高效液相色譜法同時(shí)測定干姜配方顆粒中5 種成分含量

蔣俊春，孟建升，陳 星，韓知利，肖紅偉

（1. 河南省商丘市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河南商丘 476001； 2. 河南省商丘市食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，河南商丘 476000； 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

中藥配方顆粒為傳統(tǒng)中藥的新劑型，其性味、歸經(jīng)、功效與原中藥飲片一致，方便臨床隨證加減、配方使用，具有無需煎煮、可直接沖服、服用量少、起效迅速、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，相關(guān)產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模。干姜配方顆粒臨床應(yīng)用廣泛，但現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能滿足其發(fā)展需求。2020 年版《中國藥典（一部）》規(guī)定了干姜中6-姜辣素的含量測定方法［1］，文獻(xiàn)［2］亦有報(bào)道。另有文獻(xiàn)報(bào)道了干姜中6-姜酚、8 - 姜酚、10 - 姜酚及6 - 姜烯酚的含量測定方法［3］。本研究中建立了同時(shí)測定干姜配方顆粒中5 種成分含量的高效液相色譜法［4-9］。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000 型高效液相色譜儀（美國Dionex 公司），AUW220D 型電子分析天平（日本Shimadzu 公司，精度為0.01 mg）；F-120ST型超聲波清洗機(jī)（深圳福洋科技集團(tuán)有限公司）。

1.2 試藥

干姜配方顆粒（神威藥業(yè)有限公司、北京康仁堂藥業(yè)有限公司、江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為19110422，18024491，19072641）；姜酮對(duì)照品（批號(hào)為Z09A10C94881）、10-姜酚對(duì)照品（批號(hào)為P20N6F6295）、8 - 姜酚對(duì)照品（批號(hào)為P24A10F96114），均購自上海源葉生物科技有限公司，含量均大于98%；6-姜酚對(duì)照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)為M00118003，含量大于98%）；6-姜烯酚對(duì)照品（阿拉丁試劑<上海>有限公司，批號(hào)為G1915196，含量大于98%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～45 min時(shí)18%A→88%A，45～50 min 時(shí)88%A→100%A，50～60 min 時(shí)100%A→18%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL［10-13］。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別取姜酮對(duì)照品、8 - 姜酚對(duì)照品、6 -姜烯酚對(duì)照品和10-姜酚對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，以80%甲醇溶解并準(zhǔn)確稀釋50倍，得溶液Ⅰ；另稱取6-姜酚對(duì)照品約20 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，同法制備溶液Ⅱ；將上述2種溶液按1∶1（V/V）混合，制成含此5種成分的混合對(duì)照品貯備液，稀釋10倍，即得。

供試品溶液［14-15］：取樣品細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取35 min 后，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下2 種溶液各20 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，理論板數(shù)按各成分峰計(jì)均大于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Zingerone 2.6-Gingerol 3.8-Gingerol 4.6-Shogaol 5.10-Gingerol A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.5，2，5，10，15，30，50 mL，分別置100 mL容量瓶中，用80%甲醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。各取適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=7）Tab.1 Results of the linear relation test（n=7）

精密度試驗(yàn)：取樣品細(xì)粉（批號(hào)為19072641）適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定5次，記錄峰面積。結(jié)果姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6 - 姜烯酚、10 - 姜酚峰面積的RSD分別為1.63%，1.09%，1.37%，1.83%，1.69%（n= 5），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取同一供試品溶液（批號(hào)為19072641）適量，分別于0，1，2，3，5，10，12 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果姜酮、6 - 姜酚、8- 姜酚、6- 姜烯酚、10- 姜酚峰面積的RSD分別為1.85%，1.46%，1.72%，1.36%，1.48%（n= 7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品細(xì)粉（批號(hào)為19072641）6 份，每份0.5 g，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果姜酮、6 - 姜酚、8 - 姜酚、6 - 姜烯酚、10 - 姜酚平均含量的RSD分別為1.68%，1.52%，1.71%，1.60%，1.81%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品細(xì)粉（批號(hào)為19072641）約0.25 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.5 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，各3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表3（-表示未測出）。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of five components in samples（mg/g，n=3）

3 討論

供試品溶液制備方法選擇：由于該制劑是將處方中的藥材加工成流浸膏后再制粒，參考2020年版《中國藥典（一部）》干姜含量測定項(xiàng)下方法同時(shí)提取5 種成分，預(yù)試驗(yàn)中對(duì)提取溶劑、方法、時(shí)間進(jìn)行了考察，分別用50%甲醇、80%甲醇、甲醇回流提取和超聲提取，經(jīng)比較，采用80%甲醇超聲提取35 min，操作簡便，有效成分含量最高。故選擇80%甲醇超聲35 min 作為供試品溶液的提取方法。

色譜條件選擇：同時(shí)測定5 種成分色譜條件的關(guān)鍵為流動(dòng)相。預(yù)試驗(yàn)中流動(dòng)相考察了乙腈-水（62∶38，55∶45，V/V），乙腈-甲醇-水（40∶5∶55，V/V/V）、乙腈-甲醇-磷酸水溶液（45∶5∶50，V/V/V），發(fā)現(xiàn)以乙腈- 水為流動(dòng)相時(shí)分離效果相對(duì)較好，但仍有欠缺，后續(xù)考察發(fā)現(xiàn)以本研究中流動(dòng)相條件梯度洗脫時(shí)，基線平穩(wěn)，各指標(biāo)成分峰形良好。

樣品測定結(jié)果比較：本研究中采用了3個(gè)廠家的干姜配方顆粒樣品，結(jié)果顯示，樣品中各成分的含量差異較大，6 - 姜酚含量均較高，可能原因?yàn)椴煌髽I(yè)使用的干姜產(chǎn)地不同和不同廠家提取工藝有差異；有1個(gè)廠家1 批樣品中未檢出8-姜酚，可能原因是該企業(yè)提取工藝與另外2家存在差異。鑒于中藥是通過多指標(biāo)成分發(fā)揮療效，在生產(chǎn)中應(yīng)盡可能關(guān)注所有成分的變化趨勢(shì)。故建議在干姜配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加姜酮含量測定檢驗(yàn)項(xiàng)目，以進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證用藥安全有效。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測定干姜配方顆粒中5 種成分的含量。