Natalizumab減輕小鼠創(chuàng)傷性腦損傷炎癥反應(yīng)的作用研究*

譚雅夫, 劉 暢, 王圣泳, 黎東翹, 羅 昱, 余永佳, 賴海燕, 馮大勤△

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科 2神經(jīng)外科,南寧 530021

據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年約有1000萬(wàn)人發(fā)生創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)[1]。我國(guó)作為全球最大的發(fā)展中國(guó)家擁有最多的人口數(shù)量,使得TBI的發(fā)生率和患者數(shù)量要遠(yuǎn)高于其他國(guó)家,而TBI導(dǎo)致的不良預(yù)后給患者的家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。因此,探索TBI的發(fā)病機(jī)制和新的治療策略是改善患者預(yù)后的重要途徑。從TBI的發(fā)病機(jī)制來(lái)看,除了外傷引起的原發(fā)性腦損傷,傷后的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的重要原因[2-3],特別是外周血中白細(xì)胞亞群如T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)腦組織的浸潤(rùn)均能導(dǎo)致患者神經(jīng)功能的進(jìn)一步惡化[4]。然而,大量的臨床研究表明非甾體抗炎藥(NSAIDS)、TNF-α抑制劑和IL-1抑制劑等對(duì)TBI后的炎癥反應(yīng)并無(wú)明顯的抑制作用[5]。因此,TBI后的抗炎策略需要進(jìn)一步的探索。眾所周知,Natalizumab(抗CD49d單克隆抗體,VLA-4α鏈)是一種用于治療多發(fā)性硬化和克羅恩病的生物制劑,主要通過(guò)抑制粘附過(guò)程從而防止出現(xiàn)新病灶,并有減輕已有病灶炎癥反應(yīng)的作用,以達(dá)到減少?gòu)?fù)發(fā)的目的。已有研究表明,Natalizumab通過(guò)直接拮抗α4整合素來(lái)阻止免疫細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的粘附和淋巴細(xì)胞在組織中的趨化作用,并通過(guò)抑制α4β7整合素與血管細(xì)胞粘附分子-1的結(jié)合來(lái)減輕炎癥反應(yīng)[6-7],使其有望成為T(mén)BI后抗炎治療的潛在藥物。在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)TBI小鼠模型來(lái)探索Natalizumab對(duì)小鼠神經(jīng)功能損傷的治療效果,希望能為T(mén)BI后的抗炎治療提供新的選擇和思路。

1 材料與方法

1.1 TBI小鼠模型

選取32只6周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。術(shù)前采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠。待小鼠麻醉后,置于立體定位儀,手術(shù)部位備皮消毒。在麻醉小鼠頭皮正中行10 mm切口,隨后用牙科鉆在小鼠右側(cè)頂骨中部開(kāi)顱。將控制性皮質(zhì)沖擊損傷(CCI)設(shè)備(eCCI型號(hào)6.3,美國(guó))的捕獲器端部延伸至其全部沖擊距離,并定位于暴露的硬腦膜表面,復(fù)位,沖擊硬腦膜。以6 m/s速度、1.5 mm變形深度的撞擊器致小鼠腦損傷[8]。最后關(guān)閉縫合小鼠頭皮切口。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

小鼠TBI后3 h,16只實(shí)驗(yàn)組小鼠以12 μg/體重(g)的劑量于腹腔注射N(xiāo)atalizumab(eBioscience)。16只對(duì)照組小鼠按同樣的方法和劑量注射IgG同型對(duì)照抗體(Bio X Cell)。

1.3 小鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)價(jià)

7只實(shí)驗(yàn)組和7只對(duì)照組小鼠分別于TBI后第1天、3天、7天、14天、21天,采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)來(lái)評(píng)估TBI小鼠模型的神經(jīng)功能缺損情況[9]。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建TBI小鼠模型后,7只實(shí)驗(yàn)組和7只對(duì)照組小鼠在第21～25天,采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)小鼠的空間、學(xué)習(xí)和記憶能力[10]。每天對(duì)小鼠在固定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行4次評(píng)估,即4個(gè)象限評(píng)估,每次間隔30 min。每只小鼠都面朝墻壁,被輕放于水面。小鼠被允許90 s找到平臺(tái),并在上面停留10 s,然后記錄找到平臺(tái)的時(shí)間,即為潛伏期時(shí)間,以此來(lái)反應(yīng)認(rèn)知功能。

1.5 小鼠腦水腫程度評(píng)估

在TBI后第3天采用干濕重法對(duì)小鼠腦水腫程度進(jìn)行評(píng)估。待3只實(shí)驗(yàn)組和3只對(duì)照組小鼠深麻醉后取腦標(biāo)本,隨后用電子分析天平對(duì)腦組織進(jìn)行稱(chēng)重,記為濕重(WW)。100℃烘干24 h后,按相同方法稱(chēng)取干重(DW),腦含水(%)=(WW-DW)/WW×100%。

1.6 免疫熒光檢測(cè)

3只實(shí)驗(yàn)組和3只對(duì)照組小鼠于腹腔注射10%水合氯醛麻醉,經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛(PFA)。取出腦組織并在4%多聚甲醛中4℃固定過(guò)夜,于30%蔗糖磷酸鹽緩沖溶液中脫水。然后將腦組織嵌入Tissue-Tek O.C.T中,并冷凍在液氮上。用冰凍切片機(jī)Leica CM 1900制備10 μm冠狀切片,于-20℃保存。染色時(shí),切片在室溫下風(fēng)干1 h,然后用1×PBS沖洗。含0.1% Triton X的封閉溶液封閉切片,使其在室溫下封閉1 h。切片與一抗于4°C孵育過(guò)夜。1×PBS洗滌3次,二抗室溫孵育1 h。用1×PBS洗滌3次,然后封片,于熒光顯微鏡下觀察熒光并計(jì)數(shù)。

1.7 免疫印跡(Western blot)檢測(cè)

從3只實(shí)驗(yàn)組和3只對(duì)照組小鼠腦組織中分離損傷的同側(cè)半球,用研柱在含有蛋白酶抑制劑S8820(Sigma)的冰冷RIPA緩沖液中均質(zhì)組織。于4℃,12000 r/min離心20 min,收集上清。上清樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到膜上。然后用小鼠抗β-actin,兔抗IL-1β和鼠抗NOX2等抗體孵育膜。采用Image J軟件分析條帶灰度值估算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)值均采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用Tamhane’s T2或者Bonferreoni檢驗(yàn),兩組均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Natalizumab改善TBI小鼠神經(jīng)功能和認(rèn)知功能障礙

構(gòu)建TBI小鼠模型后的3 h,我們分別于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的腹腔注射相同劑量的Natalizumab和IgG。在第3、7、14、21天采用mNSS評(píng)分對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果如圖1A所示,從注射N(xiāo)atalizumab的第3天開(kāi)始實(shí)驗(yàn)組小鼠評(píng)分要明顯低于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組小鼠在第7、14、21天的神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為(1.556±0.527)、(1.333±0.500)和(1.111±0.333),陰性對(duì)照組第7、14、21天的神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為(2.875±1.356)、(2.250±1.035)和(2.250±0.886),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),且在第21天兩組評(píng)分的差異達(dá)到最大值。這一結(jié)果提示TBI小鼠在使用Natalizumab治療后其神經(jīng)功能得到了一定程度的改善。隨后,從第21天至25天,我們采用Morris水迷宮對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行了評(píng)估。在第24和25天,注射N(xiāo)atalizumab的實(shí)驗(yàn)組小鼠的潛伏期時(shí)間分別為(27.63±5.12)s和(19.92±6.07)s,對(duì)照組小鼠的潛伏期時(shí)間分別為(48.57±10.01)s和(45.50±6.38)s,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖1B),這一結(jié)果提示TBI小鼠在使用Natalizumab治療后其認(rèn)知障礙得到改善。

A:Natalizumab對(duì)TBI小鼠mNSS評(píng)分的影響;B:Natalizumab對(duì)TBI小鼠認(rèn)知功能的影響;與實(shí)驗(yàn)組比較,*P<0.05圖1 Natalizumab對(duì)TBI小鼠神經(jīng)功能的影響Fig.1 Effects of Natalizumab on nerve function of TBI mice

2.2 Natalizumab改善TBI小鼠腦水腫

構(gòu)建TBI小鼠模型后,我們分別于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的腹腔注射相同劑量的Natalizumab和IgG。隨后在第3天獲取小鼠完整的腦組織,采用干濕重法對(duì)小鼠的腦水腫程度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果如圖2所示,注射N(xiāo)atalizumab的實(shí)驗(yàn)組小鼠的腦組織含水百分比(78.98±0.13)明顯低于對(duì)照組(80.36±0.17),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此我們認(rèn)為T(mén)BI小鼠在使用Natalizumab治療后其腦水腫程度得到了一定程度的改善。

*P<0.05圖2 Natalizumab對(duì)TBI小鼠腦水腫的影響Fig.2 Effect of Natalizumab on brain edema in TBI mice

2.3 Natalizumab降低T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)TBI小鼠腦組織的浸潤(rùn)

構(gòu)建TBI小鼠模型后,我們分別于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的腹腔注射相同劑量的Natalizumab和IgG。在第3天獲取小鼠腦組織,經(jīng)固定和切片后用T細(xì)胞表面標(biāo)記CD3抗體和B細(xì)胞表面標(biāo)記CD19抗體進(jìn)行免疫熒光染色。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),注射N(xiāo)atalizumab的實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中T細(xì)胞和B細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量分別為(3.3±0.6)和(5±1),對(duì)照組小鼠腦組織中T細(xì)胞和B細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量分別為(15.7±1.2)和(15±1),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖3、圖4)。這一結(jié)果提示Natalizumab能夠降低T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)TBI小鼠腦組織的浸潤(rùn)程度。

A:免疫熒光檢測(cè)TBI小鼠腦組織中CD3(標(biāo)尺=100 μm);B:熒光顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù);*P<0.05圖3 Natalizumab對(duì)TBI小鼠腦組織T細(xì)胞浸潤(rùn)的影響Fig.3 Effect of Natalizumab on T cell infiltration in brain tissues of TBI mice

2.4 Natalizumab降低TBI小鼠腦組織NOX2和IL-1β表達(dá)

構(gòu)建TBI小鼠模型后,我們分別于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的腹腔注射相同劑量的Natalizumab和IgG。隨后于第3天獲取損傷同側(cè)的小鼠腦組織,經(jīng)蛋白提取、抗體孵育等步驟,采用免疫印跡檢測(cè)小鼠腦組織中炎癥因子NOX2和IL-1β的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,注射N(xiāo)atalizumab的實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中NOX2和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.48±0.05)和(0.85±0.04),對(duì)照組小鼠腦組織中NOX2和IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.96±0.08)和(1.53±0.03),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5、圖6)。這一結(jié)果提示Natalizumab能夠降低TBI小鼠腦組織中炎癥因子NOX2和IL-1β的表達(dá)。

A:免疫印跡檢測(cè)TBI小鼠腦組織中NOX2的表達(dá);B:NOX2相對(duì)表達(dá)定量分析;*P<0.05圖5 Natalizumab對(duì)TBI小鼠腦組織NOX2表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Natalizumab on NOX2 expression in brain tissues of TBI mice

3 討論

TBI是全世界面臨的主要健康問(wèn)題,目前臨床上沒(méi)有有效的治療措施。在全世界范圍內(nèi),每年TBI導(dǎo)致的直接或間接經(jīng)濟(jì)損失約4000億美元[11]。TBI后首先引起腦實(shí)質(zhì)受損、腦出血和軸突剪切,繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝紊亂和中樞神經(jīng)細(xì)胞死亡,最終造成神經(jīng)損傷、局部血流供應(yīng)障礙、血腦屏障破壞以及周?chē)X組織腫脹等二次腦損傷(secondary brain insult,SBI)[12]。而TBI的后遺癥包括人格改變、認(rèn)知功能下降、精神異常、癲癇發(fā)作和運(yùn)動(dòng)功能障礙等,這些后遺癥嚴(yán)重影響到腦外傷患者的生活質(zhì)量[13]。TBI后的原發(fā)性損傷可引起不可逆轉(zhuǎn)且不可治療的腦損傷,繼發(fā)性損傷對(duì)腦組織損傷演變及臨床預(yù)后亦有重要影響。

A:免疫印跡檢測(cè)TBI小鼠腦組織中IL-1β的表達(dá);B:IL-1β相對(duì)表達(dá)定量分析;*P<0.05圖6 Natalizumab對(duì)TBI小鼠腦組織IL-1β表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Natalizumab onIL-1β expression in brain tissues of TBI mice

在繼發(fā)性腦損傷中神經(jīng)炎癥反應(yīng)是重要的病理生理過(guò)程[14]。促炎性因子主要包括TNF-α、IL-1β和IL-6。IL-1β在其中扮演著重要的角色,可觸發(fā)TBI誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),并且腦組織對(duì)IL-1β和IL-6信號(hào)尤為敏感,這與神經(jīng)系統(tǒng)中多種神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)這些細(xì)胞因子的受體有關(guān)[15]。TBI亦可引起炎性巨噬細(xì)胞趨化及炎性因子的釋放,繼而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能缺陷等。因此,抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是治療或緩解TBI的有效手段[16],而已有報(bào)道,在TBI后靶向抑制免疫細(xì)胞的功能和浸潤(rùn)可起到重要的神經(jīng)保護(hù)作用[17]。已有大量研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)免疫系統(tǒng)中最重要的免疫細(xì)胞,參與到TBI后急性和慢性炎癥反應(yīng)中,促進(jìn)炎癥結(jié)局向特定方向發(fā)展。TBI后強(qiáng)大的炎癥刺激導(dǎo)致早期小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和中性粒細(xì)胞募集,引起巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),可建立一個(gè)減輕有害結(jié)果的保護(hù)環(huán)境。但同時(shí)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞也能釋放各種有害物質(zhì),如促炎細(xì)胞因子、活性氧和興奮性神經(jīng)遞質(zhì),從而加重神經(jīng)損傷[18]。TBI后早期通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞碎片的清除和神經(jīng)再生,但小膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間激活會(huì)導(dǎo)致病理性促炎狀態(tài),進(jìn)一步加重神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷,可使病灶進(jìn)行性擴(kuò)大。小膠質(zhì)細(xì)胞在TBI后的雙重作用與其不同表型之間的平衡密切相關(guān)。在不同的發(fā)展階段,神經(jīng)元通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)可對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞亞型進(jìn)行調(diào)控[19]。同時(shí),時(shí)機(jī)和強(qiáng)度以及特異性免疫組成等因素均會(huì)影響最終結(jié)果,因此免疫調(diào)控在TBI發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[20]。由于TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞的作用具有復(fù)雜性和多面性,提醒我們?cè)谥委煵呗陨蠎?yīng)避免僅僅抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,還需調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞不同表型之間的平衡,繼而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重塑和修復(fù)。鑒于目前對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞及其亞型的消極或積極作用的研究仍處于初級(jí)階段,且尚無(wú)定論,尋求更有效的治療方法值得我們進(jìn)一步探索。Natalizumab是一種針對(duì)免疫細(xì)胞VLA-4α鏈的單克隆抗體,目前已廣泛應(yīng)用于多種自身免疫性疾病的治療,例如多發(fā)性硬化或克羅恩病患者使用Natalizumab后已顯示出良好的治療效果[21]。除此之外,有關(guān)腦缺血小鼠模型的研究中顯示,Natalizumab可阻斷腦缺血后免疫細(xì)胞對(duì)腦組織的侵襲作用,從而起到對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用[22]。目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有Natalizumab在創(chuàng)傷性腦損傷方面應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)構(gòu)建TBI小鼠模型,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Natalizumab后TBI小鼠的神經(jīng)功能障礙得到改善,并減輕了腦水腫程度,降低了免疫細(xì)胞對(duì)小鼠腦組織的浸潤(rùn)和炎癥因子的表達(dá)。據(jù)此,我們認(rèn)為Natalizumab有望成為潛在的TBI治療藥物,并期待進(jìn)一步的研究和探索,希望本實(shí)驗(yàn)?zāi)転門(mén)BI的治療提供新的選擇和思路。