七氟醚后處理通過調(diào)節(jié)FTO/KCNJ2對(duì)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

鄧方方, 李繼勇, 張 力, 鄒高銳, 陳治軍, 樂 薇

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,武漢市第一醫(yī)院 1麻醉科 2針灸科,武漢 430022

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)指的是缺血的心肌在恢復(fù)灌注時(shí)其結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞甚至出現(xiàn)心肌梗死范圍擴(kuò)大等現(xiàn)象,對(duì)患者預(yù)后造成嚴(yán)重影響[1-2]。探索MIRI中的分子機(jī)制對(duì)揭示其復(fù)雜病理機(jī)制,提高M(jìn)IRI患者生存率具有重要意義。

在臨床實(shí)踐中,七氟醚作為一種吸入麻醉劑已被廣泛應(yīng)用,已發(fā)現(xiàn)七氟醚可在體內(nèi)外誘導(dǎo)缺血耐受[3],然而七氟醚對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物中最常見的mRNA修飾,研究表明m6A甲基化與心臟功能的維持密切相關(guān)[4]。脂肪和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是一種RNA去甲基化酶,也被稱為“擦除蛋白”,已有研究表明FTO在老年小鼠缺血性心臟中表達(dá)降低[5]。另外,FTO也被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)的穩(wěn)定性進(jìn)而改善缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxgenation,H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[6]。內(nèi)向整流型鉀離子通道亞家族J成員2(potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 2,KCNJ2)以往被證實(shí)在MIRI中表達(dá)下調(diào)[7],但是其在MIRI中的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

本研究通過構(gòu)建MIRI細(xì)胞模型,探究七氟醚在MIRI中的具體機(jī)制,揭示七氟醚/FTO/KCNJ2通路在MIRI中發(fā)揮的可能作用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)液(貨號(hào)PM150210B)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。七氟醚購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C0009S)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)A020-2-2)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)40302ES20)和核糖體RNA去除試劑盒(貨號(hào)12253ES)購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào)L3000015)購(gòu)自北京誠(chéng)聚德生物技術(shù)有限公司。FTO抗體(貨號(hào)ab280081)、KCNJ2抗體(貨號(hào)ab109750)、IgG抗體(貨號(hào)ab205718)和m6A抗體(貨號(hào)ab151230)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。Trizol試劑(貨號(hào)R1030)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。cDNA合成試劑盒(貨號(hào)YB-S052)購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司。SYBR Green Supermix(貨號(hào)1725124)購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。RIPA裂解液(貨號(hào)P0013K)、BCA試劑盒(貨號(hào)P0012)購(gòu)自碧云天生物。放線菌素D購(gòu)自Sigma公司。RIP免疫沉淀試劑盒購(gòu)自Millipore。CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司。SpectraMax M5e多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器(上海)有限公司。ABI 7000型定量PCR儀購(gòu)自蘇州亞凡生物技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)獲取MIRI相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE160516,分析4例假手術(shù)組及12例MIRI大鼠心肌組織中的差異表達(dá)基因,差異篩選條件為adj.P.Value<0.05和|Log FoldChange|>1。通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GSE160516芯片中差異表達(dá)基因做GO分析。在SRAMP網(wǎng)站(http://www.cuilab.cn/sramp)預(yù)測(cè)KCNJ2的m6A修飾位點(diǎn)。RPISeq網(wǎng)站(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/)預(yù)測(cè)KCNJ2和FTO的結(jié)合。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及H/R損傷模型建立

將AC16細(xì)胞置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),分為Control組(空白對(duì)照組,以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在95%空氣和5% CO2混合氣體條件下培養(yǎng));H/R組:將細(xì)胞置于缺氧室(含95% N2和5% CO2)中以無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h,之后將無血清DMEM培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在95%空氣和5% CO2的條件下復(fù)氧處理3 h;七氟醚組:接受上述H/R處理,并在復(fù)氧前以97.6% O2和2.4%七氟醚處理20 min。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)計(jì)并合成FTO和KCNJ2的小干擾RNA(si-FTO,si-KCNJ2),以各自的陰性對(duì)照si-NC作為對(duì)照。使用qRT-PCR擴(kuò)增KCNJ2的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列,將cDNA克隆至pcDNA3.1載體上,構(gòu)建KCNJ2的過表達(dá)載體(pcDNA3.1-KCNJ2),以空載體(pcDNA3.1)為對(duì)照。AC16細(xì)胞在37℃、5%CO2的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),直到細(xì)胞達(dá)到90%融合,使用LipofectamineTM3000將上述siRNA或載體轉(zhuǎn)染至AC16細(xì)胞,48 h后進(jìn)行相應(yīng)處理,并采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將處理后的AC16細(xì)胞接種在48孔板(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)中。將10 μL MTT試劑添加至各孔中,37℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)上清液,每孔加入100 μL Formazan溶解液,混勻后孵育直至Formazan全部溶解。使用多功能酶標(biāo)儀記錄570 nm處的吸光度(A570nm)值。

1.6 微板法檢測(cè)LDH的釋放

將處理后的AC16細(xì)胞接種于96孔板(2×104個(gè)細(xì)胞/孔)中。在收集細(xì)胞上清液后,在測(cè)定孔中添加20 μL待測(cè)樣本、25 μL基質(zhì)緩沖液和5μL輔酶Ⅰ,其余各孔依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行添加,各孔混勻后在37℃溫浴15 min。各孔分別添加25 μL 2,4-二硝基苯肼,混勻后在37℃溫浴15 min。各孔分別添加250 μL NaOH溶液,混勻后在室溫下靜置5 min,在450 nm處測(cè)定吸光度值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集處理后的AC16細(xì)胞,300×g,4℃離心5 min,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,吸棄PBS,加入100 μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI混勻,避光反應(yīng)15 min,加入400 μL 1×Binding buffer,混勻后置于冰上,在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用Trizol試劑提取總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒將1 μg總RNA合成cDNA。隨后,使用SYBR Green Supermix在ABI 7000型定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系包括12.5 μL SYBR Green Supermix,上下游引物各1 μL,DNA模板2 μL和雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 3 min,95℃ 5 s,60℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列為:FTO正向5′-ACCTATGCTGACCATTCCAA-G-3′,反向5′-CTGTTGGTTCAGAAGGCTCTC-3′;KCNJ2正向5′-AGCACAATTCCAAAGGATGG-3′,反向5′-ATTGCGGGGAACTCTACCTT-3′;GAPDH正向5′-TGACCACAGTCCATGCC-ATCAC-3′,反向5′-GCCTGCTTCACCACCTTC-TTGA-3′。

1.9 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

RIPA裂解液裂解細(xì)胞,PBS沖洗、離心后借助BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳電壓80 V轉(zhuǎn)120 V,采用濕轉(zhuǎn)移法100 V恒壓轉(zhuǎn)膜,時(shí)間為30～60 min,之后采用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗FTO(1∶1000)、KCNJ2(1∶1000),孵育過夜后PBS沖洗,加入對(duì)應(yīng)的二抗IgG(1∶2000)并在室溫條件下孵育1 h,洗膜后行ECL顯影、定影后借助Image J軟件測(cè)定蛋白濃度。

1.10 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)

RIPA裂解緩沖液對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行裂解,之后將FTO抗體、m6A抗體和IgG抗體與A/G瓊脂糖珠在4℃孵育2 h。總RNA與IP緩沖液中的抗體一起孵育,然后洗脫沉淀RNA。采用qRT-PCR進(jìn)行定量分析。

1.11 放線菌素D(Actinomycin D,Act D)測(cè)定KCNJ2 mRNA的穩(wěn)定性

將心肌細(xì)胞接種在96孔板中(每孔1×105個(gè)細(xì)胞)常規(guī)培養(yǎng)。24 h后向培養(yǎng)細(xì)胞中添加2 μg/mL的Act D,并在3、6 h收集細(xì)胞,使用qRT-PCR分析未與Act D結(jié)合的KCNJ2 mRNA水平來判定RNA穩(wěn)定性,該水平與0 h的檢測(cè)水平做標(biāo)準(zhǔn)化。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 七氟醚后處理減輕H/R后心肌細(xì)胞損傷

如圖1A所示,與Control組相比,H/R組細(xì)胞活力下降,而七氟醚組細(xì)胞活力較H/R組升高(均P<0.01)。此外,H/R組細(xì)胞LDH的釋放增加(P<0.01),而七氟醚后處理降低了LDH釋放水平(P<0.05,圖1B)。H/R組的細(xì)胞凋亡率較Control組顯著升高(P<0.01),而七氟醚組凋亡率較H/R組降低(P<0.01,圖1C、1D)。上述結(jié)果表明七氟醚后處理可有效減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組;A:MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;B:LDH釋放量檢測(cè);C～D:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;與Control組比較,**P<0.01;與H/R組比較,#P<0.05 ##P<0.01 圖1 七氟醚后處理提高H/R處理心肌細(xì)胞的存活率并減輕損傷和凋亡Fig.1 Sevoflurane postconditioning improves survival rate of H/R-treated cardiomyocytes,and attenuates cell injury and apoptosis

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

GSE160516中的差異表達(dá)基因如圖2A所示。本研究將重點(diǎn)放在284個(gè)在MIRI中下調(diào)的基因上,對(duì)下調(diào)基因進(jìn)行GO富集分析。在生物過程分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn),KCNJ2富集在3個(gè)心臟相關(guān)通路中,因此選擇KCNJ2進(jìn)行分析(圖2B)。對(duì)H/R組AC16細(xì)胞中KCNJ2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)相對(duì)于Control組,H/R組細(xì)胞KCNJ2的表達(dá)量降低,而七氟醚處理后,經(jīng)過H/R處理的AC16細(xì)胞KCNJ2的表達(dá)增強(qiáng)(均P<0.01)(圖2C、2D)。

1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組;A:GSE160516芯片差異表達(dá)基因火山圖;B:MIRI中下調(diào)基因的GO分析結(jié)果;C:H/R處理的AC16細(xì)胞中KCNJ2 mRNA的表達(dá)情況;D:H/R處理的AC16細(xì)胞中KCNJ2的蛋白表達(dá);與Control組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖2 七氟醚后處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞中KCNJ2表達(dá)的調(diào)節(jié)Fig.2 Regulation of KCNJ2 expression in H/R cardiomyocytes by sevoflurane postconditioning

2.3 敲減KCNJ2抑制七氟醚后處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)于Control組,H/R組細(xì)胞的活力顯著降低,七氟醚處理后H/R細(xì)胞活力增強(qiáng);而相對(duì)于七氟醚+si-NC組,七氟醚+si-KCNJ2組的細(xì)胞活力降低(圖3A)。此外,七氟醚能夠抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LDH釋放和細(xì)胞凋亡,但這一作用也可被轉(zhuǎn)染si-KCNJ2逆轉(zhuǎn)(圖3B、3C)。上述結(jié)果提示敲減KCNJ2能夠抑制七氟醚后處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組,4:七氟醚+si-NC組,5:七氟醚+si-KCNJ2組;A:各組細(xì)胞活力;B:各組細(xì)胞LDH釋放水平;C:各組細(xì)胞凋亡情況;與Control組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01;與七氟醚+si-NC組比較,△P<0.05 △△P<0.01 圖3 敲減KCNJ2對(duì)七氟醚后處理的H/R心肌細(xì)胞的影響Fig.3 Effects of KCNJ2 knockdown on sevoflurane-treated H/R cardiomyocytes

2.4 FTO調(diào)控KCNJ2的表達(dá)

對(duì)KCNJ2在H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的機(jī)制進(jìn)行探討,借助SRAMP網(wǎng)站預(yù)測(cè)KCNJ2的m6A修飾情況,發(fā)現(xiàn)KCNJ2存在多個(gè)高可信度m6A修飾位點(diǎn)(圖4A)。已被證實(shí),FTO的表達(dá)下調(diào)能夠增強(qiáng)其修飾基因的m6A甲基化,進(jìn)而降低其修飾基因的穩(wěn)定性。鑒于KCNJ2在H/R心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)且RPISeq網(wǎng)站分析提示FTO和KCNJ2存在較強(qiáng)結(jié)合分?jǐn)?shù),因此本研究推測(cè)FTO能夠?qū)CNJ2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了FTO和KCNJ2的結(jié)合(圖4B)。進(jìn)一步分析過表達(dá)FTO對(duì)KCNJ2表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,與Vector組比較,過表達(dá)FTO后(oe-FTO組)KCNJ2的m6A甲基化水平降低(P<0.01,圖4C),KCNJ2的穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)量均提高(P<0.01,圖4D、4E),證實(shí)FTO能夠通過減少KCNJ2的m6A修飾進(jìn)而增強(qiáng)其穩(wěn)定性。對(duì)H/R心肌細(xì)胞中m6A和FTO的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,與Control組比較,H/R組m6A水平增加而FTO表達(dá)水平降低,加入七氟醚處理后,m6A水平下降而FTO表達(dá)提高(P<0.01,圖4F、4G)。綜上,七氟醚處理能夠通過影響FTO的表達(dá)水平,進(jìn)而對(duì)KCNJ2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,最終參與H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

A:KCNJ2的m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果;B:RIP檢測(cè)FTO和KCNJ2的結(jié)合;C:過表達(dá)FTO對(duì)KCNJ2和m6A結(jié)合情況的影響;D:過表達(dá)FTO對(duì)KCNJ2 mRNA穩(wěn)定性的影響;E:過表達(dá)FTO對(duì)KCNJ2蛋白表達(dá)的影響;F:各組細(xì)胞m6A水平檢測(cè)結(jié)果,1:Control組,2:H/R組,3:七氟醚組;G:各組細(xì)胞中FTO蛋白表達(dá);Vector:空載體,oe-FTO:FTO過表達(dá)載體;**P<0.01圖4 FTO和KCNJ2的關(guān)系驗(yàn)證Fig.4 Verification of the relationship between FTO and KCNJ2

2.5 敲減FTO能夠抑制七氟醚對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用且該作用可被KCNJ2過表達(dá)挽救

相對(duì)于七氟醚+si-NC組,七氟醚+si-FTO組的KCNJ2表達(dá)下調(diào),細(xì)胞活力降低,LDH釋放量和細(xì)胞凋亡率增加(均P<0.01),提示敲減FTO能夠抑制七氟醚對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。但相對(duì)于七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1組,七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1-KCNJ2組的細(xì)胞活力增強(qiáng),LDH釋放水平和細(xì)胞凋亡率降低(均P<0.05),提示過表達(dá)KCNJ2能夠部分挽救si-FTO對(duì)七氟醚處理的H/R心肌細(xì)胞的影響。見圖5。

3 討論

本研究顯示,在MIRI體外細(xì)胞模型中,七氟醚通過促進(jìn)FTO/KCNJ2的表達(dá),減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,為七氟醚后處理改善MIRI的機(jī)制做出新的解釋。

七氟醚作為吸入類麻醉藥物的一種,近年來其對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用不斷被揭示,如有研究發(fā)現(xiàn)七氟醚對(duì)行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的患者具有心肌保護(hù)作用,且2%七氟醚吸入的抗炎效果最佳[8]。動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí),七氟醚能夠通過AMPK途徑抑制由H/R引起的心肌細(xì)胞凋亡,從而在MIRI大鼠及細(xì)胞模型中發(fā)揮保護(hù)作用[9]。此外,七氟醚還可通過抑制PI3KC3介導(dǎo)的自噬減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[10]。本研究為進(jìn)一步闡明七氟醚對(duì)MIRI的保護(hù)作用機(jī)制,借助MIRI相關(guān)芯片篩選在MIRI中差異表達(dá)的基因,之后在表達(dá)下調(diào)基因中發(fā)現(xiàn)了KCNJ2,且KCNJ2被發(fā)現(xiàn)富集在3個(gè)心臟相關(guān)通路中。以往有研究表明KCNJ2表達(dá)的下調(diào)與心房顫動(dòng)有關(guān)[11]。此外,KCNJ2功能的改變也被證實(shí)與遺傳性心臟猝死綜合征有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于Control組細(xì)胞,H/R組細(xì)胞中KCNJ2的表達(dá)降低,但加入七氟醚后其表達(dá)上調(diào)。此外,敲減KCNJ2能夠抑制七氟醚對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,提示上調(diào)KCNJ2可能對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用,這與Niu等[7]的研究結(jié)論一致。LDH是糖酵解酶的一種,其存在于機(jī)體的所有組織和細(xì)胞中,也是細(xì)胞損傷的一個(gè)重要標(biāo)志物,當(dāng)細(xì)胞損傷或者疾病發(fā)生的時(shí)候往往會(huì)出現(xiàn)LDH釋放水平的升高,其也被常用于心肌梗死、心肌損傷等多種病理情況的監(jiān)測(cè)[13-15]。

1:七氟醚+si-NC組,2:七氟醚+si-FTO組,3:七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1組,4:七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1-KCNJ2組;A:qRT-PCR檢測(cè)各組KCNJ2的表達(dá);B:MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;C:LDH釋放量檢測(cè);D～E:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;F:研究機(jī)制示意圖;與七氟醚+si-NC組比較,**P<0.01;與七氟醚+si-FTO+pcDNA3.1組比較,#P<0.05 ##P<0.01 圖5 過表達(dá)KCNJ2可部分挽救敲減FTO對(duì)七氟醚后處理的H/R心肌細(xì)胞的作用Fig.5 Overexpression of KCNJ2 partially reverses the effects of si-FTO on H/R myocardial cells after sevoflurane treatment

m6A修飾被證實(shí)影響多種疾病的進(jìn)展,FTO是m6A系統(tǒng)中關(guān)鍵的去甲基化酶,當(dāng)前已有研究表明FTO過表達(dá)對(duì)于保護(hù)H/R引起的心肌細(xì)胞損傷具有積極作用,如Shen等[16]發(fā)現(xiàn)FTO過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)MHRT的m6A修飾進(jìn)而抑制H/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。此外,也有研究證實(shí)FTO能幫助維持鈣穩(wěn)態(tài),改善H/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞能量代謝改變[17]。本研究為證實(shí)KCNJ2在H/R心肌細(xì)胞中低表達(dá)是否與m6A修飾有關(guān),借助SRAMP預(yù)測(cè)了其m6A修飾位點(diǎn),結(jié)果顯示其存在多個(gè)m6A修飾位點(diǎn),之后進(jìn)一步借助RPISeq網(wǎng)站推測(cè)KCNJ2和FTO可能直接存在較強(qiáng)作用關(guān)系。鑒于以往研究提示FTO能夠解除其修飾基因的甲基化進(jìn)而增強(qiáng)其修飾基因的穩(wěn)定性[6],我們推測(cè)KCNJ2在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中低表達(dá)或許與FTO表達(dá)下調(diào)有關(guān)。本研究首先通過RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FTO和KCNJ2可以相互結(jié)合,進(jìn)一步研究表明相對(duì)于Control組,H/R心肌細(xì)胞中FTO的表達(dá)被抑制,而加入七氟醚處理后FTO的表達(dá)增加,這也進(jìn)一步提示FTO在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)并且能夠受七氟醚處理的影響。而過表達(dá)FTO后,KCNJ2的m6A修飾減少,KCNJ2的穩(wěn)定性和表達(dá)增強(qiáng);敲減FTO后KCNJ2的表達(dá)降低,進(jìn)一步揭示了FTO對(duì)KCNJ2表達(dá)的調(diào)控作用可能是通過影響其m6A修飾水平而實(shí)現(xiàn)。功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,在七氟醚后處理的H/R心肌細(xì)胞中敲減FTO能夠抑制心肌細(xì)胞活力,增加LDH釋放和凋亡,進(jìn)而加重心肌細(xì)胞損傷;過表達(dá)KCNJ2后,這一情況部分改善,這也進(jìn)一步揭示了FTO/KCNJ2參與七氟醚對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷的作用。

本研究也存在一定局限性,如未進(jìn)一步探討七氟醚調(diào)控FTO/KCNJ2軸參與H/R誘導(dǎo)的心肌損傷中可能影響的信號(hào)通路,未進(jìn)一步做更多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等,這也是我們后續(xù)需完善的方向。綜上所述,本研究揭示了七氟醚后處理能夠通過調(diào)節(jié)FTO/KCNJ2軸進(jìn)而影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,聯(lián)合七氟醚處理以及FTO/KCNJ2軸干預(yù)對(duì)于改善H/R導(dǎo)致的心肌損傷具有重要意義。