柴芍理氣和胃合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉信秋，李思光，尹安坤，牛海軍，李曉亮，劉旭東，袁如柏△

（1. 安徽省亳州市中醫(yī)院，安徽亳州 236800； 2. 安徽九方藥物研究院有限公司，安徽合肥 230088；3. 安徽省亳州市蒙城縣中醫(yī)院，安徽亳州 233500）

肝氣犯胃型胃脘痛以上腹部胃脘近心窩處疼痛為主要表現(xiàn)［1］，情緒宣泄不暢以致積聚成郁氣是其主要病因。西醫(yī)對(duì)于胃痛多采取對(duì)癥治療，遠(yuǎn)期療效欠佳［2］，而中醫(yī)治療胃脘痛歷史悠久且效果顯著，故可考慮結(jié)合中醫(yī)治療［3-5］。柴芍理氣和胃合劑是我院臨床驗(yàn)方，常用于胃痛的治療。為建立其較準(zhǔn)確、較全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床療效。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)制劑中柴胡、麩炒枳殼、黃芩、浙貝母進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定芍藥苷的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U - 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；SQP 型電子天平（德國(guó)Sartorius公司，精度為0.01 mg）；ZF - 7N 型智能暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；KQ - 100DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島譜科分離材料有限公司）。

1.2 試藥

柴芍理氣和胃合劑（蒙城縣中醫(yī)院制劑室自制，16味組方中藥飲片均購(gòu)于安徽普仁中藥飲片有限公司，并經(jīng)亳州市中醫(yī)院袁如柏副主任中藥師鑒定均為正品；批號(hào)分別為20210501，20210502，20210503，規(guī)格為每瓶250 mL）；柴胡、枳殼、浙貝母的對(duì)照藥材（批號(hào)分別為120992 - 201509，120981 - 201605，120972 -201906），黃芩苷、芍藥苷的對(duì)照品（批號(hào)分別為110715-201821，110736-201943，含量均大于95%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

柴胡：取樣品10 mL，加水飽和正丁醇溶液振搖萃取2 次，每次15 mL，合并正丁醇液，依次用等體積的氨試液和正丁醇飽和的水洗滌，棄去水層，正丁醇液蒸干，加甲醇1 mL 使殘?jiān)芙猓鳛楣┰嚻啡芤?；取柴胡?duì)照藥材0.5 g，加水40 mL，加熱回流1 h，濾過，取濾液，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液；按柴芍理氣和胃合劑處方及工藝制備不含柴胡的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以水-甲醇-三氯甲烷（2∶7∶13，V/V/V）10 ℃下靜置分層后的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以含2%對(duì)甲氨基苯甲醛的40%硫酸乙醇溶液，70 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視［6-7］。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖1.Negative reference solution 2.Reference solution of medicinal materials 3.Reference solution 4-6.Test solution A.Bupleuri Radix B.Bran-Fried Aurantii Fructus C.Scutellariae Radix D.Fritillariae Thunbergii BulbusFig.1 TLC chromatograms

麩炒枳殼：取樣品20 mL，加乙酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，加甲醇1 mL使殘?jiān)芙?，作為供試品溶液；取枳殼?duì)照藥材0.2 g，加甲醇15 mL，超聲（功率100 W、頻率40 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇2 mL 使殘?jiān)芙?，作為?duì)照藥材溶液；按柴芍理氣和胃合劑處方及工藝制備不含麩炒枳殼的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以水- 甲醇- 三氯甲烷（2∶7∶13，V/V/V）靜置分層后的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃加熱約5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視［6，8-9］。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 B。

黃芩：取樣品1 mL，加水稀釋至10 mL，加鹽酸調(diào)pH 至2，加乙酸乙酯振搖萃取2 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，加甲醇2 mL 使殘?jiān)芙?，作為供試品溶液；取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液；按柴芍理氣和胃合劑處方及工藝制備不含黃芩的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以水- 甲酸- 丙酮-乙酸丁酯（1∶1∶3∶5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，置日光燈下檢視［6，10］。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 C。

浙貝母：取樣品20 mL，加濃氨試液2 mL，加三氯甲烷振搖萃取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷萃取液，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使殘?jiān)芙猓鳛楣┰嚻啡芤?；取浙貝母?duì)照藥材2.0 g，加濃氨試液2 mL，加三氯甲烷20 mL，超聲處理20 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，加甲醇1 mL 使殘?jiān)芙?，作為?duì)照藥材溶液；按柴芍理氣和胃合劑處方及工藝制備不含浙貝母的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲醇-濃氨試液-乙酸乙酯（2∶1∶17，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，置日光燈下檢視［6，11-12］。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 芍藥苷含量測(cè)定［6］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min時(shí)12%A→40%A，30～30.1 min時(shí)40%A→12%A，30.1～35 min 時(shí)12%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL［13-17］。

2.2.2 溶液制備

取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為59.2 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取樣品2 mL，置25 mL容量瓶中，加乙醇稀釋，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按柴芍理氣和胃合劑處方及工藝制備缺白芍的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別吸取2.2.2項(xiàng)下3 種溶液各5 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處顯相同色譜峰，且陰性對(duì)照無干擾，表明方法專屬性良好。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)應(yīng)不低于2 000，分離度為8.08，拖尾因子為1.01。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：精密量取已知質(zhì)量濃度（0.0592mg/mL）的芍藥苷對(duì)照品溶液各適量，加乙醇制成質(zhì)量濃度分別為0.008 4，0.016 9，0.033 8，0.067 6，0.168 9 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以芍藥苷質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=129.13X-0.071（R2=0.999 0，n=5）。結(jié)果表明，芍藥苷質(zhì)量濃度在0.008 4～0.168 9 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為0.059 2 mg/mL的對(duì)照品溶液5 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)20210501）2 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.96%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)20210501）適量，平行6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果芍藥苷含量的RSD為0.22%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)20210501），共6 份，每份1 mL，精密加入芍藥苷對(duì)照品適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定及限度確定

取投料的3 批次白芍藥材飲片和3 批樣品適量，分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算芍藥苷含量及轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表2。柴芍理氣和胃合劑成品最低含量范圍為0.334 9～0.338 5 mg/mL，考慮到生產(chǎn)實(shí)際，并保證臨床療效，芍藥苷最低含量限度定為0.35 mg/mL。

表2 樣品含量及轉(zhuǎn)移率Tab.2 Results of content and transfer rate of paeoniflorin in samples

3 討論

3.1 方解

柴芍理氣和胃合劑由柴胡、白芍、醋香附、麩炒枳殼、檳榔、黃芪等16味中藥材組方。方中柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，共為君藥；香附疏肝、行氣、止痛、解郁，麩炒枳殼、檳榔理氣行滯，黃芪、山藥補(bǔ)脾益氣，白術(shù)、薏苡仁健脾燥濕，共為臣藥；姜半夏降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結(jié)，白及收斂止血，黃芩清肝熱燥濕，煅瓦楞子消痰化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、止酸止痛，浙貝母清熱化痰散結(jié)，徐長(zhǎng)卿止痛消腫，均為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏疏肝理氣、活血止痛及止酸止血之功。

3.2 TLC 條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中，曾對(duì)處方中除白芍和煅瓦楞子外的14味藥材進(jìn)行了研究，考察了不同的提取方法、展開劑、薄層板及顯色劑對(duì)TLC 鑒別結(jié)果的影響，排除了專屬性、耐用性不好的鑒別項(xiàng)，最終將柴胡、麩炒枳殼、黃芩及浙貝母4種藥材的TLC 鑒別納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的考察范圍。煅瓦楞子的主要成分為碳酸鈣，目前相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)復(fù)方制劑中碳酸鈣的定性鑒別研究較少，唐蕾等［18］采用離子色譜法，通過測(cè)定制劑中鈣元素的含量，推算出瓦楞子含量，該方法可為柴芍理氣和胃合劑中煅瓦楞子含量的測(cè)定提供參考。

3.3 HPLC 條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中，在210～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)芍藥苷樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在231 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，因此本研究的測(cè)定波長(zhǎng)確定為230 nm。在確定定量檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，首先選擇君藥（柴胡、白芍）中的有效成分作為檢測(cè)指標(biāo)，但由于柴胡藥材定量成分（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）含量限度較低，故本研究選擇目標(biāo)成分單一、穩(wěn)定，且含量相對(duì)較高的芍藥苷作為定量檢測(cè)指標(biāo)；藥理學(xué)研究表明，芍藥苷具有抗抑郁、鎮(zhèn)痛、保肝、調(diào)節(jié)免疫等作用［19］，這與柴芍理氣和胃合劑疏肝理氣、活血止痛的關(guān)鍵功效有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)；芍藥苷為白芍中的有效成分，梅茜等［20］分析預(yù)測(cè)芍藥苷可作為白芍的質(zhì)量標(biāo)志物，作為復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的指標(biāo)成分，其含量能客觀反映白芍藥材及含有白芍的復(fù)方制劑質(zhì)量的優(yōu)劣。基于以上三點(diǎn)，選擇芍藥苷作為定量測(cè)定指標(biāo)。

在耐用性試驗(yàn)中，考察了Thermo Syncronis C18柱，Wonda Cract ODS - 2 柱，Hypersil ODS2 柱（規(guī)格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm）3 種品牌色譜柱，結(jié)果在色譜峰面積、理論板數(shù)、分離度及拖尾因子方面均能滿足耐用性要求，表明色譜柱的改變對(duì)結(jié)果無明顯影響。

本研究中測(cè)定了投料的3 批次白芍藥材飲片中芍藥苷的含量，結(jié)果相差甚微，表明其含量較穩(wěn)定，有利于從投料源頭對(duì)制劑進(jìn)行質(zhì)量控制；制成制劑后，芍藥苷轉(zhuǎn)移率波動(dòng)較小，說明制劑制備工藝較穩(wěn)定。

3.4 方法評(píng)價(jià)

制劑質(zhì)量是保障臨床有效性的關(guān)鍵，柴芍理氣和胃合劑組方藥材多、成分復(fù)雜，故確立評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量的多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)體系有一定意義。本研究中在保障可操作性的基礎(chǔ)上，分別建立了柴胡、麩炒枳殼、黃芩、浙貝母的TLC 鑒別法及芍藥苷的HPLC 含量測(cè)定法，簡(jiǎn)單易行、結(jié)果重復(fù)性較好，可用于柴芍理氣和胃合劑的質(zhì)量控制。