超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定紅芪和黃芪藥材中有效成分含量*

焦 潔，郭建博，鄭 旭，胡萌萌，蔡 虎

（陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710065）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge 的干燥根，是內(nèi)蒙古和甘肅道地藥材。紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrysHand. - Mazz. 的干燥根，是甘肅道地藥材。二者為同科不同屬藥材，均有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫、止汗、托毒排膿及斂瘡生肌功效［1］，但主要成分及藥理作用存在差異。在皂苷類和黃酮類成分方面，黃芪、紅芪分別已分離出125，21個(gè)化合物。黃芪主要有細(xì)胞免疫、降血糖、保護(hù)心腦血管、改善腎功能等作用，紅芪主要有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、抗炎等作用，且二者均有抗免疫、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［2-4］。目前，紅芪的相關(guān)研究報(bào)道和臨床應(yīng)用遠(yuǎn)少于黃芪。本研究中探討了紅芪、黃芪藥材的共有成分和特有成分，為二者的對(duì)比分析及紅芪藥材的推廣提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；SK5200GT 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；MS430TS 型電子天平、XPE205 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司）；Merck Milli-Q超純水儀（默克化工技術(shù)<上海>有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮對(duì)照品（批號(hào)為DST190915012，含量≥98%），芒柄花苷對(duì)照品（批號(hào)為DST190711044，含量≥98%），均購(gòu)于成都德斯特生物技術(shù)有限公司；毛蕊異黃酮苷對(duì)照品（批號(hào)為111920 - 201505，含量≥97.1%），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110773 -201614，含量≥99%），異阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為111698-201103，含量≥99.2%），香草酸對(duì)照品（批號(hào)為110776-201503，含量≥99.8%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；蒙古黃芪（隴海藥材有限責(zé)任公司，批號(hào)為120974 - 202011），武都紅芪（隴南同人紅芪購(gòu)銷有限責(zé)任公司，批號(hào)為20200805），均經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室王西芳教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18柱（200 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min 時(shí)8%A→13% A，1～10 min 時(shí)13%A，10～15 min 時(shí)13%A→20%A，15～18 min 時(shí)20%A→23%A，18～23 min 時(shí)23%A →20%A，23～25 min 時(shí)20%A→13%A，25～27 min 時(shí)13%A→8%A）；流速：0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

取香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷對(duì)照品各適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為403.19，436.59，466.24，488.04，400.82，404.91 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。取紅芪、黃芪藥材樣品粉末各3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30 mL 甲醇，超聲（功率250 W，頻率43 kHz）處理30 min，取出，濾過，用甲醇少量多次沖洗殘?jiān)?，濃縮，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.2 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅰ和Ⅱ［4］。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，表明方法系統(tǒng)適用性良好。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜圖1.Vanillic acid 2.Ferulic acid 3.Calycosin-7-glucoside 4.Isoferulic acid 5.Ononin 6.Calycosin A.Mixed reference solution B.Test solution Ⅰ C.Test solution ⅡFig.1 UPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各適量，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液；取適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系及定量限、檢測(cè)限考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of quantitation and limit of detection

檢測(cè)限與定量限考察：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以信噪比（S/N）為3 和10 時(shí)的待測(cè)成分質(zhì)量濃度為檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果香草酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、異阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮峰面積的RSD分別為1.21%，0.83%，0.52%，0.76%，0.65%，1.02%，均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果前述6種成分峰面積的RSD分別為2.02%，2.63%，4.81%，4.54%，3.18%，4.36%，均小于5.0%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批紅芪藥材樣品3 g，各6 份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果前述6種成分含量的RSD分別為3.05%，3.32%，2.12%，2.73%，2.56%，3.55%，均小于5.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批已知含量的紅芪藥材樣品約1.5 g，精密稱定，平行6 份，置具塞錐形瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取紅芪、黃芪藥材樣品各適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各待測(cè)成分含量，結(jié)果見表3（-為未測(cè)出）。可見，黃芪、紅芪藥材的3 種共有成分含量差異較大，黃芪藥材中毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮含量約分別為紅芪藥材的16 倍和5 倍，紅芪藥材中芒柄花苷含量約為黃芪藥材的4倍。

表3 藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of six components in medicinal material samples（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 樣品處理

黃芪與紅芪藥材樣品的提取一般多采用回流提取法，部分采用萃取法，并應(yīng)用蒸發(fā)光檢測(cè)器測(cè)定［5］。預(yù)試驗(yàn)中考察了甲醇（回流法、超聲法）提取、乙醇（回流法、超聲法）提取，發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑的提取效果較佳，加熱回流提取法和超聲提取法的提取效果相差不大。考慮到超聲提取操作簡(jiǎn)單，溶劑損耗少、耗費(fèi)時(shí)間短，故選擇甲醇超聲提取；同時(shí)考察了提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果當(dāng)提取溫度為25 ℃、提取時(shí)間為30 min、提取1 次時(shí)，提取效果最佳。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)及UPLC 全波長(zhǎng)色譜掃描圖譜分析，測(cè)得紅芪藥材中有機(jī)酸類及黃酮類成分的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)分別約為280，250，230 nm［6-8］。通過對(duì)比分析，紅芪藥材有效成分在250 nm 波長(zhǎng)處峰形較好、分離度及響應(yīng)度也較高，故以250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 樣品含量測(cè)定

本研究結(jié)果顯示，紅芪、黃芪藥材的共有成分為芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷。黃芪藥材中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷的含量顯著高于紅芪藥材，紅芪藥材中芒柄花苷含量顯著高于黃芪藥材。文獻(xiàn)［9］顯示，黃芪藥材中各黃酮類成分含量均高于紅芪藥材，與本研究結(jié)果存在差異，分析原因可能為各藥材產(chǎn)地、采收年限、生長(zhǎng)環(huán)境、生產(chǎn)加工等存在差異［10-12］，但該差異不影響藥材對(duì)比研究方法的確定。

3.4 圖譜分析

本研究結(jié)果顯示，在同一色譜條件下可同時(shí)測(cè)定紅芪藥材中香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷6種有效成分及黃芪藥材中芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷3種成分的含量，且峰形較好、分離度較高，表明此色譜條件可用于2 種藥材的單指標(biāo)及多指標(biāo)成分對(duì)比分析。且黃芪藥材樣品中其余色譜峰峰形也較好，后期可作進(jìn)一步研究。

本研究可為相近種屬藥材成分的對(duì)比研究提供研究思路，可采用同一條件進(jìn)行單一藥材多成分研究與2 個(gè)及以上藥材多指標(biāo)成分對(duì)比研究，研究范圍相對(duì)廣泛。本研究中對(duì)黃芪與紅芪藥材的有效成分進(jìn)行了定量比較研究，以期為二者的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，以更好地促進(jìn)和推動(dòng)中藥黃芪和紅芪資源的合理利用［13-16］。

綜上所述，本研究中所建立的方法可靠，操作簡(jiǎn)單，可為后期紅芪及黃芪藥材的質(zhì)量控制提供參考。