不同餌料密度下BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲生殖力和存活力的影響?

劉春辰, 劉雯雯, 劉文婧, 高夢綺, 高澍嘉, 李思琦, 王仁君

(曲阜師范大學(xué)海洋生命學(xué)院, 山東 濟(jì)寧 273165)

多溴聯(lián)苯醚(Poly brominated diphenyl ethers, PBDEs)因阻燃效率高、成本低而成為重要的溴代阻燃劑,普遍存在于人們?nèi)粘Ｓ闷贰⒐I(yè)材料中[1]。但同時(shí),PBDEs也因具有生物蓄積性、持久性和高毒性等典型POPs的特性引起廣泛關(guān)注。目前已經(jīng)在海洋沉積物等環(huán)境介質(zhì)中檢測到大量PBDEs的存在,研究報(bào)道韓國工業(yè)化海灣的PBDEs最高干質(zhì)量濃度為2 253 ng/g,日本沿海為PBDEs為5.2～33 ng/g,東印度洋PBDEs干質(zhì)量濃度為(173±62) pg/g,而在中國沿海沉積物中PBDEs干質(zhì)量濃度為0.004～4 212 ng/g,普遍高于其他國家地區(qū)[2-4]。各個(gè)海區(qū)雖然濃度有差異,但PBDEs組成相似,以BDE-209和BDE-47為主[5]。而且大量生物研究也證明了PBDEs可以富集到海洋浮游動物中,并通過食物鏈向更高營養(yǎng)級轉(zhuǎn)移[6]。Liu等[7]在中國渤海的18個(gè)物種(包括浮游生物、無脊椎動物和魚類)中測定了PBDEs富集水平,其中BDE-47檢出率最高,值為100%,在所有PBDEs同系物中的脂質(zhì)量濃度也最高。相關(guān)的生物毒性研究也多有展開,主要集中于探索PBDEs對魚類的毒性作用,BDE-47已被證明可誘導(dǎo)氧化損傷導(dǎo)致魚類的生殖和代謝抑制[8-10]。浮游動物也被證明可直接受到PBDEs的影響,表現(xiàn)為攝食、游泳、種群動態(tài)(尤其是生殖)等受到抑制[11-12],以及氧化損傷和內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂[13],而氧化損傷引起的卵巢病變被認(rèn)為是PBDEs抑制生殖的主要原因[14]。

舊型溴系阻燃劑的使用受到限制促使替代產(chǎn)品的需求量急劇增加,因而結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面同PBDEs相似的十溴二苯乙烷(DBDPE)已經(jīng)基本替代了PBDEs在各類產(chǎn)品中的應(yīng)用[15],而中國DBDPE的產(chǎn)量更是遠(yuǎn)高于其他國家[16]。環(huán)境調(diào)查也發(fā)現(xiàn)類似趨勢,日本海域沉積物中檢出DBDPE濃度為0.07～0.85 ng/g,韓國高度工業(yè)化海灣沉積物中檢出DBDPE干質(zhì)量濃度為(11.6±17.5) ng/g,中國黃海和東海河口處沉積物中檢出DBDPE干質(zhì)量濃度為0.18～49.9 ng/g,海域表層沉積物中檢出DBDPE的干質(zhì)量濃度為0.04～9.47 ng/g[17-19]。且DBDPE在海洋環(huán)境中的濃度也有趕超PBDEs的趨勢[20-21]。但是對以DBDPE為主的新型溴系阻燃劑在生物暴露風(fēng)險(xiǎn)的進(jìn)一步認(rèn)知都還處于空白狀態(tài)。

褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)是海洋中常見的浮游動物,是眾多污染物進(jìn)入海洋的第一道“生物過濾網(wǎng)”,具有易培養(yǎng)、生殖快、對環(huán)境變化敏感等優(yōu)點(diǎn),是毒理試驗(yàn)中一種較為理想的受試動物[22]。它的生殖力和存活力是掌握浮游動物種群變化的重要指標(biāo),其中產(chǎn)幼率可衡量種群的凈增長量,存活力可表征種群的穩(wěn)定[23]。作為海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的初級消費(fèi)者,褶皺臂尾輪蟲的種群穩(wěn)定關(guān)乎初級生產(chǎn)力的利用率,更影響高營養(yǎng)級的種群發(fā)展[24]。

為填補(bǔ)新型溴系阻燃生物毒性研究的空白,并進(jìn)一步探究新、舊溴系阻燃劑聯(lián)合作用下生物毒性效應(yīng)的變化,進(jìn)而揭示其作用規(guī)律,本研究選擇在海洋環(huán)境中PBDEs的主要同系物BDE-47和其主要替代品DBDPE為脅迫因子,以褶皺臂尾輪蟲為受試動物,分析飽食和饑餓狀態(tài)下輪蟲生殖力和存活力的響應(yīng)特征,為重新全面認(rèn)識溴系阻燃劑的環(huán)境潛在危害提供基礎(chǔ)依據(jù),同時(shí)也為適時(shí)有效的保護(hù)海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用褶皺臂尾輪蟲休眠卵購自浮田生物(浙江寧波),在滅菌海水中孵化,并在實(shí)驗(yàn)前馴化培養(yǎng)至少2周,馴化條件:鹽度為22,溫度為20～25 ℃,pH值為6～9,光照強(qiáng)度為60 mol/(m2·s),且明暗比為12 L∶12 D。馴化過程中,投喂餌料(小球藻(Chlorellavulgaris)),密度保持在1×106cell/mL。實(shí)驗(yàn)所用海水(鹽度約為30)取自青島魯迅公園附近海域,經(jīng)沉淀和0.45濾膜過濾,121.3 ℃滅菌20 min,冷卻后使用。

1.2 脅迫體系設(shè)置

本研究脅迫因子,BDE-47(純度>99.99%,GC級,白色固體粉末)購自美國AccuStandard公司,DBDPE(純度>96.00%,白色固體粉末)購自日本Tokyo Chemical Industry公司,用助溶劑二甲亞砜(DMSO)分別配制成母液,常溫避光下保存。實(shí)驗(yàn)前,用滅菌海水依次稀釋至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度梯度。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在24孔板中進(jìn)行,挑選剛孵化2～3 h、活潑健壯的幼輪蟲為實(shí)驗(yàn)對象,每10只幼蟲放到一個(gè)孔內(nèi)作為一個(gè)樣品,每孔內(nèi)最終實(shí)驗(yàn)體積為1 mL,并進(jìn)行6次重復(fù)。

所有實(shí)驗(yàn)組按餌料投喂的密度不同分為飽食組和饑餓組。飽食組小球藻密度同馴化期保持一致,為1×106cell/mL,饑餓組小球藻密度較低,為0.7×106cell/mL。實(shí)驗(yàn)過程采取半連續(xù)培養(yǎng),每24 h分別更換80%的BDE-47或DBDPE培養(yǎng)液,并重新投喂小球藻,以保證毒性條件和餌料藻含量的穩(wěn)定。

根據(jù)脅迫物質(zhì)加入情況,實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、BDE-47單一作用組、DBDPE單一作用組和等濃度聯(lián)合作用組。BDE-47和DBDPE單一作用組均根據(jù)環(huán)境本底值及預(yù)實(shí)驗(yàn),以環(huán)境中PBDEs濃度上限為低濃度組,并取其10倍和100倍為中、高濃度,由此設(shè)置了3個(gè)濃度梯度:低濃度(Low concentration)5 μg/L、中濃度(Middle concentration)50 μg/L、高濃度(High concentration)500 μg/L。聯(lián)合作用組的3個(gè)濃度梯度設(shè)置同單一作用組濃度梯度設(shè)置一致,并在實(shí)驗(yàn)時(shí)按等濃度同時(shí)加入BDE-47和DBDPE。為方便起見,實(shí)驗(yàn)體系中,BDE-47、DBDPE單一作用和聯(lián)合作用3個(gè)組每組的3個(gè)濃度梯度都標(biāo)記為低濃度(5)、中濃度(50)、高濃度(500)。

實(shí)驗(yàn)過程中,每12 h觀察1次,記錄出現(xiàn)新生幼蟲從開始到結(jié)束的時(shí)間(生殖期)、輪蟲新生幼蟲數(shù)和存活個(gè)體的數(shù)量,并及時(shí)將新生幼蟲和死亡的成蟲移出,直到初始的10只輪蟲全部死亡。通過計(jì)算每12 h產(chǎn)生的后代數(shù)量比存活數(shù)可得其特定年齡產(chǎn)幼率,通過計(jì)算每12 h存活輪蟲數(shù)比初始輪蟲數(shù)可得其特定年齡存活率。進(jìn)而計(jì)算出各個(gè)作用方式下的生殖期和產(chǎn)幼數(shù)的抑制率。

本文采用合用指數(shù)值(Q值)法評價(jià)聯(lián)合毒作用模式[25],根據(jù)公式(1)計(jì)算Q值:Q>1.15代表2種抑制劑的抑制作用存在協(xié)同作用;0.85

Q=EAB/(EA+EB-EAEB)。

(1)

式中:EA、EB分別為2種藥物A和B的總有效率;EAB為合用組總有效率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用數(shù)據(jù)處理軟件IBM SPSS statistics 25進(jìn)行,圖片利用Origin軟件繪制,圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)。相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組與對照組的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 BDE-47和DBDPE單一及聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲的生殖力的影響

無脅迫時(shí),飽食和饑餓培養(yǎng)條件下的空白對照組褶皺臂尾輪蟲的生殖力變化如圖1。飽食情況下,輪蟲的生殖期從36 h開始,至384 h結(jié)束,產(chǎn)幼在初期快速增加并在60 h進(jìn)入生殖高峰期,達(dá)到產(chǎn)幼的生殖峰平均值(2.72 ind.),持續(xù)到132 h,隨后產(chǎn)幼數(shù)量減少(見圖1(A)),總產(chǎn)幼平均數(shù)為20.06 ind.(見圖1(C))。饑餓情況下,輪蟲的生殖期同樣是從36 h開始,但結(jié)束提前至192 h,產(chǎn)幼初期也為快速增長,60 h達(dá)到產(chǎn)幼的高峰期,但84 h才達(dá)到生殖峰平均值(2.26 ind.),隨后結(jié)束產(chǎn)幼高峰期(見圖1(B)),總產(chǎn)幼平均數(shù)為13.69 ind.(見圖1(C))。饑餓培養(yǎng)下的輪蟲較飽食狀態(tài)生殖期縮短,生殖峰值降低,總產(chǎn)幼數(shù)顯著低于飽食對照組(P<0.05),表現(xiàn)為生殖力低于飽食培養(yǎng)下的輪蟲。

((A)飽食組特定年齡產(chǎn)幼率;(B)饑餓組特定年齡產(chǎn)幼率;(C)飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù)。P值為相同營養(yǎng)條件對照組比較的結(jié)果, :P<0.05. (A) Satiation control group; (B) Starvation control group; (C) The total larval number of satiation control group and starvation control group. The P value was the result of comparison with the control group under the same nutritional conditions. :P<0.05. )圖1 不同餌料藻密度下褶皺臂尾輪蟲的生殖力的變化Fig.1 Under different feed concentrations, the change of B. plicatilis fecundity

BDE-47和DBDPE單一作用下,褶皺臂尾輪蟲的生殖力變化如圖2。飽食培養(yǎng)下,BDE-47單一作用組輪蟲生殖期的起始時(shí)間與對照組基本相同,但生殖期的結(jié)束時(shí)間明顯受到影響,低濃度組(5 μg/L)提前至288 h,中濃度組(50 μg/L)提前至264 h,而高濃度組(500 μg/L)在168 h就結(jié)束(見圖2(A))。相比于對照組,BDE-47單一作用組生殖期在低濃度受到顯著抑制(P<0.05),中、高濃度受到極顯著抑制(P<0.01,見表1)。生殖峰值也推遲到96 h出現(xiàn),并隨濃度升高逐漸降低,低濃度時(shí)的生殖峰平均值為2.25 ind.,中濃度時(shí)的生殖峰平均值為1.94 ind.,高濃度時(shí)的生殖峰平均值為1.89 ind.。饑餓組的生殖期結(jié)束時(shí)間較飽食組整體提前:低濃度204 h,中濃度180 h,高濃度168 h(見圖2(B))。但和饑餓組的空白對照相比,生殖期沒有受到顯著抑制(P>0.05,見表1)。但生殖峰平均值卻在低濃度時(shí)表現(xiàn)出興奮效應(yīng),為2.53 ind.,中、高濃度受到抑制?？傮w產(chǎn)幼數(shù)結(jié)果表明隨著濃度的升高,產(chǎn)幼數(shù)量先升高后下降,且雖然飽食組產(chǎn)幼數(shù)量整體高于饑餓組,但和對照組相比飽食組受抑制更明顯,在高濃度組受到極顯著抑制(P<0.01,見圖2(C))。DBDPE表現(xiàn)出相反的變化趨勢(見圖2(D)、(E)),隨著濃度的升高輪蟲的生殖期延長,飽食培養(yǎng)條件下,低濃度為240 h,中濃度為252 h,高濃度為288 h;饑餓培養(yǎng)下,低濃度為168 h,中濃度為180 h,高濃度為192 h,但無論是生殖期還是峰值都小于對照組。DBDPE作用下,總體產(chǎn)幼數(shù)結(jié)果同樣隨著濃度的升高,產(chǎn)幼數(shù)量先升高后下降(見圖2(F)),但在低濃度時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制,而在高濃度時(shí)表現(xiàn)出抑制較弱,但均未呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。

表1 BDE-47和DBDPE單一和聯(lián)合作用下,輪蟲生殖期和總產(chǎn)幼數(shù)抑制情況Table 1 The inhibition of rotifer reproductive stage and total larvae number under the single and combined action of BDE-47 and DBDPE

(5,50,500分別為BDE-47或DBDPE濃度5,50和500 μg/L。(A) BDE-47作用于飽食組;(B) BDE-47作用于饑餓組;(C) BDE-47作用下飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù);(D) DBDPE作用于飽食組;(E) DBDPE作用于饑餓組;(F) DBDPE作用下飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù)。P值為和相同營養(yǎng)條件對照組比較的結(jié)果,:P<0.05,:P<0.01。5, 50, 500 refer to BDE-47 or DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L, respectively. (A) BDE-47 on satiation group; (B) BDE-47 on starvation group; (C) BDE-47 on the total larval number of satiation group and starvation group; (D) DBDPE on satiation group; (E) DBDPE on starvation group; (F) DBDPE on the total larval number of satiation group and starvation group. The P value was the result of comparison with the control group under the same nutritional conditions, ,: P<0.05,: P<0.01.)圖2 不同餌料藻密度下,BDE-47和DBDPE單一作用對褶皺臂尾輪蟲的生殖力的影響Fig.2 Under different feed concentrations, effects of single action of BDE-47 and DBDPE on fecundity of B. plicatilis

等濃度BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用組對輪蟲生殖力的影響如圖3。飽食培養(yǎng)時(shí),低、中濃度組的輪蟲均在240 h就結(jié)束生殖期,高濃度受抑制最嚴(yán)重,在144 h結(jié)束(見圖3(A))。饑餓培養(yǎng)時(shí),低、中、高濃度的生殖期結(jié)束都較對照組提前(見圖3(B)),且中、高濃度生殖期分別呈現(xiàn)顯著(P<0.05)和極顯著抑制(P<0.01,見表1)。低、中濃度組的生殖峰同樣在84 h,高濃度組提前至60 h,且峰值也受到一定程度的抑制?？偖a(chǎn)幼數(shù)變化呈現(xiàn)隨濃度升高,先升高后降低,低濃度組和高濃度組都呈現(xiàn)極顯著抑制(P<0.01),在高濃度組受抑制最嚴(yán)重,總產(chǎn)幼平均數(shù)為10.01 ind.(見圖3(C))?？偖a(chǎn)幼數(shù)始終低于高密度組,變化趨勢也為先升高后降低,在高濃度顯著低于饑餓對照組(P<0.01)。

(5,50,500分別為BDE-47和DBDPE濃度5,50和500 μg/L。(A) 聯(lián)合作用于飽食組;(B) 聯(lián)合作用于饑餓組;(C) 聯(lián)合作用下飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù)。P值為和相同營養(yǎng)條件對照組比較的結(jié)果,:P<0.05,:P<0.01。5, 50, 500 refer to BDE-47 and DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L, respectively. (A) Combined action on satiation group; (B) Combined action on starvation group; (C) Combined action on the total larval number of satiation group and starvation group. The P value was the result of comparison with the control group under the same nutritional conditions, : P<0.05,: P<0.01.)圖3 不同餌料藻密度下,BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲的生殖力的影響Fig.3 Under different feed concentrations, effects of combined action of BDE-47 and DBDPE on fecundity of B. plicatilis

2.2 BDE-47和DBDPE單一及聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲的存活力的影響。

BDE-47和DBDPE單一和聯(lián)合作用對輪蟲的存活情況影響如圖4所示。飽食培養(yǎng)的對照組從168 h開始出現(xiàn)死亡個(gè)體,在408 h初始輪蟲個(gè)體都死亡(見圖4(A)),饑餓對照組則從48 h就出現(xiàn)死亡個(gè)體,192 h全部輪蟲死亡(見圖4(B))。飽食培養(yǎng)時(shí),BDE-47單一作用低濃度組24 h就出現(xiàn)死亡個(gè)體,336 h全部個(gè)體。中濃度和高濃度出現(xiàn)死亡個(gè)體時(shí)間晚于低濃度組,但高濃度組大量死亡,特定年齡存活率曲線陡于其他組,192 h全部個(gè)體死亡,存活時(shí)間減少(見圖4(B))。而饑餓時(shí),輪蟲對BDE-47單一作用響應(yīng)趨勢類似(見圖4(F)),高濃度組存活時(shí)間最短(192 h)。DBDPE單一作用組在飽食培養(yǎng)組時(shí)(見圖4(C)),中濃度組出現(xiàn)死亡個(gè)體最遲(168 h),但高濃度組存活時(shí)間最長(360 h)。而DBDPE單一作用于饑餓培養(yǎng)組時(shí)(見圖4(G)),則是高濃度組出現(xiàn)死亡個(gè)體最遲(120 h),且存活時(shí)間最長(216 h)。聯(lián)合作用于飽食培養(yǎng)組時(shí),在中、高濃度組最早出現(xiàn)死亡個(gè)體(48 h),且存活時(shí)間受到顯著抑制,其中高濃度組受抑制最嚴(yán)重,168 h全部死亡(見圖4(D))。而當(dāng)聯(lián)合作用于饑餓培養(yǎng)組時(shí),高濃度組存活時(shí)間相同為168 h,低、中濃度組則呈現(xiàn)受抑制更明顯,均為192 h(見圖4(H))。

( (A) 飽食對照組;(B) BDE-47作用于飽食組;(C) DBDPE作用于飽食組;(D) 聯(lián)合作用于飽食組;(E) 饑餓對照組;(F) BDE-47作用于饑餓組;(G) DBDPE作用于饑餓組;(H) 聯(lián)合作用于饑餓組。(B)、(F) 中,5,50,500為BDE-47濃度5,50和500 μg/L;(C)、(G) 中,為DBDPE濃度5,50和500 μg/L;(D)、(H) 中,為BDE-47和DBDPE濃度5,50和500 μg/L。(A) Satiation control group; (B) BDE-47 on satiation group; (C) DBDPE on satiation group; (D) Combined action on satiation group; (E) Starvation control group; (F) BDE-47 on starvation group; (G) DBDPE on starvation group;(H) Combined action on starvation group. In (B) and (F) , 5,50,500 refer to BDE-47concentration 5, 50 and 500 μg/L; in (C) and (G), refer to DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L; in (D) and (H), BDE-47 and DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L.)圖4 不同餌料藻密度下,BDE-47和DBDPE單一及聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲特定年齡存活率的影響Fig.4 Effects of single and combined action of BDE-47 and DBDPE on survival of B. plicatilis under different feed concentrations

3 討論

從20世紀(jì)70年代起,PBDEs作為阻燃劑中的主力軍一直被大量生產(chǎn)并應(yīng)用,其主要同系物BDE-47也成為海洋環(huán)境中的主要污染物之一。而隨著PBDEs的禁用,以DBDPE為代表的新型阻燃劑如今在應(yīng)用方面已經(jīng)取代了PBDEs的地位,并逐漸向環(huán)境中釋放,形成更加多樣的海洋環(huán)境,并造成更加復(fù)雜的海洋生物暴露風(fēng)險(xiǎn)。本研究以海洋的第一道防線-浮游動物褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)為對象,選取BDE-47和DBDPE為舊型和新型溴系阻燃劑代表,通過研究生殖力和存活力的毒性效應(yīng)變化,探究BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下毒性效應(yīng)變化規(guī)律。

從生殖力結(jié)果看,BDE-47或DBDPE都可以抑制褶皺臂尾輪蟲的生殖期持續(xù)時(shí)間、生殖峰值及總產(chǎn)幼率,兩者聯(lián)合作用時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用,而餌料藻的減少雖然在總體上抑制了生殖力,但在一定程度上也減弱了BDE-47和DBDPE的抑制作用。BDE-47已被證明可以通過誘導(dǎo)ROS含量增加,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,進(jìn)而降低輪蟲的生殖力[26]。DCF-DA熒光探針實(shí)驗(yàn)也顯示輪蟲卵巢中的ROS遠(yuǎn)高于其他器官,同時(shí)伴有氧化損傷現(xiàn)象[14]。這是由于卵巢中脂肪含量豐富,易成為脂溶性BDE-47富集的靶器官。作為一種新興污染物,DBDPE的靶組織和主要毒性尚不清楚,但有少量研究支持DBDPE主要存在于腎臟和卵巢中[27]。在特定組織中的靶向積累會造成直接接觸并導(dǎo)致相應(yīng)的生殖毒性,大鼠實(shí)驗(yàn)證明,DBDPE可通過誘導(dǎo)大鼠性腺端粒功能障礙及相關(guān)細(xì)胞衰老和凋亡[28-29]。

已有研究證明,DBDPE對水蚤(Daphnia)有劇毒,EC50值為19 μg/L,且DBDPE降低了暴露的斑馬魚卵的孵化率,并顯著提高了孵化幼蟲的死亡率[30]。同時(shí)對BDE-47研究也發(fā)現(xiàn),其對水蚤的EC50值為0.058 mg/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DBDPE,表現(xiàn)為更高的生物毒性[31]。Feng等的研究也證明BDE-209具有比DBDPE更高的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)能力,表現(xiàn)為抗氧化酶活性顯著抑制和谷胱甘肽還原水平降低,并指示脂質(zhì)過氧化水平丙二醛含量升高。而BDE-209作為BDE-47同系物,其毒性遠(yuǎn)小于BDE-47,這也間接證明了BDE-47毒性大于DBDPE[32]。通過本文對B.plicatilis的生殖期研究發(fā)現(xiàn),除飽食培養(yǎng)下的高濃度聯(lián)合作用組,所有組都可在36 h內(nèi)產(chǎn)生新的幼蟲,但是各組生殖期結(jié)束時(shí)間有明顯差異,導(dǎo)致不同組的生殖期持續(xù)時(shí)間差異較大(見表1)。BDE-47單一作用時(shí),隨濃度升高,生殖期持續(xù)時(shí)間逐漸受到抑制,DBDPE單一作用組則隨濃度升高生殖期持續(xù)時(shí)間逐漸升高,表現(xiàn)出一定的興奮效應(yīng),且高濃度DBDPE單一作用的生殖期持續(xù)時(shí)間較BDE-47單一作用的生殖期持續(xù)時(shí)間長,表明對于生殖期等濃度的DBDPE的毒性弱于BDE-47。本文結(jié)果同以往研究結(jié)果一致,DBDPE誘導(dǎo)的生物毒性弱于BDE-47。

二者聯(lián)合作用于輪蟲生殖力相關(guān)指標(biāo)的抑制趨勢和BDE-47單一作用類似,并呈現(xiàn)更強(qiáng)的抑制作用,聯(lián)合作用的飽食組生殖期僅為96 h,饑餓組為108 h。BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下,輪蟲生殖期作用模式如表2所示。在飽食時(shí),低、中濃度BDE-47和DBDPE兩者聯(lián)合作用時(shí)表現(xiàn)為拮抗作用,在高濃度時(shí)表現(xiàn)為相加作用。而在饑餓時(shí),3個(gè)濃度均表現(xiàn)為協(xié)同作用。推測首先是因?yàn)轱柺撑囵B(yǎng)時(shí),充足的食物供給為輪蟲提供充足的物質(zhì)保障,進(jìn)而產(chǎn)生足夠的抗性物質(zhì)和酶。研究證明對于長期饑餓的鱸魚(Dicentrarchuslabrax),重新喂養(yǎng)后會大量增加其體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性,并增加Hsp 90等抗性物質(zhì)含量,使其生物抗性增加[33]。Zengin等[34]的研究也證明喂食的虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)體內(nèi)抗氧化防御相關(guān)的物質(zhì)含量普遍高于饑餓狀態(tài)的黑魚,涉及的抗氧化物質(zhì)包括谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)等抗氧化劑,以及SOD、CAT、谷氨酸過氧化物酶(GSHpx)、谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化酶。而隨著濃度升高,飽食組BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用由拮抗作用轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用,因?yàn)橥饨琊D料藻密度不變的情況下,輪蟲自身攝食能力受到抑制。研究證明BDE-47可以導(dǎo)致輪蟲濾食率和攝食率的減少,并誘導(dǎo)其消化酶活性降低[35]。同時(shí)DBDPE作為PBDEs的替代品,具有相似的理化性質(zhì),因此在生物體內(nèi)應(yīng)對這2種物質(zhì)的生理保護(hù)機(jī)制是共享的,因此BDE-47和DBDPE以非致死性濃度同時(shí)作用時(shí),一種脅迫因子刺激增強(qiáng)生物體對另一種脅迫因子的耐受性,既交叉耐受性[36-37]。并且相關(guān)研究也證明,一定程度上,鹽度脅迫強(qiáng)度的增加會使昆蟲種群表現(xiàn)出更強(qiáng)的交叉耐受性[38]。大型水蚤可以通過誘導(dǎo)體內(nèi)金屬硫蛋白和Hsp70含量的提高對Cd和熱脅迫產(chǎn)生交叉耐受性,并且隨著Cd的濃度升高,金屬球蛋白的表達(dá)量也上調(diào),呈現(xiàn)更強(qiáng)的耐受性[39]。而雖然饑餓組生殖期普遍比飽食組短,但同對照組相比,飽食組呈現(xiàn)更高強(qiáng)度的抑制,進(jìn)而導(dǎo)致交叉耐受性響應(yīng)更強(qiáng),表現(xiàn)出拮抗作用。飽食培養(yǎng)下的輪蟲受到PBDE的相對抑制更強(qiáng)這可能是由于高密度的餌料藻會導(dǎo)致輪蟲在攝食過程中伴隨性攝入更多的毒物,進(jìn)而受到的脅迫更強(qiáng),而饑餓受食物限制,攝入毒物也較少。因此飽食培養(yǎng)時(shí),輪蟲可能受到的外源脅迫更強(qiáng),體現(xiàn)出生殖期的相對抑制率更高,而同時(shí)充足的食物供給又保障了輪蟲抗氧化系統(tǒng)的活躍,進(jìn)而使聯(lián)合作用表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)。

表2 BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下,輪蟲生殖期和總產(chǎn)幼數(shù)作用模式Table 2 The action mode of rotifer reproductive stage and total larvae number under combined action of BDE-47 and DBDPE

在饑餓培養(yǎng)時(shí),輪蟲生殖期和對照組相比的相對抑制較低(見表1),除了低攝食可能導(dǎo)致的污染物低生物富集,還可能因?yàn)轲囸I在一定程度上增加生物的抗性。因?yàn)轲囸I可以使生物產(chǎn)生一定程度的氧化應(yīng)激,進(jìn)而更及時(shí)的應(yīng)對外源毒物的脅迫。而飽食雖然可以保障抗氧化物質(zhì)原料的供給,但抗氧化系統(tǒng)初始活躍度低,導(dǎo)致生物響應(yīng)遲緩。研究證明暴露于急性Cu脅迫時(shí),高日糧魚的敏感性是低日糧魚的2倍,減少食物攝入量可以降低急性Cu暴露的影響[40]。Higashimoto等研究證明了在連續(xù)禁食期間小鼠肝臟金屬硫蛋白(MT)的顯著增加,這可能是抗性增加的原因之一[41]。同時(shí),在饑餓培養(yǎng)條件下,雖然輪蟲保持氧化應(yīng)激的戰(zhàn)備狀態(tài),但是調(diào)動需要大量抗性物質(zhì)積累的交叉耐受性能力弱,進(jìn)而表現(xiàn)出聯(lián)合作用時(shí)出現(xiàn)協(xié)同作用。

除生殖期外,生殖力的另一指標(biāo)總產(chǎn)幼數(shù)表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律,但整體敏感度弱于生殖期,表明輪蟲受脅迫時(shí)傾向于短時(shí)間大量產(chǎn)卵。有研究證明BDE-47雖然會抑制褶皺臂尾輪蟲種群的密度,降低其環(huán)境容納量,但在增長期可以在一定程度上提高輪蟲種群的最大瞬時(shí)增長率[42]。饑餓培養(yǎng)時(shí),輪蟲的總產(chǎn)幼數(shù)整體較低,但單一或聯(lián)合作用組的抑制率要低于同條件飽食培養(yǎng)組的輪蟲。BDE-47在總產(chǎn)幼數(shù)方面抑制率在低、中濃度引起的興奮效應(yīng)不盡相同,但在高濃度時(shí)的抑制率高于DBDPE的抑制率,同生殖期結(jié)果相一致,同樣可能受攝食行為的調(diào)控。通過比較表2中的總產(chǎn)幼的Q值,在飽食時(shí),BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下總產(chǎn)幼數(shù)同生殖期一致,在低、中濃度組均表現(xiàn)為拮抗作用,在高濃度組表現(xiàn)為協(xié)同作用。

從存活力結(jié)果看,飽食培養(yǎng)下的輪蟲雖然比饑餓培養(yǎng)下的輪蟲存活期更長,但同對照組相比,相對受抑制程度更強(qiáng),小密度餌料培養(yǎng)時(shí),除了聯(lián)合作用高濃度組,其他組基本沒有受到明顯抑制。這是因?yàn)橐环矫嫜芯孔C明饑餓會加速生物的衰老,表現(xiàn)出免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)活力的迅速衰退[43],進(jìn)而減少了輪蟲的存活時(shí)間。而另一方面生物的存活力主要受基礎(chǔ)代謝控制,而輪蟲作為孤雌生殖個(gè)體,種群基本全為雌性個(gè)體,體內(nèi)往往為了生殖而有更豐富的物質(zhì)儲備,因此應(yīng)對外源脅迫的能力更強(qiáng)[44]。從存活期抑制情況看,BDE-47毒性同樣強(qiáng)于DBDPE,聯(lián)合作用時(shí)表現(xiàn)毒性增加(見表3)。并且存活的整體抑制程度也弱于生殖力,這是因?yàn)橥饕芑A(chǔ)代謝控制的存活不同,輪蟲的生殖力既受基礎(chǔ)代謝控制,還需足夠的外源物質(zhì)補(bǔ)充,即攝食情況控制,因此敏感程度更高[45]。且生物的生殖器官往往含有豐富的脂質(zhì),成為脂溶性毒物的重要靶標(biāo),更容易受到脅迫。對暴露于4種多環(huán)芳烴的海膽(Evechinuschloroticus)研究表明,在性腺組織中發(fā)現(xiàn)增加蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷會導(dǎo)致產(chǎn)卵率下降[46]。Xu等的研究也證明了氨脅迫下,萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)生殖所需物質(zhì)供給不足,產(chǎn)生后代數(shù)目減少,種群增長受到限制[47]。BDE-47和DBDPE聯(lián)合對輪蟲作用模式如表4所示,飽食培養(yǎng)時(shí)除高濃度組為相加作用,低、中濃度組均表現(xiàn)為拮抗作用;饑餓培養(yǎng)時(shí),均表現(xiàn)為協(xié)同作用,總產(chǎn)幼數(shù)同生殖期結(jié)果一致。

表3 BDE-47和DBDPE單一和聯(lián)合作用下,輪蟲存活期抑制情況Table 3 The inhibition of rotifer survival period under the single and combined action of BDE-47 and DBDPE

表4 BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下,輪蟲存活期作用模式Table 4 The action mode of rotifer survival period under combined action of BDE-47 and DBDPE

4 結(jié)語

BDE-47和DBDPE的單一作用都顯著影響褶皺臂尾輪蟲的生殖力和存活力,具體表現(xiàn)在對總產(chǎn)幼數(shù)的減少,生殖期和存活時(shí)間的縮短,BDE-47單一作用呈現(xiàn)出比DBDPE更強(qiáng)的生物毒性。其中主要受攝食行為調(diào)控的生殖期是較敏感指標(biāo)。BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用抑制效應(yīng)在輪蟲饑餓時(shí)表現(xiàn)為對生殖力和存活力的協(xié)同作用,而在輪蟲飽食時(shí),在低、中濃度表現(xiàn)出對生殖力和存活力的拮抗作用,而在高濃度組基本表現(xiàn)為相加作用。本研究表明充足的食物供給可使生物表現(xiàn)出交叉耐受性,減弱BDE-47和DBDPE同時(shí)作用時(shí)的生物毒性。