不同餌料密度下BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲生殖力和存活力的影響?

劉春辰, 劉雯雯, 劉文婧, 高夢綺, 高澍嘉, 李思琦, 王仁君

(曲阜師范大學海洋生命學院, 山東 濟寧 273165)

多溴聯(lián)苯醚(Poly brominated diphenyl ethers, PBDEs)因阻燃效率高、成本低而成為重要的溴代阻燃劑,普遍存在于人們?nèi)粘Ｓ闷?、工業(yè)材料中[1]。但同時,PBDEs也因具有生物蓄積性、持久性和高毒性等典型POPs的特性引起廣泛關(guān)注。目前已經(jīng)在海洋沉積物等環(huán)境介質(zhì)中檢測到大量PBDEs的存在,研究報道韓國工業(yè)化海灣的PBDEs最高干質(zhì)量濃度為2 253 ng/g,日本沿海為PBDEs為5.2～33 ng/g,東印度洋PBDEs干質(zhì)量濃度為(173±62) pg/g,而在中國沿海沉積物中PBDEs干質(zhì)量濃度為0.004～4 212 ng/g,普遍高于其他國家地區(qū)[2-4]。各個海區(qū)雖然濃度有差異,但PBDEs組成相似,以BDE-209和BDE-47為主[5]。而且大量生物研究也證明了PBDEs可以富集到海洋浮游動物中,并通過食物鏈向更高營養(yǎng)級轉(zhuǎn)移[6]。Liu等[7]在中國渤海的18個物種(包括浮游生物、無脊椎動物和魚類)中測定了PBDEs富集水平,其中BDE-47檢出率最高,值為100%,在所有PBDEs同系物中的脂質(zhì)量濃度也最高。相關(guān)的生物毒性研究也多有展開,主要集中于探索PBDEs對魚類的毒性作用,BDE-47已被證明可誘導氧化損傷導致魚類的生殖和代謝抑制[8-10]。浮游動物也被證明可直接受到PBDEs的影響,表現(xiàn)為攝食、游泳、種群動態(tài)(尤其是生殖)等受到抑制[11-12],以及氧化損傷和內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂[13],而氧化損傷引起的卵巢病變被認為是PBDEs抑制生殖的主要原因[14]。

舊型溴系阻燃劑的使用受到限制促使替代產(chǎn)品的需求量急劇增加,因而結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面同PBDEs相似的十溴二苯乙烷(DBDPE)已經(jīng)基本替代了PBDEs在各類產(chǎn)品中的應用[15],而中國DBDPE的產(chǎn)量更是遠高于其他國家[16]。環(huán)境調(diào)查也發(fā)現(xiàn)類似趨勢,日本海域沉積物中檢出DBDPE濃度為0.07～0.85 ng/g,韓國高度工業(yè)化海灣沉積物中檢出DBDPE干質(zhì)量濃度為(11.6±17.5) ng/g,中國黃海和東海河口處沉積物中檢出DBDPE干質(zhì)量濃度為0.18～49.9 ng/g,海域表層沉積物中檢出DBDPE的干質(zhì)量濃度為0.04～9.47 ng/g[17-19]。且DBDPE在海洋環(huán)境中的濃度也有趕超PBDEs的趨勢[20-21]。但是對以DBDPE為主的新型溴系阻燃劑在生物暴露風險的進一步認知都還處于空白狀態(tài)。

褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)是海洋中常見的浮游動物,是眾多污染物進入海洋的第一道“生物過濾網(wǎng)”,具有易培養(yǎng)、生殖快、對環(huán)境變化敏感等優(yōu)點,是毒理試驗中一種較為理想的受試動物[22]。它的生殖力和存活力是掌握浮游動物種群變化的重要指標,其中產(chǎn)幼率可衡量種群的凈增長量,存活力可表征種群的穩(wěn)定[23]。作為海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的初級消費者,褶皺臂尾輪蟲的種群穩(wěn)定關(guān)乎初級生產(chǎn)力的利用率,更影響高營養(yǎng)級的種群發(fā)展[24]。

為填補新型溴系阻燃生物毒性研究的空白,并進一步探究新、舊溴系阻燃劑聯(lián)合作用下生物毒性效應的變化,進而揭示其作用規(guī)律,本研究選擇在海洋環(huán)境中PBDEs的主要同系物BDE-47和其主要替代品DBDPE為脅迫因子,以褶皺臂尾輪蟲為受試動物,分析飽食和饑餓狀態(tài)下輪蟲生殖力和存活力的響應特征,為重新全面認識溴系阻燃劑的環(huán)境潛在危害提供基礎依據(jù),同時也為適時有效的保護海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物培養(yǎng)

實驗用褶皺臂尾輪蟲休眠卵購自浮田生物(浙江寧波),在滅菌海水中孵化,并在實驗前馴化培養(yǎng)至少2周,馴化條件:鹽度為22,溫度為20～25 ℃,pH值為6～9,光照強度為60 mol/(m2·s),且明暗比為12 L∶12 D。馴化過程中,投喂餌料(小球藻(Chlorellavulgaris)),密度保持在1×106cell/mL。實驗所用海水(鹽度約為30)取自青島魯迅公園附近海域,經(jīng)沉淀和0.45濾膜過濾,121.3 ℃滅菌20 min,冷卻后使用。

1.2 脅迫體系設置

本研究脅迫因子,BDE-47(純度>99.99%,GC級,白色固體粉末)購自美國AccuStandard公司,DBDPE(純度>96.00%,白色固體粉末)購自日本Tokyo Chemical Industry公司,用助溶劑二甲亞砜(DMSO)分別配制成母液,常溫避光下保存。實驗前,用滅菌海水依次稀釋至實驗設定的濃度梯度。

1.3 實驗設計

試驗在24孔板中進行,挑選剛孵化2～3 h、活潑健壯的幼輪蟲為實驗對象,每10只幼蟲放到一個孔內(nèi)作為一個樣品,每孔內(nèi)最終實驗體積為1 mL,并進行6次重復。

所有實驗組按餌料投喂的密度不同分為飽食組和饑餓組。飽食組小球藻密度同馴化期保持一致,為1×106cell/mL,饑餓組小球藻密度較低,為0.7×106cell/mL。實驗過程采取半連續(xù)培養(yǎng),每24 h分別更換80%的BDE-47或DBDPE培養(yǎng)液,并重新投喂小球藻,以保證毒性條件和餌料藻含量的穩(wěn)定。

根據(jù)脅迫物質(zhì)加入情況,實驗分為空白對照組、BDE-47單一作用組、DBDPE單一作用組和等濃度聯(lián)合作用組。BDE-47和DBDPE單一作用組均根據(jù)環(huán)境本底值及預實驗,以環(huán)境中PBDEs濃度上限為低濃度組,并取其10倍和100倍為中、高濃度,由此設置了3個濃度梯度:低濃度(Low concentration)5 μg/L、中濃度(Middle concentration)50 μg/L、高濃度(High concentration)500 μg/L。聯(lián)合作用組的3個濃度梯度設置同單一作用組濃度梯度設置一致,并在實驗時按等濃度同時加入BDE-47和DBDPE。為方便起見,實驗體系中,BDE-47、DBDPE單一作用和聯(lián)合作用3個組每組的3個濃度梯度都標記為低濃度(5)、中濃度(50)、高濃度(500)。

實驗過程中,每12 h觀察1次,記錄出現(xiàn)新生幼蟲從開始到結(jié)束的時間(生殖期)、輪蟲新生幼蟲數(shù)和存活個體的數(shù)量,并及時將新生幼蟲和死亡的成蟲移出,直到初始的10只輪蟲全部死亡。通過計算每12 h產(chǎn)生的后代數(shù)量比存活數(shù)可得其特定年齡產(chǎn)幼率,通過計算每12 h存活輪蟲數(shù)比初始輪蟲數(shù)可得其特定年齡存活率。進而計算出各個作用方式下的生殖期和產(chǎn)幼數(shù)的抑制率。

本文采用合用指數(shù)值(Q值)法評價聯(lián)合毒作用模式[25],根據(jù)公式(1)計算Q值:Q>1.15代表2種抑制劑的抑制作用存在協(xié)同作用;0.85

Q=EAB/(EA+EB-EAEB)。

(1)

式中:EA、EB分別為2種藥物A和B的總有效率;EAB為合用組總有效率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析應用數(shù)據(jù)處理軟件IBM SPSS statistics 25進行,圖片利用Origin軟件繪制,圖中數(shù)據(jù)點為平均值±標準誤(mean±SE)。相應的實驗組與對照組的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 BDE-47和DBDPE單一及聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲的生殖力的影響

無脅迫時,飽食和饑餓培養(yǎng)條件下的空白對照組褶皺臂尾輪蟲的生殖力變化如圖1。飽食情況下,輪蟲的生殖期從36 h開始,至384 h結(jié)束,產(chǎn)幼在初期快速增加并在60 h進入生殖高峰期,達到產(chǎn)幼的生殖峰平均值(2.72 ind.),持續(xù)到132 h,隨后產(chǎn)幼數(shù)量減少(見圖1(A)),總產(chǎn)幼平均數(shù)為20.06 ind.(見圖1(C))。饑餓情況下,輪蟲的生殖期同樣是從36 h開始,但結(jié)束提前至192 h,產(chǎn)幼初期也為快速增長,60 h達到產(chǎn)幼的高峰期,但84 h才達到生殖峰平均值(2.26 ind.),隨后結(jié)束產(chǎn)幼高峰期(見圖1(B)),總產(chǎn)幼平均數(shù)為13.69 ind.(見圖1(C))。饑餓培養(yǎng)下的輪蟲較飽食狀態(tài)生殖期縮短,生殖峰值降低,總產(chǎn)幼數(shù)顯著低于飽食對照組(P<0.05),表現(xiàn)為生殖力低于飽食培養(yǎng)下的輪蟲。

((A)飽食組特定年齡產(chǎn)幼率;(B)饑餓組特定年齡產(chǎn)幼率;(C)飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù)。P值為相同營養(yǎng)條件對照組比較的結(jié)果, :P<0.05. (A) Satiation control group; (B) Starvation control group; (C) The total larval number of satiation control group and starvation control group. The P value was the result of comparison with the control group under the same nutritional conditions. :P<0.05. )圖1 不同餌料藻密度下褶皺臂尾輪蟲的生殖力的變化Fig.1 Under different feed concentrations, the change of B. plicatilis fecundity

BDE-47和DBDPE單一作用下,褶皺臂尾輪蟲的生殖力變化如圖2。飽食培養(yǎng)下,BDE-47單一作用組輪蟲生殖期的起始時間與對照組基本相同,但生殖期的結(jié)束時間明顯受到影響,低濃度組(5 μg/L)提前至288 h,中濃度組(50 μg/L)提前至264 h,而高濃度組(500 μg/L)在168 h就結(jié)束(見圖2(A))。相比于對照組,BDE-47單一作用組生殖期在低濃度受到顯著抑制(P<0.05),中、高濃度受到極顯著抑制(P<0.01,見表1)。生殖峰值也推遲到96 h出現(xiàn),并隨濃度升高逐漸降低,低濃度時的生殖峰平均值為2.25 ind.,中濃度時的生殖峰平均值為1.94 ind.,高濃度時的生殖峰平均值為1.89 ind.。饑餓組的生殖期結(jié)束時間較飽食組整體提前:低濃度204 h,中濃度180 h,高濃度168 h(見圖2(B))。但和饑餓組的空白對照相比,生殖期沒有受到顯著抑制(P>0.05,見表1)。但生殖峰平均值卻在低濃度時表現(xiàn)出興奮效應,為2.53 ind.,中、高濃度受到抑制?？傮w產(chǎn)幼數(shù)結(jié)果表明隨著濃度的升高,產(chǎn)幼數(shù)量先升高后下降,且雖然飽食組產(chǎn)幼數(shù)量整體高于饑餓組,但和對照組相比飽食組受抑制更明顯,在高濃度組受到極顯著抑制(P<0.01,見圖2(C))。DBDPE表現(xiàn)出相反的變化趨勢(見圖2(D)、(E)),隨著濃度的升高輪蟲的生殖期延長,飽食培養(yǎng)條件下,低濃度為240 h,中濃度為252 h,高濃度為288 h;饑餓培養(yǎng)下,低濃度為168 h,中濃度為180 h,高濃度為192 h,但無論是生殖期還是峰值都小于對照組。DBDPE作用下,總體產(chǎn)幼數(shù)結(jié)果同樣隨著濃度的升高,產(chǎn)幼數(shù)量先升高后下降(見圖2(F)),但在低濃度時表現(xiàn)出更強的抑制,而在高濃度時表現(xiàn)出抑制較弱,但均未呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。

表1 BDE-47和DBDPE單一和聯(lián)合作用下,輪蟲生殖期和總產(chǎn)幼數(shù)抑制情況Table 1 The inhibition of rotifer reproductive stage and total larvae number under the single and combined action of BDE-47 and DBDPE

(5,50,500分別為BDE-47或DBDPE濃度5,50和500 μg/L。(A) BDE-47作用于飽食組;(B) BDE-47作用于饑餓組;(C) BDE-47作用下飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù);(D) DBDPE作用于飽食組;(E) DBDPE作用于饑餓組;(F) DBDPE作用下飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù)。P值為和相同營養(yǎng)條件對照組比較的結(jié)果,:P<0.05,:P<0.01。5, 50, 500 refer to BDE-47 or DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L, respectively. (A) BDE-47 on satiation group; (B) BDE-47 on starvation group; (C) BDE-47 on the total larval number of satiation group and starvation group; (D) DBDPE on satiation group; (E) DBDPE on starvation group; (F) DBDPE on the total larval number of satiation group and starvation group. The P value was the result of comparison with the control group under the same nutritional conditions, ,: P<0.05,: P<0.01.)圖2 不同餌料藻密度下,BDE-47和DBDPE單一作用對褶皺臂尾輪蟲的生殖力的影響Fig.2 Under different feed concentrations, effects of single action of BDE-47 and DBDPE on fecundity of B. plicatilis

等濃度BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用組對輪蟲生殖力的影響如圖3。飽食培養(yǎng)時,低、中濃度組的輪蟲均在240 h就結(jié)束生殖期,高濃度受抑制最嚴重,在144 h結(jié)束(見圖3(A))。饑餓培養(yǎng)時,低、中、高濃度的生殖期結(jié)束都較對照組提前(見圖3(B)),且中、高濃度生殖期分別呈現(xiàn)顯著(P<0.05)和極顯著抑制(P<0.01,見表1)。低、中濃度組的生殖峰同樣在84 h,高濃度組提前至60 h,且峰值也受到一定程度的抑制。總產(chǎn)幼數(shù)變化呈現(xiàn)隨濃度升高,先升高后降低,低濃度組和高濃度組都呈現(xiàn)極顯著抑制(P<0.01),在高濃度組受抑制最嚴重,總產(chǎn)幼平均數(shù)為10.01 ind.(見圖3(C))。總產(chǎn)幼數(shù)始終低于高密度組,變化趨勢也為先升高后降低,在高濃度顯著低于饑餓對照組(P<0.01)。

(5,50,500分別為BDE-47和DBDPE濃度5,50和500 μg/L。(A) 聯(lián)合作用于飽食組;(B) 聯(lián)合作用于饑餓組;(C) 聯(lián)合作用下飽食組和饑餓組總產(chǎn)幼數(shù)。P值為和相同營養(yǎng)條件對照組比較的結(jié)果,:P<0.05,:P<0.01。5, 50, 500 refer to BDE-47 and DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L, respectively. (A) Combined action on satiation group; (B) Combined action on starvation group; (C) Combined action on the total larval number of satiation group and starvation group. The P value was the result of comparison with the control group under the same nutritional conditions, : P<0.05,: P<0.01.)圖3 不同餌料藻密度下,BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲的生殖力的影響Fig.3 Under different feed concentrations, effects of combined action of BDE-47 and DBDPE on fecundity of B. plicatilis

2.2 BDE-47和DBDPE單一及聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲的存活力的影響。

BDE-47和DBDPE單一和聯(lián)合作用對輪蟲的存活情況影響如圖4所示。飽食培養(yǎng)的對照組從168 h開始出現(xiàn)死亡個體,在408 h初始輪蟲個體都死亡(見圖4(A)),饑餓對照組則從48 h就出現(xiàn)死亡個體,192 h全部輪蟲死亡(見圖4(B))。飽食培養(yǎng)時,BDE-47單一作用低濃度組24 h就出現(xiàn)死亡個體,336 h全部個體。中濃度和高濃度出現(xiàn)死亡個體時間晚于低濃度組,但高濃度組大量死亡,特定年齡存活率曲線陡于其他組,192 h全部個體死亡,存活時間減少(見圖4(B))。而饑餓時,輪蟲對BDE-47單一作用響應趨勢類似(見圖4(F)),高濃度組存活時間最短(192 h)。DBDPE單一作用組在飽食培養(yǎng)組時(見圖4(C)),中濃度組出現(xiàn)死亡個體最遲(168 h),但高濃度組存活時間最長(360 h)。而DBDPE單一作用于饑餓培養(yǎng)組時(見圖4(G)),則是高濃度組出現(xiàn)死亡個體最遲(120 h),且存活時間最長(216 h)。聯(lián)合作用于飽食培養(yǎng)組時,在中、高濃度組最早出現(xiàn)死亡個體(48 h),且存活時間受到顯著抑制,其中高濃度組受抑制最嚴重,168 h全部死亡(見圖4(D))。而當聯(lián)合作用于饑餓培養(yǎng)組時,高濃度組存活時間相同為168 h,低、中濃度組則呈現(xiàn)受抑制更明顯,均為192 h(見圖4(H))。

( (A) 飽食對照組;(B) BDE-47作用于飽食組;(C) DBDPE作用于飽食組;(D) 聯(lián)合作用于飽食組;(E) 饑餓對照組;(F) BDE-47作用于饑餓組;(G) DBDPE作用于饑餓組;(H) 聯(lián)合作用于饑餓組。(B)、(F) 中,5,50,500為BDE-47濃度5,50和500 μg/L;(C)、(G) 中,為DBDPE濃度5,50和500 μg/L;(D)、(H) 中,為BDE-47和DBDPE濃度5,50和500 μg/L。(A) Satiation control group; (B) BDE-47 on satiation group; (C) DBDPE on satiation group; (D) Combined action on satiation group; (E) Starvation control group; (F) BDE-47 on starvation group; (G) DBDPE on starvation group;(H) Combined action on starvation group. In (B) and (F) , 5,50,500 refer to BDE-47concentration 5, 50 and 500 μg/L; in (C) and (G), refer to DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L; in (D) and (H), BDE-47 and DBDPE concentration 5, 50 and 500 μg/L.)圖4 不同餌料藻密度下,BDE-47和DBDPE單一及聯(lián)合作用對褶皺臂尾輪蟲特定年齡存活率的影響Fig.4 Effects of single and combined action of BDE-47 and DBDPE on survival of B. plicatilis under different feed concentrations

3 討論

從20世紀70年代起,PBDEs作為阻燃劑中的主力軍一直被大量生產(chǎn)并應用,其主要同系物BDE-47也成為海洋環(huán)境中的主要污染物之一。而隨著PBDEs的禁用,以DBDPE為代表的新型阻燃劑如今在應用方面已經(jīng)取代了PBDEs的地位,并逐漸向環(huán)境中釋放,形成更加多樣的海洋環(huán)境,并造成更加復雜的海洋生物暴露風險。本研究以海洋的第一道防線-浮游動物褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)為對象,選取BDE-47和DBDPE為舊型和新型溴系阻燃劑代表,通過研究生殖力和存活力的毒性效應變化,探究BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下毒性效應變化規(guī)律。

從生殖力結(jié)果看,BDE-47或DBDPE都可以抑制褶皺臂尾輪蟲的生殖期持續(xù)時間、生殖峰值及總產(chǎn)幼率,兩者聯(lián)合作用時表現(xiàn)出更強的抑制作用,而餌料藻的減少雖然在總體上抑制了生殖力,但在一定程度上也減弱了BDE-47和DBDPE的抑制作用。BDE-47已被證明可以通過誘導ROS含量增加,導致氧化應激,進而降低輪蟲的生殖力[26]。DCF-DA熒光探針實驗也顯示輪蟲卵巢中的ROS遠高于其他器官,同時伴有氧化損傷現(xiàn)象[14]。這是由于卵巢中脂肪含量豐富,易成為脂溶性BDE-47富集的靶器官。作為一種新興污染物,DBDPE的靶組織和主要毒性尚不清楚,但有少量研究支持DBDPE主要存在于腎臟和卵巢中[27]。在特定組織中的靶向積累會造成直接接觸并導致相應的生殖毒性,大鼠實驗證明,DBDPE可通過誘導大鼠性腺端粒功能障礙及相關(guān)細胞衰老和凋亡[28-29]。

已有研究證明,DBDPE對水蚤(Daphnia)有劇毒,EC50值為19 μg/L,且DBDPE降低了暴露的斑馬魚卵的孵化率,并顯著提高了孵化幼蟲的死亡率[30]。同時對BDE-47研究也發(fā)現(xiàn),其對水蚤的EC50值為0.058 mg/L,遠遠大于DBDPE,表現(xiàn)為更高的生物毒性[31]。Feng等的研究也證明BDE-209具有比DBDPE更高的氧化應激誘導能力,表現(xiàn)為抗氧化酶活性顯著抑制和谷胱甘肽還原水平降低,并指示脂質(zhì)過氧化水平丙二醛含量升高。而BDE-209作為BDE-47同系物,其毒性遠小于BDE-47,這也間接證明了BDE-47毒性大于DBDPE[32]。通過本文對B.plicatilis的生殖期研究發(fā)現(xiàn),除飽食培養(yǎng)下的高濃度聯(lián)合作用組,所有組都可在36 h內(nèi)產(chǎn)生新的幼蟲,但是各組生殖期結(jié)束時間有明顯差異,導致不同組的生殖期持續(xù)時間差異較大(見表1)。BDE-47單一作用時,隨濃度升高,生殖期持續(xù)時間逐漸受到抑制,DBDPE單一作用組則隨濃度升高生殖期持續(xù)時間逐漸升高,表現(xiàn)出一定的興奮效應,且高濃度DBDPE單一作用的生殖期持續(xù)時間較BDE-47單一作用的生殖期持續(xù)時間長,表明對于生殖期等濃度的DBDPE的毒性弱于BDE-47。本文結(jié)果同以往研究結(jié)果一致,DBDPE誘導的生物毒性弱于BDE-47。

二者聯(lián)合作用于輪蟲生殖力相關(guān)指標的抑制趨勢和BDE-47單一作用類似,并呈現(xiàn)更強的抑制作用,聯(lián)合作用的飽食組生殖期僅為96 h,饑餓組為108 h。BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下,輪蟲生殖期作用模式如表2所示。在飽食時,低、中濃度BDE-47和DBDPE兩者聯(lián)合作用時表現(xiàn)為拮抗作用,在高濃度時表現(xiàn)為相加作用。而在饑餓時,3個濃度均表現(xiàn)為協(xié)同作用。推測首先是因為飽食培養(yǎng)時,充足的食物供給為輪蟲提供充足的物質(zhì)保障,進而產(chǎn)生足夠的抗性物質(zhì)和酶。研究證明對于長期饑餓的鱸魚(Dicentrarchuslabrax),重新喂養(yǎng)后會大量增加其體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性,并增加Hsp 90等抗性物質(zhì)含量,使其生物抗性增加[33]。Zengin等[34]的研究也證明喂食的虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)體內(nèi)抗氧化防御相關(guān)的物質(zhì)含量普遍高于饑餓狀態(tài)的黑魚,涉及的抗氧化物質(zhì)包括谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)等抗氧化劑,以及SOD、CAT、谷氨酸過氧化物酶(GSHpx)、谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化酶。而隨著濃度升高,飽食組BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用由拮抗作用轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用,因為外界餌料藻密度不變的情況下,輪蟲自身攝食能力受到抑制。研究證明BDE-47可以導致輪蟲濾食率和攝食率的減少,并誘導其消化酶活性降低[35]。同時DBDPE作為PBDEs的替代品,具有相似的理化性質(zhì),因此在生物體內(nèi)應對這2種物質(zhì)的生理保護機制是共享的,因此BDE-47和DBDPE以非致死性濃度同時作用時,一種脅迫因子刺激增強生物體對另一種脅迫因子的耐受性,既交叉耐受性[36-37]。并且相關(guān)研究也證明,一定程度上,鹽度脅迫強度的增加會使昆蟲種群表現(xiàn)出更強的交叉耐受性[38]。大型水蚤可以通過誘導體內(nèi)金屬硫蛋白和Hsp70含量的提高對Cd和熱脅迫產(chǎn)生交叉耐受性,并且隨著Cd的濃度升高,金屬球蛋白的表達量也上調(diào),呈現(xiàn)更強的耐受性[39]。而雖然饑餓組生殖期普遍比飽食組短,但同對照組相比,飽食組呈現(xiàn)更高強度的抑制,進而導致交叉耐受性響應更強,表現(xiàn)出拮抗作用。飽食培養(yǎng)下的輪蟲受到PBDE的相對抑制更強這可能是由于高密度的餌料藻會導致輪蟲在攝食過程中伴隨性攝入更多的毒物,進而受到的脅迫更強,而饑餓受食物限制,攝入毒物也較少。因此飽食培養(yǎng)時,輪蟲可能受到的外源脅迫更強,體現(xiàn)出生殖期的相對抑制率更高,而同時充足的食物供給又保障了輪蟲抗氧化系統(tǒng)的活躍,進而使聯(lián)合作用表現(xiàn)出拮抗效應。

表2 BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下,輪蟲生殖期和總產(chǎn)幼數(shù)作用模式Table 2 The action mode of rotifer reproductive stage and total larvae number under combined action of BDE-47 and DBDPE

在饑餓培養(yǎng)時,輪蟲生殖期和對照組相比的相對抑制較低(見表1),除了低攝食可能導致的污染物低生物富集,還可能因為饑餓在一定程度上增加生物的抗性。因為饑餓可以使生物產(chǎn)生一定程度的氧化應激,進而更及時的應對外源毒物的脅迫。而飽食雖然可以保障抗氧化物質(zhì)原料的供給,但抗氧化系統(tǒng)初始活躍度低,導致生物響應遲緩。研究證明暴露于急性Cu脅迫時,高日糧魚的敏感性是低日糧魚的2倍,減少食物攝入量可以降低急性Cu暴露的影響[40]。Higashimoto等研究證明了在連續(xù)禁食期間小鼠肝臟金屬硫蛋白(MT)的顯著增加,這可能是抗性增加的原因之一[41]。同時,在饑餓培養(yǎng)條件下,雖然輪蟲保持氧化應激的戰(zhàn)備狀態(tài),但是調(diào)動需要大量抗性物質(zhì)積累的交叉耐受性能力弱,進而表現(xiàn)出聯(lián)合作用時出現(xiàn)協(xié)同作用。

除生殖期外,生殖力的另一指標總產(chǎn)幼數(shù)表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律,但整體敏感度弱于生殖期,表明輪蟲受脅迫時傾向于短時間大量產(chǎn)卵。有研究證明BDE-47雖然會抑制褶皺臂尾輪蟲種群的密度,降低其環(huán)境容納量,但在增長期可以在一定程度上提高輪蟲種群的最大瞬時增長率[42]。饑餓培養(yǎng)時,輪蟲的總產(chǎn)幼數(shù)整體較低,但單一或聯(lián)合作用組的抑制率要低于同條件飽食培養(yǎng)組的輪蟲。BDE-47在總產(chǎn)幼數(shù)方面抑制率在低、中濃度引起的興奮效應不盡相同,但在高濃度時的抑制率高于DBDPE的抑制率,同生殖期結(jié)果相一致,同樣可能受攝食行為的調(diào)控。通過比較表2中的總產(chǎn)幼的Q值,在飽食時,BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下總產(chǎn)幼數(shù)同生殖期一致,在低、中濃度組均表現(xiàn)為拮抗作用,在高濃度組表現(xiàn)為協(xié)同作用。

從存活力結(jié)果看,飽食培養(yǎng)下的輪蟲雖然比饑餓培養(yǎng)下的輪蟲存活期更長,但同對照組相比,相對受抑制程度更強,小密度餌料培養(yǎng)時,除了聯(lián)合作用高濃度組,其他組基本沒有受到明顯抑制。這是因為一方面研究證明饑餓會加速生物的衰老,表現(xiàn)出免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)活力的迅速衰退[43],進而減少了輪蟲的存活時間。而另一方面生物的存活力主要受基礎代謝控制,而輪蟲作為孤雌生殖個體,種群基本全為雌性個體,體內(nèi)往往為了生殖而有更豐富的物質(zhì)儲備,因此應對外源脅迫的能力更強[44]。從存活期抑制情況看,BDE-47毒性同樣強于DBDPE,聯(lián)合作用時表現(xiàn)毒性增加(見表3)。并且存活的整體抑制程度也弱于生殖力,這是因為同主要受基礎代謝控制的存活不同,輪蟲的生殖力既受基礎代謝控制,還需足夠的外源物質(zhì)補充,即攝食情況控制,因此敏感程度更高[45]。且生物的生殖器官往往含有豐富的脂質(zhì),成為脂溶性毒物的重要靶標,更容易受到脅迫。對暴露于4種多環(huán)芳烴的海膽(Evechinuschloroticus)研究表明,在性腺組織中發(fā)現(xiàn)增加蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷會導致產(chǎn)卵率下降[46]。Xu等的研究也證明了氨脅迫下,萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)生殖所需物質(zhì)供給不足,產(chǎn)生后代數(shù)目減少,種群增長受到限制[47]。BDE-47和DBDPE聯(lián)合對輪蟲作用模式如表4所示,飽食培養(yǎng)時除高濃度組為相加作用,低、中濃度組均表現(xiàn)為拮抗作用;饑餓培養(yǎng)時,均表現(xiàn)為協(xié)同作用,總產(chǎn)幼數(shù)同生殖期結(jié)果一致。

表3 BDE-47和DBDPE單一和聯(lián)合作用下,輪蟲存活期抑制情況Table 3 The inhibition of rotifer survival period under the single and combined action of BDE-47 and DBDPE

表4 BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用下,輪蟲存活期作用模式Table 4 The action mode of rotifer survival period under combined action of BDE-47 and DBDPE

4 結(jié)語

BDE-47和DBDPE的單一作用都顯著影響褶皺臂尾輪蟲的生殖力和存活力,具體表現(xiàn)在對總產(chǎn)幼數(shù)的減少,生殖期和存活時間的縮短,BDE-47單一作用呈現(xiàn)出比DBDPE更強的生物毒性。其中主要受攝食行為調(diào)控的生殖期是較敏感指標。BDE-47和DBDPE聯(lián)合作用抑制效應在輪蟲饑餓時表現(xiàn)為對生殖力和存活力的協(xié)同作用,而在輪蟲飽食時,在低、中濃度表現(xiàn)出對生殖力和存活力的拮抗作用,而在高濃度組基本表現(xiàn)為相加作用。本研究表明充足的食物供給可使生物表現(xiàn)出交叉耐受性,減弱BDE-47和DBDPE同時作用時的生物毒性。