全基因組測(cè)序確診氨基甲酰磷酸合成酶缺乏癥Ⅰ型1例

馬鵬飛 許愿愿 趙曉玲 童文佳 龍?jiān)?金丹群 吳成 陸怡

作者單位：231500 合肥 安徽省兒童醫(yī)院消化科(馬鵬飛,龍?jiān)?吳成);安徽省兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(許愿愿,趙曉玲,童文佳,金丹群);復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院肝病中心(陸怡)

患兒,男,1個(gè)月20天,因“嘔吐3天,昏睡、呻吟半天伴反復(fù)抽搐發(fā)作”入院,患兒系G2P2,足月順產(chǎn),否認(rèn)出生時(shí)有窒息搶救史,出生體重3 400 g,父母體健,否認(rèn)近親結(jié)婚,否認(rèn)家族遺傳病、傳染病及肝膽疾病史。患兒哥哥體健。入院查體:昏睡狀態(tài),精神、反應(yīng)差,面色稍蒼白,無(wú)特殊面容,全身皮膚無(wú)黃染、淤點(diǎn)淤斑、出血點(diǎn)及花紋征,呼吸深快,三凹征(-),心肺聽(tīng)診陰性,腹膨隆、軟,腹壁未見(jiàn)靜脈曲張,肝脾肋下未及,腸鳴音正常,四肢肌張力增高,四肢陣發(fā)性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。雙下肢無(wú)浮腫,雙側(cè)足背動(dòng)脈搏動(dòng)有力。急診血?dú)夥治?PH 7.51,PCO222.3 mmHg,PO285mmHg,cHCO215.5 mmol/L,BE -7.23 mmol/L,AG 13.1 mmol/L;予以禁食水(不禁藥)、吸氧、心電監(jiān)護(hù)、止驚、復(fù)合氨基酸營(yíng)養(yǎng)、補(bǔ)液等對(duì)癥處理,同時(shí)口服維生素B6、維生素B12及左卡尼丁。肝功能:TB 44.6 μmol/L(2-21 mmol/L),DB 14.7 μmol/L(0-8 mmol/L),ALT 28.7 IU/L(5-60 U/L),AST 25.1 IU/L(5-60 U/L),腎功能、電解質(zhì)、血糖、CRP及免疫球蛋白正常;凝血五項(xiàng)、Torch、嗜肝病毒、梅毒、HIV、丙酮酸、同型半胱氨酸正常,胸部X線片及頭顱CT正常,急診行腦脊液常規(guī)及生化檢查,排除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染;測(cè)血氨134.8 μmol/L,停止氨類(lèi)攝入,“精氨酸”靜滴補(bǔ)充氨基酸,當(dāng)晚出現(xiàn)呼吸困難,轉(zhuǎn)PICU機(jī)械通氣,同時(shí)復(fù)測(cè)血氨231.8 μmol/L,予以限制氨攝入及促進(jìn)腸道氨排出,未見(jiàn)好轉(zhuǎn),血氨升高至466.0 μmol/L,給予持續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)27 h后,血氨下降至41.1 μmol/L,第三日鼻飼開(kāi)奶后出現(xiàn)病情加重,持續(xù)昏迷,復(fù)測(cè)血氨151 μmol/L,凝血五項(xiàng):PT 32.4 s(10～14 s),INR2.88(0.85～1.45),APTT>180 s(23～40 s),TT>180 s(14～21 s),FBG2.45 mg/L(0～0.5 mg/L),再行CRRT。第四日血串聯(lián)質(zhì)譜提示:瓜氨酸 5.03(9.63～64.17),丙氨酸175.38(102.86～450),精氨酸12.77(1.50～55.00),尿串聯(lián)質(zhì)譜提示:乳清酸0;乳酸-2 233.38(0～4.7),3-羥基丁酸 24.73(0～3.7),丙酮酸-OX 108.47(0～24.0)提示酮癥,考慮為CPS1D,但不能排除N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥,與家長(zhǎng)溝通,征求家長(zhǎng)同意后行基因檢測(cè);第五日,患兒出現(xiàn)對(duì)光反射消失,行頭顱CT提示腦水腫、腦疝及蛛網(wǎng)膜下腔出血(圖1),同時(shí)血常規(guī):WBC 17.7×109,HB 53 g/L,血小板下降至30×109,CRP330 mg/L,使用美羅培南聯(lián)合利奈唑胺抗感染治療及對(duì)癥處理,復(fù)測(cè)血氨上升達(dá)238.5 μmol/L,再次行CRRT。第六日,肝功能:TB 27.4 mmol/L,DB 10.9 mmol/L,ALT 97 U/L,AST 66 U/L,膽堿酯酶 3198 U/L,電解質(zhì):Na+199 mmol/L,Cl-171 mmol/L,K+5.77 mmol/L,持續(xù)葡萄糖水維持中,血糖1.5 mmol/L,于第七日家長(zhǎng)放棄治療,出院后死亡。

圖1 A. 入院第一天頭顱CT:腦實(shí)質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)異常密度影。B. 入院第5天頭顱CT:雙側(cè)大腦半球腦實(shí)質(zhì)密度減低,灰白質(zhì)分界不清,腦溝裂變淺,環(huán)池、腳前池、四腦室明顯變窄、消失,大腦縱裂池、小腦上池密度明顯增高,雙側(cè)側(cè)腦室受壓變窄消失,中線結(jié)構(gòu)無(wú)明顯移位。小腦扁桃體疝入枕骨大孔。蛛網(wǎng)膜下腔出血

基因檢測(cè)結(jié)果:CPS1基因復(fù)合雜合突變:exon11:c.1145C>T:p.P382L ,c.1360-189T>C,經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證分別來(lái)自父親和母親(圖2)。本文中c.1145C> T:p.P382L位點(diǎn)為已報(bào)道的致病突變,c.1360-189T>C位點(diǎn)經(jīng)SpliceAI和varSEAK在線分析平臺(tái)對(duì)變異的剪接功能生物學(xué)危害性預(yù)測(cè)均為陰性,但根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì) (The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南,該變異可評(píng)級(jí)為可能致病性變異: PM2(正常人群變異數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)報(bào)道)+PM3(反式位置有致病變異)+PP1(突變與疾病在家系中共分離)+PP4(臨床表型高度符合)。

圖2 患兒家系的全基因組測(cè)序結(jié)果

討論氨基甲酰磷酸合成酶缺乏癥Ⅰ型(CPS1D;OMIM #237300)是一種常染色體隱性遺傳病,是因尿素循環(huán)中的第一個(gè)限速酶:氨基甲酰磷酸合成酶-1(CPS1)缺乏或者活性降低,導(dǎo)致氨基酸代謝異常而表現(xiàn)的一系列臨床癥狀[6, 18]。該病發(fā)病率低,可起病于任何年齡,大多數(shù)病例起病于新生兒時(shí)期,肝臟代謝異常,以高氨血癥的神經(jīng)癥狀為主要臨床表型,重癥者病情進(jìn)展快,病死率高,難以馬上確診,故臨床確診病例罕見(jiàn)。

本研究分別以“Carbamoyl Phosphate Synthetase 1 Deficiency”和“氨基甲酰磷酸合成酶缺乏癥Ⅰ型”在PubMed以及萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)知網(wǎng)中檢索,時(shí)間限制在2022年3月1日之前,大陸地區(qū)已報(bào)道的文章共16篇,英文發(fā)表的文章有8篇[1-8],中文發(fā)表的文章有8篇[9-16],與21例患兒相關(guān)(排除重復(fù)報(bào)道3例),新生兒期發(fā)病的病例15例,最早發(fā)病時(shí)間為出生后1天;遲發(fā)型病例6例,最遲發(fā)病時(shí)間為11歲9個(gè)月,臨床表型無(wú)特異性,血氨733.3±794.4 μmol/L(81～1404 μmol/L)?；蛲蛔兾稽c(diǎn)共累及32個(gè),其中外顯子31個(gè),內(nèi)含子僅1個(gè),為c.622-3C>G;錯(cuò)義突變24個(gè),無(wú)義突變5個(gè),小片段缺失1個(gè),移框突變1個(gè),剪接突變1個(gè)。包括本文中的突變位點(diǎn),c.1145C>T的錯(cuò)義突變出現(xiàn)頻率最高,共3次;相同位點(diǎn)的復(fù)合雜合突變僅一對(duì),即: Exon19: c.2339G>A; Exon29: c.3520C>T,由此驗(yàn)證了CPS1基因具有的“私有化”特征[4, 17]。經(jīng)OMIN、HGMD網(wǎng)站查詢(xún),本文中的內(nèi)含子c.1360-189T>C的錯(cuò)義突變尚未報(bào)道。

CPS1作為尿素循環(huán)的第一個(gè)限速反應(yīng),催化氨進(jìn)入循環(huán)[12],該酶由CPS1(MIM*608307)基因編碼。CPS1基因位于染色體2q35上,跨度>120kb,包含超過(guò)38個(gè)編碼外顯子的4500個(gè)編碼核苷酸[19],其變異可使CPS1的功能降低或缺失,導(dǎo)致高氨血癥。隨著血漿氨水平的升高,納差、嘔吐、呻吟、驚厥發(fā)作、呼吸窘迫和反常呼吸等呼吸不適的發(fā)生率增加,這些可能是高氨血癥引起的水腫刺激腦干呼吸中樞的結(jié)果[20]。

鑒于許多患者在確診前死亡,CPS1D的確切發(fā)病率尚不清楚,據(jù)估計(jì),日本的發(fā)病率約1/80萬(wàn),芬蘭的發(fā)病率約1/53.9萬(wàn)[6]。在尿素循環(huán)障礙(UCDs)中CPS1D的病死率最高,其次是OTCD和ASA[20]。在新生兒期發(fā)病的CPS1D和OTCD患者中,60%患者在新生兒期能存活,但其中約19%的存活兒在1年內(nèi)因再次或反復(fù)病情發(fā)作而死亡。對(duì)于CPS1D患者,在第一年內(nèi)病情反復(fù)可能高達(dá)8次。即使患者在第一年存活下來(lái),約47%～67%的患者存在發(fā)育遲緩,只有15%～20%的患者發(fā)育正常[21]。發(fā)育遲緩的程度與高氨血癥的峰值濃度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)[18],所以早期診斷及早期治療對(duì)患者至關(guān)重要。

眾所周知,同一疾病不同基因突變的患者可能表現(xiàn)出不同的表型。從表1中可以看出,CPS1D的臨床表型雖無(wú)特異性,但可因病情的輕重緩急而表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。特別對(duì)于新生兒期發(fā)病的患者來(lái)講,發(fā)病早,病情進(jìn)展快,病死率高,如果臨床醫(yī)生對(duì)該病沒(méi)有充足的認(rèn)識(shí),則很難診斷該病。CPS1D的診斷基于血氨升高、瓜氨酸降低、尿液中的乳清酸正?；蜉^低[10]。然而,由于UCDs中的N-乙酰谷氨酸合酶缺乏癥(NAGSD)有著與CPS1D相類(lèi)似的中間代謝物,所以該技術(shù)無(wú)法將CPS1D與NAGSD區(qū)分開(kāi)來(lái)[5],且這些中間代謝產(chǎn)物易受感染、飲食及其他代謝異常等影響[21],故明確診斷需要對(duì)肝臟或小腸組織進(jìn)行酶學(xué)分析,或者進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究[22]。本例患兒有嚴(yán)重高氨血癥伴血、尿串聯(lián)質(zhì)譜典型表現(xiàn),基因分析排除了NAGS基因缺陷,故CPS1D診斷成立。

表1 大陸地區(qū)已發(fā)表的CPS1D患兒首發(fā)表現(xiàn)及基因突變位點(diǎn)

該患兒二代測(cè)序(NGS)僅測(cè)出CPS1外顯子c.1145C>T,來(lái)源于父親,為已報(bào)道致病突變,隨后再次行WGS檢測(cè),得出第二個(gè)突變位點(diǎn),內(nèi)含子c.1360-189T>C,來(lái)源于母親,其哥哥WGS檢測(cè)僅得出CPS1外顯子c.1145C>T的雜合子。經(jīng)OMIN、HGMD網(wǎng)站查詢(xún),內(nèi)含子c.1360-189T>C突變位點(diǎn)未曾報(bào)道。根據(jù)表1,大陸地區(qū)患者中CPS1的突變位點(diǎn)幾乎多位于外顯子,內(nèi)含子突變僅有1例,且深度較淺,本文中的突變位點(diǎn)在內(nèi)含子的較深處。瑞士的Jasmine Isler報(bào)道過(guò)12個(gè)CPS1的內(nèi)含子深部突變,其中最深位置c.3559-745A>G,他對(duì)高度懷疑CPS1D而NGS陰性或者雜合子的患者增加RNA測(cè)序和(或)酶學(xué)分析,確診了多例懷疑該病的病例,還解釋了內(nèi)含子的突變可對(duì)剪接功能有影響[22]。本文中的患兒臨床表型符合CPS1D,ACMG評(píng)估為可能致病,再結(jié)合CPS1基因具有較高的“保守性”,故CPS1的變異極可能導(dǎo)致致病[17, 22],但遺憾的是,家長(zhǎng)拒絕行RNA測(cè)序及肝臟或小腸組織的酶學(xué)分析。表1中所涉及的21位患者中已標(biāo)出基因突變者19例,累及突變位點(diǎn)32個(gè),且僅有1對(duì)相同的復(fù)合雜合突變,大多數(shù)突變并不重復(fù),這表明了CPS1基因突變的“私有化”特征,進(jìn)一步使CPS1D的診斷復(fù)雜化[17]。因此臨床上對(duì)于高度懷疑CPS1D的患兒需行NGS或WGS檢測(cè),同時(shí)需關(guān)注內(nèi)含子深處的突變,必要時(shí)可行RNA測(cè)序及酶學(xué)分析驗(yàn)證診斷。

CPS1D是一種罕見(jiàn)的臨床表型無(wú)特異性的疾病,早期極易誤診為感染性疾病。表1中21例病例在入院時(shí)明確有感染的7例,另外有7例懷疑為感染性疾病。本文患兒在入院時(shí)納差、呼吸節(jié)律改變、反復(fù)驚厥發(fā)作,不能排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,所以使用“苯巴比妥”鎮(zhèn)靜和“復(fù)合氨基酸”營(yíng)養(yǎng)支持治療,但這兩種藥物都會(huì)加重血氨的升高。除此之外,丙戊酸、卡馬西平、托吡酯及左旋門(mén)冬酰胺等亦會(huì)加重血氨升高,所以對(duì)于高氨血癥患者應(yīng)避免使用[4]。CPS1D的病程可呈間歇性發(fā)作,除上述的特殊藥物可誘發(fā)該病發(fā)生外,應(yīng)激狀態(tài)、病毒感染或高蛋白飲食亦會(huì)誘導(dǎo)病情發(fā)作及導(dǎo)致病情惡化[8]。本文中的患兒在第一次CRRT后,血氨已降至正常,但開(kāi)奶后患兒再次出現(xiàn)血氨升高。GRIFFIN 等人曾在模擬實(shí)驗(yàn)中證明CPS1活性低于50%正常值時(shí),在推薦蛋白質(zhì)攝入量下血氨水平增加1倍以上,高蛋白飲食下血氨水平增加3倍以上[23]。腦氨水平的增加會(huì)阻礙星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)鉀的吸收,導(dǎo)致神經(jīng)元吸收鉀增加,從而損害皮質(zhì)的抑制性神經(jīng)傳遞,導(dǎo)致癲癇發(fā)作[23]。

患者昏迷持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)和血氨水平的增加被認(rèn)為是導(dǎo)致發(fā)病率和病死率增加的原因[21]。在死亡的患者中,高血氨狀態(tài)持續(xù)時(shí)間的中位數(shù)為4天半,而存活者中高血氨狀態(tài)持續(xù)時(shí)間的中位數(shù)為3天[20]。該患兒在持續(xù)3天多的高氨血癥后出現(xiàn)了急性肝功能衰竭[24],隨著病情的進(jìn)展,在“肝衰”的晚期并發(fā)了多臟器功能衰竭,如:重癥感染、骨髓造血功能抑制、腦水腫、腦疝、蛛網(wǎng)膜下腔出血及嚴(yán)重的電解質(zhì)紊亂,所以及時(shí)降低血氨被認(rèn)為是預(yù)防不良后果的關(guān)鍵。CPS1D的治療現(xiàn)無(wú)專(zhuān)家共識(shí)和指南參考,主要依據(jù)尿素循環(huán)障礙的治療方案[21]。目前,有幾種新的治療方法正在研發(fā)中,如:N-氨甲酰-L-谷氨酸(NCG)的利用;藥物伴侶增加錯(cuò)誤折疊突變蛋白的穩(wěn)定性;基因治療及黃酮類(lèi)化合物等研制[25]。

總之,本文拓展了CPS1基因突變的基因譜。鑒于CPS1D的非典型癥狀、突發(fā)性、快速進(jìn)展和低發(fā)病率,許多CPS1D患者在確診前已死亡。本文總結(jié)了大陸地區(qū)報(bào)道的兒童CPS1相關(guān)UCDs的臨床和生化特征,提醒臨床醫(yī)生在遇到喂養(yǎng)后出現(xiàn)納差、癲癇發(fā)作和意識(shí)障礙等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)的患兒,需行血氨測(cè)定。一旦確診高氨血癥,應(yīng)合理飲食及避免使用加重高氨血癥的相關(guān)藥物,盡早行血尿串聯(lián)質(zhì)譜分析和NGS,基因檢測(cè)。不能忽略?xún)?nèi)含子的突變,即使檢測(cè)結(jié)果為陰性,但臨床高度懷疑CPS1的患者可行RNA測(cè)序或酶學(xué)檢測(cè)確診;早期診斷、早期治療,有助于降低病死率和改善預(yù)后。由于本文CPS1缺陷例數(shù)少,可能存在觀察偏移。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。