右美托咪定通過激活SIRT1/BDNF信號通路改善新生大鼠缺氧缺血性腦損傷所致認(rèn)知障礙*

余 丹, 陳彰強(qiáng), 彭曉紅

武漢市第四醫(yī)院麻醉科,武漢 430033

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是由于圍生期新生兒缺氧缺血而導(dǎo)致的腦損傷,可造成患兒腦性癱瘓、認(rèn)知功能障礙、癲癇等神經(jīng)后遺癥[1-2]。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一種選擇性α腎上腺素能受體激動(dòng)劑,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流且無呼吸抑制的作用。研究顯示,右美托咪定對缺血缺氧新生大鼠腦損傷具有保護(hù)作用[3],還可減輕老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一種組蛋白脫乙酰化酶,可通過去乙?；饔脜⑴c氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)等作用。研究顯示SIRT1可激活下游腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),BDNF參與神經(jīng)存活與發(fā)生,其水平升高可改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙[5-6]。研究顯示,SIRT1通過調(diào)節(jié)HMGB1表達(dá)進(jìn)而調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,參與抗神經(jīng)炎癥反應(yīng),在新生兒HIBD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。研究表明,右美托咪定通過調(diào)節(jié)SIRT1信號通路,減輕創(chuàng)傷性腦損傷大鼠病理損害,起保護(hù)神經(jīng)的作用[8]。右美托咪定對HIBD引起的認(rèn)知功能障礙的作用及機(jī)制尚不清楚,本研究在驗(yàn)證右美托咪定保護(hù)腦HIBD損傷的基礎(chǔ)上,觀察右美托咪定對HIBD引起認(rèn)知功能障礙及SIRT1/BDNF信號通路的影響,初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7日齡SPF級新生SD大鼠,體重12～16 g,購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2019-0004。

1.2 主要藥物和試劑

鹽酸右美托咪定注射液(2 mL:0.2 mg)購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司;SIRT1抑制劑EX527(E7034)購自Sigma公司;One-step TUNEL Apoptosis Kit(E-CK-A321)購自Elabscience;通用SP檢測試劑盒(SP0041)、TTC染色液(G3005)購自Solarbio公司;兔抗突觸后致密蛋白-95(postsynaptic dense protein-95,PSD95)(AF1096)、SIRT1(ab189494)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)(AF1018)、pCREB(AF5785)、BDNF(AF1423)抗體購自Beyotime公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型復(fù)制及分組 采用改良Rice法[9]復(fù)制HIBD大鼠模型:新生大鼠吸入3%異氟烷麻醉,沿頸部正中切口,分離左頸總動(dòng)脈,結(jié)扎并縫合傷口,將大鼠置于缺氧環(huán)境中(92% N2+8% O2)4 h,對照組僅游離頸總動(dòng)脈,不做缺氧缺血處理。

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為對照組(Control組)、模型組(HIBD組)、Dex組、Dex+EX527組,造模后,Dex組使用100 μg/kg右美托咪定腹腔注射給藥,給藥劑量參照文獻(xiàn)[6];Dex+EX527組使用100 μg/kg右美托咪定腹腔注射給藥與10 μg EX527術(shù)前側(cè)腦室注射給藥;Control組與HIBD組給予等量的生理鹽水。

大鼠缺氧4 h后,對大鼠進(jìn)行Zea Longa評分[10],0分表示神經(jīng)癥狀正常,1～3分表示造模成功,剔除0、4、5分大鼠,隨機(jī)補(bǔ)充保證每組10只大鼠。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后,以Morris水迷宮[11]檢驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。保持水溫25℃左右,實(shí)驗(yàn)第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練,剔除有運(yùn)動(dòng)障礙的大鼠,實(shí)驗(yàn)第2(D2)、4(D4)、6(D6)天的同一時(shí)間點(diǎn)從水池4個(gè)象限點(diǎn)放入大鼠,記錄大鼠2 min內(nèi)登上平臺時(shí)間;若在2 min內(nèi)大鼠未找到平臺,則人為引導(dǎo)大鼠找到平臺并記錄時(shí)間為2 min。第6天水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后移走平臺,將大鼠從水池4個(gè)象限點(diǎn)放入水中,記錄大鼠在2 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)和穿越平臺的時(shí)間。

1.3.3 TTC染色檢測腦梗死面積 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)取5只大鼠處死,取腦組織冰凍后切成厚度為2 mm的切片,選同一部位切片采用4%多聚甲醛固定及TTC染色法染色,采用Image J 1.8.0軟件分析切片腦梗死面積,即該切片切面的腦梗死面積占總面積的百分比,其中正常腦組織顯紅色,梗死組織顯白色。

1.3.4 TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡 取各組大鼠腦組織同一部位冰凍切片,根據(jù)One-step TUNEL Apoptosis Kit說明書進(jìn)行TUNEL染色,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元凋亡。隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)算平均凋亡率,神經(jīng)元凋亡率=顯示綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5 免疫組化檢測海馬組織PSD95表達(dá) 另外5只大鼠處死后取海馬組織,一部分組織-80℃保存,另一部分組織4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片,免疫組化法檢測海馬組織PSD95表達(dá),隨機(jī)選擇3個(gè)視野,顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)染色陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 Western blot檢測大鼠海馬組織SIRT1、CREB、pCREB、BDNF蛋白表達(dá) 各組剩余海馬組織用液氮研磨,加入RIPA裂解液離心提取總蛋白,取適量樣品煮沸變性后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜,加入兔抗鼠SIRT1、CREB、pCREB、BDNF一抗稀釋液,4℃孵育過夜,加二抗,顯色曝光,以β-actin為內(nèi)參分析目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對HIBD大鼠認(rèn)知功能的影響

與Control組比較,HIBD組大鼠在D2、D4、D6逃避潛伏期顯著延長(均P<0.05),空間探索時(shí)間明顯增加,穿越平臺次數(shù)明顯減少(均P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠在D2、D4、D6逃避潛伏期明顯縮短(均P<0.05),空間探索時(shí)間明顯減少,穿越平臺次數(shù)明顯增加(均P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠在D2、D4、D6逃避潛伏期明顯延長(均P<0.05),空間探索時(shí)間明顯增加,穿越平臺次數(shù)顯著減少(均P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 1 Comparison of the water maze test results of rats in each

2.2 右美托咪定對HIBD大鼠神經(jīng)功能及腦梗死面積的影響

Control組大鼠腦組織沒有出現(xiàn)梗死現(xiàn)象,神經(jīng)功能評分為0;HIBD組大鼠腦組織白色區(qū)域增多,說明有明顯的梗死灶形成,其腦梗死面積與神經(jīng)功能評分均較Control組顯著增加(均P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠腦組織白色區(qū)域減少,梗死面積與神經(jīng)功能評分顯著減少(均P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠腦梗死面積與神經(jīng)功能評分顯著增加(均P<0.05),見圖1。

與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死面積Fig.1 Neurological function score and cerebral infarction area of rats in each group

2.3 右美托咪定對HIBD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL染色凋亡神經(jīng)元顯示綠色,與Control組比較,HIBD組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖2。

與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖2 各組大鼠神經(jīng)元凋亡(TUNEL染色,×200)Fig.2 Neuron apoptosis of rats in each group(TUNEL,×200)

2.4 右美托咪定對HIBD大鼠海馬組織PSD95表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示,與Control組比較,HIBD組大鼠海馬組織PSD95陽性表達(dá)率顯著降低(P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠海馬組織PSD95陽性表達(dá)率顯著升高(P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠海馬組織PSD95陽性表達(dá)率顯著降低(P<0.05),見圖3。

與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖3 各組大鼠海馬組織PSD95表達(dá)(免疫組化染色,×100)Fig.3 Expression of PSD95 in hippocampus of rats in each group(Immunohistochemical staining,×100)

2.5 右美托咪定對HIBD大鼠海馬組織SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與Control組比較,HIBD組大鼠海馬組織SIRT1、BDNF蛋白表達(dá)水平及pCREB/CREB顯著降低(均P<0.05);與HIBD組比較,Dex組大鼠海馬組織SIRT1、BDNF蛋白表達(dá)水平及pCREB/CREB顯著升高(均P<0.05);與Dex組比較,Dex+EX527組大鼠海馬組織SIRT1、BDNF蛋白表達(dá)水平和pCREB/CREB顯著降低(均P<0.05),見圖4。

1:Control組;2:HIBD組;3:Dex組;4:Dex+EX527組;與Control組比較,*P<0.05;與HIBD組比較,#P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05圖4 各組大鼠海馬組織SIRT1、CREB、pCREB、BDNF蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of SIRT1,CREB,pCREB and BDNF protein in hippocampus of rats in each group

3 討論

HIBD是引起新生兒死亡和殘疾的主要原因,高達(dá)25%的患兒遺留永久性神經(jīng)后遺癥,即使經(jīng)過低溫治療仍有后遺癥的發(fā)生[12]。缺血缺氧是HIBD重要的病理生理過程,可引起腦組織發(fā)生病理變化,如梗死與神經(jīng)元凋亡,其中海馬組織CA1區(qū)是學(xué)習(xí)、記憶的重要區(qū)域,組織損傷可引起認(rèn)知功能障礙[13]。PSD95為神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白,在神經(jīng)功能與發(fā)育方面有重要作用,可反映學(xué)習(xí)記憶功能,在認(rèn)知功能障礙的大鼠海馬中PSD95表達(dá)水平降低[14]。本研究結(jié)果顯示,給予HIBD模型大鼠右美托咪定治療后,大鼠逃避潛伏期明顯縮短,空間探索時(shí)間明顯減少,穿越平臺次數(shù)明顯增加,腦梗死面積與神經(jīng)功能評分、神經(jīng)元凋亡率顯著降低,海馬組織PSD95陽性表達(dá)率升高,表明右美托咪定可減輕HIBD大鼠神經(jīng)損傷與認(rèn)知功能障礙。

右美托咪定具有抗焦慮、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)等作用,在改善缺血缺氧引起腦損傷和神經(jīng)功能方面發(fā)揮重要作用。另外,右美托咪定還可改善氣道的壓力和順應(yīng)性,無呼吸抑制作用[15]。Gao等[16]研究顯示,右美托咪定可通過線粒體途徑抑制神經(jīng)元凋亡,介導(dǎo)神經(jīng)珠蛋白表達(dá)而發(fā)揮對缺氧復(fù)氧模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。楊悅等[17]研究顯示,右美托咪定可激活Wnt/GSK-3β/β-鏈蛋白信號通路抑制七氟醚誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元凋亡,并改善大鼠認(rèn)知功能障礙。本研究結(jié)果與既往報(bào)道結(jié)果類似,且本研究還發(fā)現(xiàn),右美托咪定改善HIBD大鼠神經(jīng)損傷及認(rèn)知功能障礙的作用可被SIRT1抑制劑逆轉(zhuǎn),推測右美托咪定可能通過激活SIRT1信號通路減輕HIBD引起的大鼠認(rèn)知功能障礙。研究顯示,SIRT1信號通路在缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮重要作用[18]。

SIRT1是NAD+依賴的去乙?；?在腦組織中主要表達(dá)于海馬神經(jīng)元,通過去乙酰作用參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng),在參與神經(jīng)保護(hù)作用方面發(fā)揮重要作用[19]。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子,參與突觸的正常生長、發(fā)育和可塑性,對缺血缺氧性腦損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用,SIRT1可通過調(diào)節(jié)CREB的表達(dá)進(jìn)而影響B(tài)DNF的表達(dá),BDNF是CREB最重要的靶蛋白之一,CREB的磷酸化(pCREB)可增強(qiáng)BDNF的轉(zhuǎn)錄激活,在學(xué)習(xí)、記憶和情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]。SIRT1/BDNF信號通路激活可改善血管性認(rèn)知障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和腦缺血再灌注大鼠的認(rèn)知功能[21-22]。本研究結(jié)果顯示,使用右美托咪定治療HIBD模型大鼠后,HIBD大鼠海馬組織SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示右美托咪定可能激活SIRT1/BDNF信號通路;而使用SIRT1抑制劑EX527可顯著下調(diào)SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表達(dá)水平,并且逆轉(zhuǎn)右美托咪定HIBD大鼠腦組織損傷及認(rèn)知功能的抑制作用,表明右美托咪定可通過激活SIRT1/BDNF通路保護(hù)HIBD大鼠腦神經(jīng)損傷,改善認(rèn)知功能障礙。右美托咪定是通過何種途徑影響SIRT1的表達(dá),仍需做深入研究。研究顯示,AMPK是SIRT1的激活劑,同時(shí)SIRTl的過度表達(dá)可激活下游的AMPK,表明二者可通過能量代謝發(fā)揮獨(dú)立或協(xié)同作用[23]。右美托咪定可通過調(diào)節(jié)AMPK,影響SIRT1表達(dá),進(jìn)而影響pCREB,增強(qiáng)BDNF的轉(zhuǎn)錄激活。研究顯示[24],行肝葉切除術(shù)的患者在麻醉之后分別以0.3 μg/(kg·h)或0.6 μg/(kg·h)的的速率靜脈泵注右美托咪定,直至手術(shù)完成,患者發(fā)生術(shù)后譫妄和術(shù)后認(rèn)知功能障礙的比例較對照組顯著降低,提示右美托咪定對改善認(rèn)知功能障礙有一定臨床應(yīng)用意義。

綜上所述,右美托咪定可通過激活SIRT1/BDNF信號通路,改善HIBD新生大鼠神經(jīng)功能損傷與認(rèn)知功能障礙。本研究為HIBD引起的認(rèn)知功能障礙的治療提供了新思路。