崗稔根正丁醇提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化中ERK/MAPK通路的影響*

畢研蒙, 胡正進(jìn), 王 榮, 劉 媛△

1山東省濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,濟(jì)寧 272067 2昆明市中醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病科,昆明 650051

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是機(jī)體對(duì)各種慢性炎癥所致肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng),也是發(fā)展到肝硬化、甚至原發(fā)性肝癌經(jīng)歷的共同病理生理學(xué)過程[1]。肝纖維化致病因素眾多,形成機(jī)制復(fù)雜。目前來說臨床上并沒有公認(rèn)的抗肝纖維化特效藥物。因此,對(duì)肝纖維化的防治研究進(jìn)行深入探討具有重要意義。

崗稔作為嶺南中藥的一種,其功效包括理氣止痛、利濕止瀉、散瘀止血。其藥用價(jià)值在《本草綱目》、《本草綱目拾遺》等本草專著中已有詳細(xì)記載[2-3]。過去幾十年來人們對(duì)于天然藥物的開發(fā)投入了大量的時(shí)間和精力,對(duì)于有潛力進(jìn)行疾病預(yù)防及治療的新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和評(píng)估進(jìn)行了大量的工作,現(xiàn)代研究表明[4]崗稔中主要含有酚類、單寧類、花青素、黃酮類及揮發(fā)油等,具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降糖等藥理活性和應(yīng)用價(jià)值。臨床上,不乏以崗稔為主的中藥用于治療肝病[5-6]。綜上,崗稔具有改善肝纖維化的潛能,目前國內(nèi)外關(guān)于崗稔化學(xué)成分的研究主要集中在葉、果實(shí)、莖、種子部位,但是崗稔根中的活性成分尚未可知。

本研究擬以肝星狀細(xì)胞及四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型為研究載體,篩選崗稔根不同提取物抗肝纖維化的活性,并探討其改善肝纖維化的機(jī)制,為開發(fā)抗纖維化藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

C57BL/6小鼠,雄性,6～8周齡,購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):44005800005787。細(xì)胞系:人肝星狀細(xì)胞系HSC來源于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇均為分析純,購于廣州化學(xué)試劑廠,氯仿購于天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。高糖DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司),胎牛血清(美國Gibco公司),CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒(日本同仁),二甲基亞砜DMSO(美國Sigma公司),0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司),青-鏈霉素溶液(北京索萊寶公司)。α-SMA(Rabbit,1∶1000),GAPDH(Rabbit,1∶1000),STAT3(Rabbit,1∶1000)、Akt(Rabbit,1∶1000)、ERK1/2即P44/42(Rabbit,1∶1000)、P38(Rabbit,1∶1000)、p-STAT3(Rabbit,1∶1000)、p-Akt(Rabbit,1∶1000)、p-ERK1/2即p-P44/42(Rabbit,1∶1000)和p-P38(Rabbit,1∶1000)購于Cell Signaling Technology,四氯化碳分析純液(美國Sigma公司,貨號(hào)1601168)、PDGF ELISA試劑盒(貨號(hào)CSB-EL017709MO),購于武漢華美生物工程有限公司。超氧化物歧化酶(SOD,貨號(hào)A001-3)、丙二醛(MDA,貨號(hào)A003-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px,貨號(hào)A006-2)及羥脯胺酸(HYP,貨號(hào)A030-2)檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1000V-W EYELA);循環(huán)水真空泵(A-1000S EYELA);細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司);多功能酶標(biāo)儀(美國BioRad公司);倒置顯微鏡(日本Olympus日本,Bx60)。

1.3 方法

1.3.1 崗稔根不同萃取部分的制備 崗稔根生藥材10 kg,加8倍水,兩次加熱回流提取,每次回流提取4 h,將提取液趁熱過濾,合并兩次濾液后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮制備崗稔根浸膏860 g。然后取崗稔水提干浸膏560 g加入約2 L蒸餾水充分溶解,倒入分液漏斗,用1.5 L石油醚萃取,留取石油醚層;重復(fù)上述萃取步驟4～5次,合并石油醚層;剩余混合物依此用乙酸乙酯和水飽和正丁醇重復(fù)萃取4～5次。萃取后所得到的為石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物,余下為水提取物。分別倒入圓底燒瓶,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,并用電子秤稱量所得藥物的質(zhì)量。

1.3.2 制備供試品 精確稱取崗稔根石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物各20 mg,用培養(yǎng)液將每個(gè)部位提取物的供試品倍比稀釋。

1.3.3 細(xì)胞分組給藥 細(xì)胞貼壁后,加入PDGF 10 ng/mL預(yù)處理2 h保證肝星狀細(xì)胞處于活化狀態(tài),每孔分別加入4種藥物供試品溶液100 μL,每種藥物,每個(gè)濃度,設(shè)6個(gè)復(fù)孔,未加藥的孔為對(duì)照組,加PBS的孔為調(diào)零孔。加藥完成后將96孔培養(yǎng)板繼續(xù)放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.4 CCK-8檢測(cè) 96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h后取出,棄去上清,每孔加入CCK-8工作液(10 μL CCK-8原液+90 μL培養(yǎng)液),繼續(xù)放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h,放入酶標(biāo)儀中,在450 nm處測(cè)定吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(給藥實(shí)驗(yàn)組平均A值-調(diào)零孔平均A值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均A值-調(diào)零孔平均A值)×100%。

1.3.5 動(dòng)物造模、分組及給藥 將50只小鼠分為5組,對(duì)照組10只,模型組10只,N-RHT高、低劑量組(1 g/kg和0.5 g/kg)各10只,秋水仙堿組10只。對(duì)照組小鼠予以1.5 mL/(kg·d)純橄欖油腹腔注射;余下各組每只小鼠均按四氯化碳橄欖油溶液(25%,CCl4∶橄欖油=1∶3)2 mL/(kg·d)腹腔注射,頻率3次/周,持續(xù)時(shí)間5周。造模第1周起給予所有藥物干預(yù)組小鼠藥物灌胃。N-RHT低劑量組:CCl4橄欖油溶液腹腔注射30 min后,0.5 g/kg N-RHT藥物懸濁液灌胃;N-RHT高劑量組:CCl4橄欖油溶液腹腔注射30 min后,給予N-RHT高劑量(1 g/kg)懸濁液灌胃。秋水仙堿組:CCl4橄欖油溶液腹腔注射30 min后,給予0.2 mg/kg秋水仙堿懸濁液灌胃。實(shí)驗(yàn)期間,按晝夜時(shí)程,給予所有組別小鼠正常營養(yǎng)顆粒飼料及飲用水。

1.3.6 標(biāo)本采集及稱重 各實(shí)驗(yàn)組造模完成后,200 mg/kg戊巴比妥麻醉小鼠,心臟采血后解剖小鼠,將肝臟和脾臟完整取出,吸干血液,剪去表面的脂肪和系膜后進(jìn)行稱重,臟器指數(shù)=器官質(zhì)量(g)/動(dòng)物體質(zhì)量(g)×100%。

1.3.7 檢測(cè)小鼠血清ALT和AST水平 心臟采血后全血靜置于4℃冷藏,隔夜后3000 r/min離心10 min,分離出血清,放于-80℃超低溫冰箱用于ALT和AST檢測(cè)。

1.3.8 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行血生化指標(biāo)檢測(cè),采用ELISA法檢測(cè)血清中PDGF、HYP和GSH-Px的含量,TBA法和WST-1法檢測(cè)MDA和SOD的活性。

1.3.9 肝組織病理學(xué)檢查 ①蘇木精-伊紅(HE)染色:4%PFA固定好的肝臟組織常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,脫蠟(60℃烤片3 h)至水,蘇木精染色10 min,流水沖洗8 min,1%鹽酸乙醇分化1 s,流水沖洗8 min,伊紅染液2 min 30 s,脫水,透明,中性樹膠封片,通風(fēng)處晾干,顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照。②Masson染色:蘇木精液染核7 min,流水沖洗8 min,1%鹽酸乙醇分化1 s,蒸餾水洗8 min,Masson麗春紅酸性復(fù)紅液7 min,2%冰醋酸浸泡5 s,1%磷鉬酸水溶液3 min,苯胺藍(lán)染色5 min,浸泡在0.2%冰醋酸5 s,二甲苯透明,中性樹膠封固。③天狼星紅(Sirius red)染色:石蠟切片水化,天青石藍(lán)液10 min,蒸餾水洗10 min,沖洗3次,天狼星紅飽和苦味酸液15～30 min,脫水分化。

1.3.10 免疫印跡法 Western blot檢測(cè)肝臟組織中α-SMA蛋白質(zhì)的表達(dá),蛋白提取嚴(yán)格遵循冰上操作原則,取出保存于-80℃冰箱的肝組織,加入0.1 mL RIPA裂解液進(jìn)行冰上超聲裂解,于4℃以12000 r/min離心15 min,取上清液分裝于EP管中,存儲(chǔ)至-80℃冰箱備用。

1.3.11 免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟至水同HE染色法,微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù),一抗4℃封閉過夜(α-SMA 1∶500),二抗室溫孵育1.5 h,PBS沖洗后進(jìn)行DAB染色,中性樹脂封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 崗稔根4個(gè)極性部位提取物的活性篩選

運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)崗稔根4個(gè)極性部位提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果提示崗稔根石油醚部位(P-RHT)、乙酸乙酯部位(E-RHT)和正丁醇部位(N-RHT)、水部位(W-RHT)4個(gè)部位的IC50值分別為458.2 μg/mL、68.34 μg/mL、61.27 μg/mL、3747 μg/mL;然后運(yùn)用Western blot檢測(cè)崗稔根4個(gè)極性部位提取物對(duì)肝星狀細(xì)胞中α-SMA蛋白質(zhì)的影響。結(jié)果提示,在崗稔根4個(gè)極性部位提取物中,只有N-RHT濃度的梯度升高,伴隨著α-SMA蛋白的表達(dá)逐漸下降,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1123,P<0.01),如圖1～4所示。

圖1 P-RHT對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞中α-SMA蛋白的影響Fig.1 Effect of P-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

與0 μg/mL組比較,**P<0.01圖2 E-RHT對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞中α-SMA蛋白的影響Fig.2 Effect of E-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

與0 μg/mL組比較,**P<0.01圖3 N-RHT對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞中α-SMA蛋白的影響Fig.3 Effect of N-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

圖4 W-RHT對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞中α-SMA蛋白的影響Fig.4 Effect of W-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

2.2 N-RHT對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠體重的影響

如表1所示,記錄了實(shí)驗(yàn)周期中各組小鼠的體重變化情況。不同組別體重具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=41.433,P<0.01)。與對(duì)照組小鼠相比,模型組小鼠腹腔注射四氯化碳1周后體重較前下降(P<0.05),然后緩慢增長(zhǎng),但增長(zhǎng)速度較對(duì)照組有所降低;腹腔注射四氯化碳5周后,模型組小鼠體重顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。秋水仙堿組、N-RHT低、高劑量組與模型組小鼠相比,體重顯著增加(均P<0.01)。

表1 各組小鼠體重的變化情況比較Table 1 Comparison of changes in body weight of mice in each

2.3 N-RHT對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝脾指數(shù)的影響

從小鼠肝脾指數(shù)來看,與對(duì)照組比較,模型組小鼠肝脾指數(shù)明顯增大(均P<0.05);N-RHT高劑量和低劑量組小鼠肝脾指數(shù)較模型組明顯降低(均P<0.05),如表2所示。

表2 N-RHT對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of N-RHT on the organ indices

2.4 N-RHT對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝功能的影響

ALT和AST作為臨床上評(píng)價(jià)肝功能損傷的傳統(tǒng)生化指標(biāo),當(dāng)肝臟損傷達(dá)到一定程度后,血清ALT和AST會(huì)升高。如表3所示,模型組血清ALT和AST較對(duì)照組明顯增高(均P<0.01);N-RHT低、高劑量組的ALT和AST顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);秋水仙堿組的血清ALT、AST含量與模型組及對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),提示N-RHT具有保護(hù)肝細(xì)胞,減輕肝損傷作用。

表3 N-RHT對(duì)小鼠血清中ALT和AST的影響Table 3 Effect of N-RHT on serum ALT and

2.5 N-RHT對(duì)四氯化碳所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠血清中HYP、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)含量的影響

HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo),PDGF是肝纖維化發(fā)展過程中重要的細(xì)胞因子。如表4所示,模型組小鼠的血清中HYP含量和PDGF含量明顯升高,與對(duì)照組、N-RHT低、高劑量組以及秋水仙堿組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。N-RHT低、高劑量處理可明顯降低模型組小鼠血清HYP和PDGF含量,提示N-RHT具有減少膠原沉積,延緩肝纖維化發(fā)展的作用。

2.6 N-RHT對(duì)小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)活性的影響

SOD、GSH-Px和MDA可以反映肝臟的氧化應(yīng)激損傷程度。如表4所示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性顯著降低(均P<0.01),而MDA含量顯著提高(P<0.01);秋水仙堿組、N-RHT低、高劑量組血清中SOD、GSH-Px較模型組升高,MDA較模型組降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。提示肝纖維化模型小鼠的抗氧化水平顯著降低,氧化損傷明顯,N-RHT能提高肝纖維化模型小鼠肝臟的抗氧化能力,減少肝臟的氧化應(yīng)激損傷。

表4 各組小鼠血清中HYP、PDGF、GSH-Px、MDA以及SOD含量的比較Table 4 Comparison of serum HYP,PDGF,GSH-Px,MDA and SOD levels in each

2.7 小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2.7.1 小鼠肝組織HE染色 HE染色顯示,對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞呈放射狀排列,匯管區(qū)清楚,無膽管增生及纖維組織增生;模型組小鼠肝細(xì)胞空泡樣變,有明顯灶狀壞死,肝細(xì)胞排列不規(guī)整,可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),小膽管伴纖維組織增生。與模型組相比,秋水仙堿組肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰,門脈區(qū)有少量炎性細(xì)胞分布,肝細(xì)胞空泡樣變明顯減少。N-RHT低劑量組肝細(xì)胞排列較規(guī)整,肝細(xì)胞空泡樣變性減少。N-RHT高劑量組與模型組相比,肝細(xì)胞排列較緊密,肝細(xì)胞的腫脹程度,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均明顯減輕,空泡樣變性明顯減少,未見明顯的膽管及纖維組織增生。如圖5所示。

圖5 各組小鼠肝組織HE染色(×200)Fig.5 HE staining of liver tissues of mice in each group(×200)

2.7.2 小鼠肝組織Masson染色 Masson染色顯示,對(duì)照組的小鼠肝組織未見炎細(xì)胞的浸潤(rùn),沒有空泡樣變,肝細(xì)胞呈條索狀分布,肝小葉的構(gòu)造清晰而完整,沒有不規(guī)則血竇,匯管區(qū)無擴(kuò)大。模型組的小鼠Masson染色藍(lán)色膠原纖維延伸而相互銜接,主要分布在血管壁、血管周圍及細(xì)胞間質(zhì),包裹著整個(gè)肝小葉,而使正常肝小葉的結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致假小葉形成。秋水仙堿組的肝纖維化程度較模型組減輕,可見少量的藍(lán)色染色區(qū)域,纖維間隔形成較少,無明顯假小葉形成。N-RHT低劑量組較模型組明顯減輕,少許藍(lán)色膠原纖維散在分布在血管周圍;N-RHT高劑量組微量藍(lán)色膠原纖維分布在血管周圍,如圖6所示,提示N-RHT有較好的減少膠原沉積的作用。

圖6 各組小鼠肝組織Masson染色結(jié)果(×200)Fig.6 Masson staining of liver tissues of mice in each group(×200)

2.7.3 小鼠肝組織天狼星紅染色 天狼星紅染色顯示,模型組紅色膠原纖維明顯,連續(xù)密集地分布在匯管區(qū),N-RHT低劑量組和秋水仙堿組小鼠肝臟膠原紅色膠原纖維形成較模型組減少,N-RHT高劑量組小鼠肝臟膠原纖維較模型組明顯減少,可見微量膠原纖維分布在匯管區(qū),如圖7所示。此結(jié)果與Masson染色結(jié)果具有一致性,進(jìn)一步驗(yàn)證了N-RHT有較好的減少膠原沉積的作用。

圖7 各組小鼠肝組織天狼星紅染色結(jié)果(×200)Fig.7 Sirus red staining of liver tissues of mice in each group(×200)

2.8 N-RHT對(duì)肝組織α-SMA蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于對(duì)照組來說,模型組α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01),而N-RHT不同劑量組α-SMA表達(dá)相對(duì)模型組明顯減少(均P<0.01),如圖8所示。免疫組化染色顯示,對(duì)照組小鼠肝組織中α-SMA染色極淡且極稀少,相對(duì)于模型組連續(xù)而密集的黃色纖維集中于匯管區(qū),秋水仙堿組和N-RHT高、低劑量組陽性染色區(qū)域明顯減少,尤其是高劑量組更加明顯,如圖9所示。

與對(duì)照組比較,*P<0.05 **P<0.01;與模型組比較,△P<0.05 △△P<0.01圖8 Western blot檢測(cè)各組小鼠肝臟α-SMA蛋白表達(dá)差異Fig.8 Difference in α-SMA expression in liver tissues of mice in each group detected by Western blotting

與對(duì)照組比較,*P<0.05 **P<0.01;與模型組比較,△P<0.05 △△P<0.01圖9 免疫組化法檢測(cè)各組小鼠肝臟α-SMA表達(dá)差異(×100)Fig.9 Difference in α-SMA expression in liver tissues of mice in each group detected by immunohistochemical method (×100)

2.9 N-RHT對(duì)ERK/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

如圖10所示,隨著N-RHT濃度的升高,p-P44/42和P44/42的比值隨著濃度的增加明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。p-P38/P38、p-STAT3/STAT3以及p-AKT/AKT的比值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:Western blot結(jié)果顯示N-RHT對(duì)HSC中P38、p-P38、P44/42和p-P44/42蛋白的影響;B:Western blot結(jié)果顯示N-RHT對(duì)HSC中STAT3、p-STAT3、Akt和p-Akt的影響;C～F:蛋白水平定量分析;與對(duì)照組比較,**P<0.01;與5 μg/mL組比較,△△P<0.01圖10 N-RHT在細(xì)胞模型上對(duì)肝纖維化相關(guān)信號(hào)通路的影響Fig.10 Effects of N-RHT on hepatic fibrosis related signaling pathways in cell models

3 討論

肝纖維化是目前已知的各種慢性肝病最重要的病理特征,也是向肝硬化發(fā)展過程中的主要環(huán)節(jié)。HSC的激活為肝纖維化形成的核心環(huán)節(jié)[7]。肝星狀細(xì)胞增殖能力可作為肝星狀細(xì)胞的一種活化形式,因?yàn)樾菭罴?xì)胞的活化受到抑制必然會(huì)導(dǎo)致增殖力的下降。肝受損時(shí)HSC被激活,在PDGF、TGF-β等生長(zhǎng)因子激活下,細(xì)胞外基質(zhì)形成增多,一旦超過纖維的降解即可導(dǎo)致肝臟纖維化[8-9]。中醫(yī)藥在“治未病”領(lǐng)域源遠(yuǎn)流長(zhǎng),對(duì)肝纖維化的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)具有獨(dú)到的見解。中藥可發(fā)揮多層次、多環(huán)節(jié)的綜合調(diào)節(jié)作用[10]。因此本研究選用藥食同源且對(duì)于臨床肝病常用的中藥——崗稔根活性部位進(jìn)行篩選及分子機(jī)制的研究。

本研究首先采用CCK-8法對(duì)崗稔根四大部位提取物進(jìn)行細(xì)胞水平的活性篩選,同時(shí)進(jìn)行Western blot檢測(cè)肝星狀細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)N-RHT可抑制活化的肝星狀細(xì)胞的增殖,顯著降低α-SMA蛋白的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,Western blot檢測(cè)及免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明,α-SMA在模型組肝組織內(nèi)陽性表達(dá)量顯著增多,N-RHT干預(yù)后則使其表達(dá)量顯著下降;體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)同時(shí)說明N-RHT可以抑制HSC的激活,具有較好的抗肝纖維化的活性。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明N-RHT可以改善四氯化碳腹腔注射引起的小鼠體重減輕及肝脾腫大,血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)N-RHT可以降低小鼠血清中AST、ALT、PDGF和MDA的含量,升高SOD、GSH-Px的含量,提示N-RHT具有減輕肝細(xì)胞損傷、保肝降酶和抗氧化的作用。

病理檢測(cè)是判斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn),病理學(xué)檢查表明模型組的小鼠肝臟具有明顯的纖維化病理改變,N-RHT低、高劑量組中肝細(xì)胞變性、炎癥浸潤(rùn)及壞死等病變顯著減輕,肝臟膠原纖維的沉積減少;結(jié)合血清中HYP含量降低,提示N-RHT可降低膠原蛋白沉積,促進(jìn)膠原降解進(jìn)而抑制膠原纖維的形成,延緩肝纖維化的進(jìn)展。

有研究顯示,PI3K/Akt/mTOR軸與HSC的生長(zhǎng)和激活密切相關(guān),從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[11],因此在肝纖維化的發(fā)展過程中PI3K/Akt通路是肝纖維化的治療靶點(diǎn)之一[12]。STAT3信號(hào)在炎癥性疾病中起重要作用并且可以被PDGF激活[13],研究表明STAT3在肝病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[14]。因此我們?cè)诩?xì)胞模型上檢測(cè)Akt、p-Akt以及STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)p-Akt/Akt以及p-STAT3/STAT3的比值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示PI3K/Akt和STAT3信號(hào)通路可能不是N-RHT調(diào)控發(fā)揮抗肝纖維化的信號(hào)通路。

MAPK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶家族,包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK、應(yīng)激活化蛋白激酶P38和c-Jun氨基末端激酶JNK[15]。其中ERK、P38作為關(guān)鍵激酶,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)[16]。P38通過炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡影響肝纖維化的進(jìn)程[17-18];ERK信號(hào)通路參與Ⅰ型膠原分泌及肝星狀細(xì)胞的增殖[19-20]。本次研究中我們檢測(cè)了ERK相關(guān)蛋白P44/42及其磷酸化蛋白的表達(dá),隨著N-RHT濃度的增高,p-P44/42和P44/42的比值顯著下調(diào),提示ERK/MAPK信號(hào)通路可能參與了N-RHT抗肝纖維化的作用機(jī)制。

綜上,N-RHT可抑制肝星狀細(xì)胞的活化,抑制膠原蛋白沉積,具有保肝抗氧化的作用,其機(jī)制可能與抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究豐富了N-RHT治療肝纖維化的理論依據(jù),為N-RHT治療肝纖維化的臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。