piRNA在腫瘤中的研究進(jìn)展

陳艷麗　陽(yáng)志軍

【摘要】 PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）是一類長(zhǎng)度18～31 nt的非編碼RNA。這類RNA可以通過(guò)沉默轉(zhuǎn)座子來(lái)維持基因組的完整性，并具有調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和全基因組的DNA的甲基化狀態(tài)的作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)piRNA在腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)。piRNA主要通過(guò)影響基因組完整性等方式參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。本文重點(diǎn)圍繞近年來(lái)取得的研究進(jìn)展，對(duì)腫瘤相關(guān)piRNA分子機(jī)制進(jìn)行深入闡述，旨在為腫瘤精準(zhǔn)診療提供新思路。

【關(guān)鍵詞】 piRNA 非編碼RNA 腫瘤

Research Progress of piRNA in Tumor/CHEN Yanli， YANG Zhijun. //Medical Innovation of China， 2023， 20（10）： -183

[Abstract] PIWI-interacting RNA （piRNA） is a non-coding RNA with a length of 18～31 nt. It can maintain the integrity of the genome by silencing transposons and has the function of regulating the transcription of downstream target genes and the methylation state of genome-wide DNA. In recent years， abnormal expression of piRNA in tumors has been found to be significantly correlated with tumor prognosis. piRNAs take part in the development and progression of many diseases， including tumors， by affecting the integrity of the genome. Focusing on the research progress made in recent years， this paper elaborates the molecular mechanism of piRNA related to tumor in depth， aiming to provide new ideas for accurate diagnosis and treatment of tumor.

[Key words] piRNA Non-coding RNA Tumor

First-author's address： The Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Liuzhou 545005， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.10.042

人類全基因組中僅有2%～3%的基因被翻譯成蛋白發(fā)揮功能，因?yàn)榻^大多數(shù)基因僅進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄物的改變通常由癌癥基因組中的體細(xì)胞變化引起[1]。這些僅僅進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄的基因稱為非編碼RNA，其種類較多，PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA， piRNA）是其中一種。piRNA長(zhǎng)度18～31 nt，數(shù)量在非編碼RNA中是最多的，有上百萬(wàn)種[2-3]。隨著研究的深入，人類發(fā)現(xiàn)它主要通過(guò)沉默轉(zhuǎn)座子來(lái)維持基因組的完整性參與了包括腫瘤等在內(nèi)多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，其他作用機(jī)制包括調(diào)控基因的甲基化狀態(tài)、下游靶基因的沉默、翻譯后的蛋白進(jìn)行修飾等。piRNA在癌癥中的異常表達(dá)，與腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)[4-5]。本文結(jié)合近年來(lái)取得的研究進(jìn)展，重點(diǎn)對(duì)腫瘤相關(guān)piRNA分子機(jī)制進(jìn)行深入闡述，旨在為腫瘤精準(zhǔn)診療提供新思路。

1 piRNA的發(fā)現(xiàn)及產(chǎn)生途徑

二十年前發(fā)現(xiàn)的piRNA在基因調(diào)控、轉(zhuǎn)座子元件抑制和抗病毒防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。piRNA的失調(diào)已在包括癌癥在內(nèi)的多種人類疾病中被發(fā)現(xiàn)，且不同動(dòng)物的piRNA簇來(lái)自不同的基因組位點(diǎn)，產(chǎn)生piRNA前體的機(jī)制略有不同[6-7]。如按照來(lái)源將其進(jìn)行分類，可以分成長(zhǎng)鏈非編碼RNA來(lái)源的、mRNA來(lái)源的和轉(zhuǎn)座子來(lái)源的piRNA。在這三種來(lái)源的piRNA中，目前只有轉(zhuǎn)座子來(lái)源的piRNA被研究得比較深入[2]。piRNA前體通常是由包含重復(fù)元件的特定基因組位置產(chǎn)生的，并不依賴于Dicer酶而合成。新生的piRNA需要轉(zhuǎn)錄后修飾才能成為成熟的piRNA。

piRNA的生物發(fā)生有兩條主要途徑：初級(jí)piRNA產(chǎn)生途徑及次級(jí)piRNA生存途徑——“乒乓循環(huán)機(jī)制”產(chǎn)生途徑。piRNA的初級(jí)合成依賴于細(xì)胞核中的RNA聚合酶Ⅱ，轉(zhuǎn)錄來(lái)自piRNA基因簇的小核苷酸序列，形成長(zhǎng)的單鏈前體piRNA，然后將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。前體piRNA被核酸內(nèi)切酶Zucchini催化切割成piRNA前體片段整合到PIWI蛋白中，通過(guò)3'-5'外切切割至最終長(zhǎng)度，然后分別與PIWI蛋白結(jié)合，形成piRNA/PIWI蛋白復(fù)合物后被轉(zhuǎn)移回到胞核內(nèi)。被轉(zhuǎn)移到胞漿的前體piRNA與Ago3或Aub蛋白結(jié)合形成piRNA/Ago3或piRNA/Aub復(fù)合物，piRNA/Ago3復(fù)合物可以作為模板生成新的RNA作為形成新的piRNA的底物，由此產(chǎn)生的新的piRNA可以負(fù)載Aub蛋白。然后將piRNA/Aub蛋白復(fù)合物產(chǎn)生的RNA作為模板，通過(guò)類似的工藝作為底物，形成新的piRNA/Ago3復(fù)合物。這種以一種piRNA分子的產(chǎn)物為底物合成另一種piRNA分子的相互作用，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)分子的同時(shí)擴(kuò)增，這就是乒乓擴(kuò)增[8]。

2 piRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制

2.1 piRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) piRNA在5'端有強(qiáng)烈的尿苷偏好，而3'端具有2'-O-甲基的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，PIWI蛋白能夠與它特異性結(jié)合[9]。piRNA不具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)及序列結(jié)構(gòu)域，但Balaratnam等[10]通過(guò)生物信息學(xué)分析認(rèn)為人的piRNA存在G-quadruplex（GQ）二級(jí)結(jié)構(gòu)，并用生物化學(xué)及生物物理的方法證實(shí)其有形成GQ二級(jí)結(jié)果的能力。并且利用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)piRNA的GQ二級(jí)結(jié)構(gòu)可抑制其與HIWI-PAZ蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而影響其和下游靶基因的結(jié)合。因此認(rèn)為piRNA-GQ二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以賦予其新的調(diào)控功能[10]。

2.2 piRNA的作用機(jī)制 piRNA在不同的物種中，其序列和結(jié)構(gòu)差異很大，從而導(dǎo)致piRNA在各類物種中的功能差異比較大。現(xiàn)有的研究證據(jù)表明，piRNA主要有沉默轉(zhuǎn)座子、基因及修飾蛋白等重要的調(diào)控功能[2，11]。在果蠅卵巢中，發(fā)現(xiàn)piRNA來(lái)源于特定piRNA簇，經(jīng)加工成成熟后，piRNA與Argonaute蛋白家族的PIWI成員組裝，形成piRNA誘導(dǎo)的RNA沉默復(fù)合物（piRISCs），被轉(zhuǎn)回到細(xì)胞核，并通過(guò)在目標(biāo)轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)誘導(dǎo)局部異染色質(zhì)形成而抑制轉(zhuǎn)座子的共轉(zhuǎn)錄[12-13]。在動(dòng)物生殖系及體細(xì)胞中，piRNA對(duì)下游基因的靶點(diǎn)可以容忍少量堿基不匹配，并具有靶向所有種系mRNA的能力，并遵循類似于microRNA的配對(duì)規(guī)則，而發(fā)揮沉默基因功能[14-16]。Han等[17]在2021年的研究中發(fā)現(xiàn)piRNA-30473在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中通過(guò)調(diào)節(jié)m6A RNA甲基化而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和提示不良預(yù)后。在越來(lái)越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)有piRNA的表達(dá)，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的各種生理功能。

2.2.1 影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲 piRNA-823在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖、成管及侵襲能力。其作用機(jī)制是促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白介素-6、細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)并抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)p16INK4A的異常甲基化，而失去抑癌活性[18]。Li等[19]在非小細(xì)胞肺癌中的研究，基于高通量測(cè)序手段，使用癌與癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)血清來(lái)源的細(xì)胞外囊泡piR-hsa-164586作為早期診斷的新生物標(biāo)志物。并且通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行再次驗(yàn)證，證實(shí)piR-hsa-164586在非小細(xì)胞肺癌診斷的曲線下面積達(dá)到0.623在全部分期（一期）患者群體中。在結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）組織中，piRNA-823可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，piRNA-823通過(guò)上調(diào)熱休克因子1的磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮促腫瘤作用[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)在直腸癌中piRNA-54265與PIWIL2蛋白結(jié)合，形成PIWIL2/STAT3/磷酸化-src復(fù)合物，激活STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[21]。在肝臟組織中有66 772個(gè)piRNAs表達(dá)（已知149個(gè)），癌和癌旁組織表達(dá)差異明顯的有241個(gè)piRNAs，轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移腫瘤組織表達(dá)差異明顯的1 634個(gè)piRNAs。差異piRNA的靶基因主要功能富集在細(xì)胞黏附上，發(fā)現(xiàn)piRNA（piRl/97）促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移[22]。在乳腺癌中piRNA-36712與SEPW1P（SEPW1的一個(gè)反加工偽基因）產(chǎn)生的mRNA相互作用，通過(guò)與SEPW1 mRNA競(jìng)爭(zhēng)microRNA-7和microRNA-324的機(jī)制來(lái)抑制SEPW1的表達(dá)。在乳腺癌中piRNA-36712的下調(diào)導(dǎo)致SEPW1表達(dá)升高，可能抑制P53，導(dǎo)致Slug表達(dá)上調(diào)，同時(shí)P21和上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達(dá)下降，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[5]。PiR-39980在骨肉瘤中通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶-2來(lái)促進(jìn)遷移和侵襲，并通過(guò)對(duì)SERPINB1的負(fù)調(diào)控來(lái)抑制細(xì)胞死亡[23]。PiR-39980在纖維肉瘤中通過(guò)直接靶向其核糖核苷酸還原酶亞基M2的3'非翻譯區(qū)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制纖維肉瘤細(xì)胞的增殖[24]。

2.2.2 維持腫瘤細(xì)胞的干性 用RT-PCR及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)鑒定側(cè)群細(xì)胞（side population， SP）的干細(xì)胞特性，q-PCR法檢測(cè)SP及非側(cè)群的乳腺癌細(xì)胞（non-SP，NSP）中3種PIWI基因（HIWI，HILI和HIWI2）及4種piRNA（piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的SP亞群富含腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞；HIWI和HIWI2在SP細(xì)胞中的水平顯著高于NSP細(xì)胞（P<0.05）；piR-4987、piR-20365和piR-20582在SP細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于NSP細(xì)胞（P<0.01）。因此認(rèn)為乳腺癌干細(xì)胞內(nèi)可能存在類似生殖干細(xì)胞內(nèi)的PIWI-piRNA通路，HIWI、HIWI2、piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582可能參與調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性[25]。骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)piRNA-823的表達(dá)和DNMT3B的激活賦予多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞干細(xì)胞樣的性質(zhì)。中性粒細(xì)胞-髓源性抑制細(xì)胞（granulocytic myeloid de-rived suppressor cells， G-MDSCs）促進(jìn)了MM細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells， CSCs）核心基因的側(cè)群、球的形成和表達(dá)[26]。

3 piRNA在腫瘤中的應(yīng)用現(xiàn)狀

隨著研究的深入，piRNA在腫瘤領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 腫瘤診斷 有研究發(fā)現(xiàn)在直腸癌患者血清中存在一個(gè)5聯(lián)piRNAs（piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365）組合可以作為CRC診斷的血清生物標(biāo)志物，該組合（piRNA Ⅰ組）臨床診斷意義優(yōu)于癌胚抗原 Ⅱ組，特異性為0.867（P<0.001）[27]。在CRC中，piRNA的失調(diào)水平與DNA甲基化和T細(xì)胞調(diào)節(jié)有關(guān)。迄今為止，在CRC中僅發(fā)現(xiàn)了少數(shù)循環(huán)的piRNA，然而其表達(dá)水平改變是被認(rèn)為是潛在的候選診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。Vychytilova-Faltejskova等[28]的研究發(fā)現(xiàn)血清piRNA-823水平與CRC患者的腫瘤分期呈正相關(guān)，在晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者中可觀察到明顯更高的piRNA-823水平。研究也發(fā)現(xiàn)胃液中piR-1245的含量明顯高于對(duì)照組（P<0.0001）。受試者特征曲線下面積值為0.885[敏感度90.9%，特異度74.2%，95%置信區(qū)間（0.828 6，0.941 4）][29]。這些研究發(fā)現(xiàn)意味著，piRNAs在腫瘤組織中差異表達(dá)，是潛在的腫瘤標(biāo)志物，具有作為腫瘤診斷的潛力。

3.2 腫瘤治療 越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，piRNA是潛在的抗腫瘤治療的藥物靶點(diǎn)。在MM細(xì)胞中沉默piRNA-823可以降低G-MDSCs維持的多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞的干性，從而降低體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷和血管生成。并且G-MDSCs、piRNA-823、DNA甲基化和CSCs核心基因之間的細(xì)胞、分子和臨床之間存在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。piRNA-823干擾就是在MM微環(huán)境中同時(shí)針對(duì)G-MDSCs和CSCs新的抗癌策略[26]。細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）可在腫瘤微環(huán)境中攜帶多種RNA，是腫瘤與周圍基質(zhì)細(xì)胞（包括內(nèi)皮細(xì)胞）之間通信的關(guān)鍵。piRNA-823在MM患者外周血及MM細(xì)胞來(lái)源的EVs中積累，MM細(xì)胞來(lái)源的EVs能有效地將piRNA-823轉(zhuǎn)移至EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染piRNA-823類似物或經(jīng)MM衍生EVs預(yù)處理的EA.hy926細(xì)胞促進(jìn)了異種移植瘤MM的生長(zhǎng)。相反，轉(zhuǎn)染piRNA823抑制劑或用轉(zhuǎn)染piRNA-823抑制劑的MM細(xì)胞的EVs處理能有效抑制異種移植瘤MM的生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，由MM衍生的EVs攜帶的piRNA-823對(duì)于ECs的再生至關(guān)重要，通過(guò)改變其生物學(xué)特性，使其適應(yīng)MM細(xì)胞生長(zhǎng)的獨(dú)特環(huán)境。可能為開(kāi)發(fā)piRNA介導(dǎo)的MM的治療新策略提供依據(jù)[30]。piRNA-823在直腸癌中也是潛在的治療靶點(diǎn)[20]。piRNA piR-Fth1與鐵蛋白重鏈1（Fth1）mRNA中有一個(gè)互補(bǔ)序列，在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer， TNBC）細(xì)胞中，pi-Fth1在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控Fth1的表達(dá)，piRNA靶標(biāo)的特定mRNA pi-Fth1可能是TNBC治療的新靶點(diǎn)[31]。

3.3 腫瘤耐藥 有研究發(fā)現(xiàn)在直腸癌中piRNA-54265與PIWIL2蛋白結(jié)合，形成PIWIL2/STAT3/磷酸化-SRC復(fù)合物，激活STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤耐藥的產(chǎn)生[21]。piRNA-36712可以影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇和阿霉素的敏感性。piRNA-39980在神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤中可以通過(guò)抑制藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，降低神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤對(duì)阿霉素的敏感性[32]。在三陰性乳腺癌中，Pi-fth1通過(guò)HIWI2和HILI靶向Fth1mRNA，引起fth1抑制使TNBC細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性顯著提高了20倍[31]。這些研究無(wú)不顯示著，piRNAs在腫瘤耐藥中發(fā)揮著作用，為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥策略提供新的潛在治療靶點(diǎn)。

3.4 腫瘤預(yù)后 piRNAs在預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后方面也引起了研究者的廣泛重視。Ou等[33]的研究發(fā)現(xiàn)在衰老中性粒細(xì)胞衍生的外體piRNA-17560，它以STAT3依賴性方式通過(guò)肥胖相關(guān)蛋白介導(dǎo)的m6A去甲基化促進(jìn)乳腺癌的化療耐藥和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示piRNA-17560可作為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)并提示患者預(yù)后。piRNA-36712在乳腺癌組織中明顯低于正常乳腺組織，其低水平表達(dá)與患者的臨床預(yù)后不良相關(guān)，這提示piRNA-36712可能是乳腺癌患者預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)因子[5]。胃組織的piRNA圖譜顯示，大多數(shù)的piRNA嵌入在蛋白編碼序列中（即基因間），并發(fā)現(xiàn)一個(gè)與無(wú)復(fù)發(fā)生存相關(guān)的3聯(lián)合piRNA序列（FR290353， FR064000和FR387750或者FR157678）[34]。有研究者通過(guò)全基因組聯(lián)合單核苷酸多態(tài)性的方法綜合分析了3 116個(gè)PIWI-piRNA通路基因中常見(jiàn)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在黑色素瘤疾病特異性生存中的預(yù)后作用，發(fā)現(xiàn)PIWI-piRNA通路基因DCP1A的遺傳變異可能預(yù)測(cè)黑色素瘤疾病特異性生存[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，piRNA-1245在CRC中高表達(dá)，其過(guò)表達(dá)與晚期和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，其高表達(dá)的患者總體生存期明顯較短，多因素分析發(fā)現(xiàn)其可作為CRC的獨(dú)立預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物[35]。piRNA-017724水平較低的直腸癌患者總體生存和無(wú)進(jìn)展生存較差，多因素分析發(fā)現(xiàn)血清水平的piRNA-017724是總體生存和無(wú)進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)后因素[27]。

4 存在問(wèn)題及展望

針對(duì)piRNA的研究已經(jīng)有10余年，隨著高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)技術(shù)及生物信息分析學(xué)的發(fā)展及推廣，使得piRNA的檢測(cè)及發(fā)現(xiàn)得到更為方便簡(jiǎn)易。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)的及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等越來(lái)越成熟，為進(jìn)一步研究piRNA的功能提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)技能基礎(chǔ)。在某些腫瘤中，piRNA已有了較深入的研究，piRNA在腫瘤細(xì)胞中有差異性表達(dá)，并與臨床分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，有望為腫瘤的臨床診斷、預(yù)后判斷及精準(zhǔn)的治療提供靶點(diǎn)。但在腫瘤中piRNA是如何發(fā)生調(diào)控功能的分子機(jī)制尚不明確，piRNA與PIWI蛋白分別單獨(dú)發(fā)生調(diào)控作用，還是piRNA與PIWI形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物后共同發(fā)揮調(diào)控作用？在什么水平發(fā)生什么具體的調(diào)控功能？因此離系統(tǒng)構(gòu)建一個(gè)完整解釋piRNAs和PIWI蛋白的生物發(fā)生、功能及其相互作用的知識(shí)網(wǎng)絡(luò)還很遙遠(yuǎn)。但隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步及成熟，科學(xué)研究者們對(duì)piRNA的進(jìn)一步探索和研究，有待揭開(kāi)其在腫瘤領(lǐng)域的功能的神秘面紗，進(jìn)而提高人類對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)。

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（收稿日期：2023-02-07） （本文編輯：張明瀾）