免疫原設(shè)計(jì),去除了與鞭毛蛋白佐劑活性無(wú)關(guān)的部分,篩選獲得了第二代融合蛋白抗齲疫苗——KFD2-rPAc。與第一代融合蛋白疫苗相比,KFD2-rPAc保持了第一代融合蛋白疫苗高效誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力和防齲、抑齲的性能,而且大大減少了鞭毛蛋白本身的免疫原性和TLR5相關(guān)的全身性炎癥反應(yīng)[19]。牙菌斑作為生物膜,是牙齒表面的微生物群落,并嵌合宿主和細(xì)菌來(lái)源的各種基質(zhì),齲齒中產(chǎn)酸和耐酸物種(主要為變異鏈球菌)逐漸成為優(yōu)勢(shì)群落。因此,通過(guò)抑制生物膜發(fā)育、防止齲齒細(xì)菌附著是控制齲齒的重要手段[20-21]。利用體外研究,該團(tuán)隊(duì)證實(shí)KF-rPAc免疫動(dòng)物的血清不能抑制變異鏈球菌的增殖,但可抑制其生物膜的形成,提示KF-rPAc誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答主要通過(guò)抑制生物膜的形成干預(yù)齲齒的發(fā)生和進(jìn)展[18]。

除鄢慧民研究團(tuán)隊(duì)外,巴西的Batista等[22]也開(kāi)展了以鞭毛蛋白為佐劑、PAc蛋白作為免疫原的齲齒疫苗研發(fā)工作。該團(tuán)隊(duì)將鞭毛蛋白與PAc混合后,皮下免疫3次,可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的PAc特異性血清IgG應(yīng)答。體外實(shí)驗(yàn)顯示小鼠免疫血清可抑制變形鏈菌與唾液凝集素的粘附。然而,作者并未在動(dòng)物體內(nèi)探究該疫苗的抗齲效應(yīng)。

3.3 鞭毛蛋白在呼吸道疾病中的研究進(jìn)展

3.3.1 鞭毛蛋白在呼吸道合胞病毒疫苗中的研究進(jìn)展 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能低下人群呼吸道感染的重要病毒之一,也是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的主要原因之一。RSV感染嬰幼兒常引起下呼吸道疾病,如毛細(xì)管支氣管炎或肺炎并伴有呼吸窘迫等癥狀。全球每年因感染RSV死亡的嬰幼兒高達(dá)9.46萬(wàn)～14.94萬(wàn)人[23]。然而,迄今為止,尚無(wú)RSV疫苗被批準(zhǔn)上市。

RSV是有包膜的、非分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒。RSV共編碼11個(gè)蛋白:3種膜表面糖蛋白(F蛋白、G蛋白和SH蛋白);2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)及6個(gè)內(nèi)在結(jié)構(gòu)蛋白(L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白、M2-1和M2-2蛋白)。F蛋白和G蛋白是唯一能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的病毒蛋白,也是主要的保護(hù)性抗原,常用作疫苗的靶標(biāo)抗原[24]。美國(guó)Singh團(tuán)隊(duì)將RSV的表面蛋白F、G及結(jié)構(gòu)蛋白M2進(jìn)行基因工程融合,用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了重組融合蛋白rRFM2G,并將其單獨(dú)或與鞭毛蛋白混合后滴鼻免疫小鼠。研究結(jié)果表明rRFM2G可誘導(dǎo)一定強(qiáng)度的抗體應(yīng)答,但鞭毛蛋白并未起到有效的增強(qiáng)抗體應(yīng)答的作用[25]。

鄢慧民研究員領(lǐng)導(dǎo)的黏膜免疫團(tuán)隊(duì)以RSV的結(jié)構(gòu)蛋白P蛋白作為疫苗靶標(biāo),將其與大腸埃希菌K12菌株來(lái)源的鞭毛蛋白(KFD1)進(jìn)行重組融合,獲得融合蛋白P-KFD1。采用滴鼻免疫和RSV攻毒的小鼠模型,研究人員發(fā)現(xiàn)P-KFD1不僅能夠有效地降低上呼吸道及下呼吸道的病毒載量,還不會(huì)引起疫苗增強(qiáng)的疾病作用。作者隨后深入分析了P-KFD1介導(dǎo)免疫保護(hù)的機(jī)制。病毒內(nèi)在蛋白特異性IgA通過(guò)多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR))介導(dǎo)IgA轉(zhuǎn)運(yùn),可在體外及體內(nèi)發(fā)揮胞內(nèi)中和、抑制病毒復(fù)制的效應(yīng)。然而,P-KFD1在pIgR基因敲除小鼠和野生型小鼠體內(nèi)的保護(hù)效應(yīng)無(wú)顯著差異。此外,小鼠免疫血清過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)也未顯現(xiàn)出免疫保護(hù)作用。因此,研究人員排除了抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)作用。然而,清除CD4+T細(xì)胞后,P-KFD1介導(dǎo)的免疫保護(hù)作用基本消失殆盡。上述研究結(jié)果表明P-KFD1的免疫保護(hù)作用主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)。這種特異性的CD4+T細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-γ和IL-17A,在外周及呼吸道局部發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。鑒于其良好的安全性和有效性,P-KFD1作為一種RSV黏膜疫苗,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[26]。

3.3.2 鞭毛蛋白在新型冠狀病毒疫苗中的研究進(jìn)展 新冠病毒是一種有包膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒,刺突(spike,S)蛋白是其重要的結(jié)構(gòu)蛋白,通過(guò)蛋白受體結(jié)合域(receptor binding domian,RBD)與宿主細(xì)胞上血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)結(jié)合,介導(dǎo)病毒的吸附和入侵?；诖?S蛋白尤其是其RBD結(jié)構(gòu)域成為疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究小組開(kāi)展了以鞭毛蛋白作為新冠病毒疫苗的佐劑研究。Mardanova等[27]利用煙葉生產(chǎn)鞭毛蛋白和RBD的融合蛋白,產(chǎn)量高達(dá)100 μg/g新鮮煙葉組織,但研究?jī)H停留在蛋白表達(dá)和純化層面,并未進(jìn)行深入的免疫及攻毒保護(hù)研究。M、N以及ORF3a蛋白在人冠狀病毒的不同株系間高度保守而且具有較強(qiáng)的免疫源性,將這3個(gè)抗原納入疫苗靶標(biāo),有可能介導(dǎo)冠狀病毒不同株系間的交叉保護(hù)。研究人員基于M、N以及ORF3a的序列,設(shè)計(jì)了一個(gè)多表位蛋白NOM,將NOM與鞭毛蛋白融合后,獲得FNOM,利用大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)并采用皮下注射的方式免疫動(dòng)物。與單獨(dú)免疫S蛋白的小鼠相比,FNOM+S聯(lián)合免疫組既顯著增強(qiáng)抗體應(yīng)答又提高了細(xì)胞免疫應(yīng)答[28]。胡濤研究員及其團(tuán)隊(duì)利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備RBD,然后利用化學(xué)偶聯(lián)的方式,將鞭毛蛋白(IC28)或TLR4配體甘露糖(mannan)與其進(jìn)行共價(jià)連接,分別獲得RBD-IC28、RBD-M及RBD-IC28-M。經(jīng)肌肉注射免疫小鼠后,偶聯(lián)雙佐劑的RBD-IC28-M誘導(dǎo)的血清RBD特異性的結(jié)合抗體應(yīng)答、中和抗體應(yīng)答以及T細(xì)胞應(yīng)答均顯著高于單獨(dú)的RBD或者僅偶聯(lián)一種佐劑的RBD[29]。

新型冠狀病毒首先入侵上呼吸道,病毒在鼻咽黏膜處進(jìn)行復(fù)制并通過(guò)空氣進(jìn)行傳播,因此需要在鼻咽黏膜表面預(yù)先建立一個(gè)有效的保護(hù)系統(tǒng),來(lái)預(yù)防病毒的感染和傳播。傳統(tǒng)的肌注疫苗僅能誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答,很難在鼻黏膜處發(fā)揮抗感染效應(yīng)?！禖ell Reports》和《Cellular &Molecular Immunology》最近相繼報(bào)道了我國(guó)科學(xué)家研發(fā)的2款滴鼻式新冠病毒亞單位黏膜疫苗。孫明波研究員團(tuán)隊(duì)將N蛋白及具有融合前構(gòu)象的S蛋白作為疫苗靶標(biāo)、鞭毛蛋白KF和cGAMP作為雙佐劑組合成一個(gè)候選疫苗。滴鼻免疫小鼠后,該疫苗增強(qiáng)了血清和黏膜部位的抗體應(yīng)答,攻毒保護(hù)率達(dá)100%。與滅活苗相比,這種雙佐劑的黏膜疫苗能對(duì)上呼吸道產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)[30]。鄢慧民研究員團(tuán)隊(duì)用鞭毛蛋白KFD作為骨架,嵌合了1個(gè)新冠病毒delta RBD和2個(gè)Omicron RBD,構(gòu)成了一個(gè)亞單位疫苗3Ro-NC。將3Ro-NC與重組鞭毛蛋白佐劑KFD混合滴鼻免疫小鼠后,不僅可誘導(dǎo)高滴度RBD特異性血清IgG及廣譜的中和抗體應(yīng)答,還可誘導(dǎo)唾液、生殖道灌洗液、鼻洗液等黏膜樣本中的IgA應(yīng)答。hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的攻毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),3Ro-NC+KFD滴鼻免疫與肌注的滅活疫苗可誘導(dǎo)相當(dāng)水平的血清中和滴度;但3Ro-NC在誘導(dǎo)黏膜IgA、抑制上呼吸道及鼻甲骨中病毒拷貝數(shù)、減輕肺部損傷等方面,顯示出良好的優(yōu)勢(shì)[31]。上述2款鼻腔吸入式新冠疫苗均顯示黏膜疫苗除了能像傳統(tǒng)滅活疫苗一樣誘導(dǎo)高滴度的血清中和抗體應(yīng)答及肺部保護(hù)外,還表現(xiàn)出可誘導(dǎo)黏膜IgA應(yīng)答、對(duì)上呼吸道起到良好免疫保護(hù)的優(yōu)勢(shì)。

3.4 鞭毛蛋白在HPV和HIV疫苗中的研究進(jìn)展

人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficency virus,HIV)是艾滋病的病原體,人類(lèi)乳頭瘤病毒(human pappiloma virus,HPV)是宮頸癌的主要病原體,二者均主要通過(guò)性行為進(jìn)行傳播。目前,已有多款VLP(virus like particle)形式的HPV疫苗上市,但尚無(wú)安全有效的HIV疫苗上市。研究顯示鞭毛蛋白與HIV或HPV抗原復(fù)合后,均展現(xiàn)出良好的佐劑活性,疫苗形式包括重組蛋白/多肽疫苗、VLP及納米顆粒等。Vassilieva等[32]制備的一個(gè)共表達(dá)HIV的包膜抗原Env及鞭毛蛋白的VLP,肌注和滴鼻免疫均可誘導(dǎo)高滴度的Env特異性的血清IgG及中和抗體應(yīng)答,但僅有滴鼻免疫可誘導(dǎo)生殖道灌洗液中的IgG和IgA應(yīng)答。鞭毛蛋白與HPV抗原直接混合或制備成融合蛋白,可誘導(dǎo)高效的抗體及T細(xì)胞及應(yīng)答,保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免受病毒攻毒引起的感染[33-35],還可達(dá)到預(yù)防腫瘤發(fā)生[36]及治療腫瘤的目的[37]。但以鞭毛蛋白為佐劑的HIV及HPV疫苗研究目前均僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段,尚未進(jìn)入臨床研究。

4 鞭毛蛋白作為佐劑的機(jī)制研究進(jìn)展

如前文所述,鞭毛蛋白具有TLR5與NLRC4兩條信號(hào)通路,具體依賴(lài)哪條信號(hào)通路與免疫途徑密切相關(guān)。如果免疫途徑為腹腔注射,任一通路均足以讓鞭毛蛋白發(fā)揮有效的佐劑活性[38];但滴鼻免疫僅依賴(lài)于TLR5通路[39-40]。與信號(hào)通路類(lèi)似,鞭毛蛋白對(duì)DC的激活機(jī)制也與免疫途徑密切相關(guān)。腹腔注射的鞭毛蛋白可直接激活DC,但滴鼻免疫的鞭毛蛋白不能直接激活DC,而是首先通過(guò)TLR5通路激活呼吸道上皮細(xì)胞,使其分泌GM-CSF等細(xì)胞因子,進(jìn)而對(duì)DC發(fā)揮間接激活的作用[40-41]。呼吸道DC低表達(dá)TLR5而上皮細(xì)胞高表達(dá)TLR5[39]可能是滴鼻免疫途徑鞭毛蛋白獨(dú)特激活DC的原因。

5 總結(jié)和展望

鞭毛蛋白作為鼻腔黏膜佐劑的效應(yīng)已被廣泛證實(shí):在誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答的同時(shí),還能增強(qiáng)黏膜應(yīng)答,尤其是分泌型IgA的產(chǎn)生。除優(yōu)良的佐劑活性外,鞭毛蛋白還具有毒性低、制備簡(jiǎn)單、改造空間大等優(yōu)勢(shì),已成為一個(gè)極具臨床應(yīng)用前景的新型候選黏膜佐劑[42-43]。鑒于目前大多數(shù)病原主要通過(guò)黏膜途徑入侵機(jī)體,利用鞭毛蛋白作為黏膜佐劑開(kāi)發(fā)安全有效的黏膜疫苗,預(yù)先在黏膜系統(tǒng)建立免疫屏障,將是疫苗的理想形式。前文中提到的多款以鞭毛蛋白為鼻腔黏膜佐劑的疫苗,如齲齒疫苗、RSV疫苗、新冠病毒疫苗都展現(xiàn)出了高效的黏膜免疫誘導(dǎo)能力及免疫保護(hù)作用,都極具臨床應(yīng)用前景。