正交試驗(yàn)優(yōu)選吳茱萸湯提取工藝*

安中原，陳育煌，余 巧，申 茹，毛一中

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院·廣東省惠州市藥用植物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東惠州 516025）

吳茱萸湯出自東漢張仲景的《傷寒論》，由吳茱萸、生姜、人參和大棗組方，具有暖肝溫胃、降逆止嘔功效［1］。該方可改善機(jī)體脾胃虛寒或肝經(jīng)寒氣上逆，具有止嘔、抗消化道潰瘍、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用［2-5］，臨床廣泛用于胃炎、胃痛、胃食管反流、嘔吐等消化系統(tǒng)疾病的治療［6-9］。將吳茱萸湯開(kāi)發(fā)成胃內(nèi)漂浮片，可避免煎劑使用不便、不易攜帶和儲(chǔ)存等缺點(diǎn)，還能延長(zhǎng)藥物在胃內(nèi)停留和釋放的時(shí)間，提高其生物利用度。吳茱萸堿和吳茱萸次堿是吳茱萸湯的活性成分［10］，可作為其質(zhì)量控制指標(biāo)。為使處方藥材中活性成分提取最大化，本研究中采用正交試驗(yàn)法，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為考察因素，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的綜合得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化吳茱萸湯的提取工藝，為其胃內(nèi)漂浮片的制備提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；FA2004N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司，精度為0.1 mg）；JA3003 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，精度為1 mg）；KQ - 500VSM 型雙頻靜音型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；B -220 型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；Direct -PureRO 10型純水儀（上海樂(lè)楓生物科技有限公司）。

1.2 試藥

吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)分別為BWB50890和210818）、吳茱萸次堿對(duì)照品（批號(hào)分別為BWB50892和211017），均購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，含量均大于98%；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸、乙醇均為分析純，水為超純水。吳茱萸（批號(hào)為201101）、人參（批號(hào)為20210405）、大棗（批號(hào)為210301）分別產(chǎn)于廣西、遼寧、新疆，均購(gòu)自惠州市百姓大藥房醫(yī)藥連鎖有限公司，生姜（沃爾瑪< 廣東> 商業(yè)零售有限公司港惠新天地店< 惠州> ，批號(hào)為202108），經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院毛一中教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸堿與吳茱萸次堿含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ThermoODS-2Hypersil柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈- 甲醇- 0.1%磷酸水溶液（30∶32∶38，V/V/V）；流速：1 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別取吳茱萸堿、吳茱萸次堿對(duì)照品0.009 9，0.011 2 g，精密稱(chēng)定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品貯備液，精密吸取2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液：按吳茱萸湯處方及工藝取藥材飲片樣品（吳茱萸9 g、生姜18 g、人參9 g、大棗12 枚），精密稱(chēng)定。吳茱萸和人參藥材飲片樣品粉碎，過(guò)2號(hào)篩；生姜和大棗（去核）切碎，加入70%乙醇（1∶20、m/V，下同）回流提取2 次，每次0.5 h，合并濾液，置3 000 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按吳茱萸湯處方及工藝制備缺吳茱萸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜在與混合對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰且分離度高，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Evodiamine 2.Rutecarpine A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線(xiàn)性關(guān)系考察：分別精密吸取吳茱萸堿及吳茱萸次堿對(duì)照品溶液各適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為7.9，9.9，19.8，39.6，79.2，198 μg/ mL 和3.58，4.48，11.2，22.4，44.8，89.6 μg/ mL 的系列對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得吳茱萸堿回歸方程Y1=69.835X1-0.828 7（R2=0.999 9，n=6）和吳茱萸次堿回歸方程Y2=60.406X2+59.497（R2=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，吳茱萸堿、吳茱萸次堿質(zhì)量濃度分別在7.9～198 μg/mL 和3.58～89.6 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為0.57%和0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為1.13%和1.45%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批藥材樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均含量分別為8.78 mg/g和4.12 mg/g，RSD分別為2.32%和1.83%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批已知含量的處方量藥材適量，共9 份，每3 份為1 組，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.1.4 樣品含量測(cè)定

取樣品適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3 次，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均含量分別為8.85 mg/g和4.14 mg/g。

2.2 吳茱萸湯提取工藝優(yōu)選

2.2.1 提取方法考察

按處方量稱(chēng)取藥材6 份，采用超聲法、乙醇回流法提取時(shí)均加入70%乙醇（1∶20，m/V），水煮法提取時(shí)加水；提取時(shí)間均為1 h，均提取1 次，濾過(guò)，置2 000 mL 容量瓶中，分別加70%乙醇或水定容，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。綜合評(píng)分=吳茱萸堿含量×0.65（權(quán)重）+吳茱萸次堿含量×0.35（權(quán)重）。結(jié)果3種方法綜合評(píng)分分別為4.69分、5.04分、2.19分，故選擇乙醇回流法提取。

2.2.2 正交試驗(yàn)

以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、料液比（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）為考察因素，以吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選吳茱萸湯提取工藝。因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the ANOVA

可見(jiàn)，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小依次為A>D>B>C。由表4 可知，4 個(gè)因素對(duì)結(jié)果均無(wú)顯著影響，從節(jié)能增效角度看，最后得吳茱萸湯的最佳提取工藝為A2B3C1D2，即加70%乙醇，料液比為1∶20（m∶V），提取時(shí)間為0.5 h，提取2次。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

取10 倍吳茱萸湯處方量藥材，平行3 份，按上述最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。詳見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the verification test（n=3）

3 討論

3.1 處方藥材量選取

吳茱萸湯處方用量，《傷寒雜病論》中記載為“吳茱萸一升（洗，辛熱），人參三兩（甘溫），生姜六兩（切，辛溫），大棗十二枚（擘，甘溫）。上四味，以水七升，煮取二升，去滓”；《方劑學(xué)》［11］中記載為“吳茱萸9 g、人參9 g、生姜18 g、大棗12枚”。根據(jù)相關(guān)臨床資料，本研究中選擇后一劑量。大棗在處方中無(wú)嚴(yán)格定量，且由于市場(chǎng)中紅棗大小不一，可能影響料液比，參考文獻(xiàn)［12］按單枚紅棗（去核）質(zhì)量3 g，折算本方中大棗質(zhì)量為36 g。

3.2 色譜條件選擇

吳茱萸為方中君藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功，吳茱萸堿和吳茱萸次堿是其活性成分。本研究中對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿的最大吸收波長(zhǎng)為225 nm，吳茱萸次堿的最大吸收波長(zhǎng)為330 nm，在225 nm 波長(zhǎng)處也有明顯吸收，故選擇225 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。采用高效液相色譜法測(cè)定2 種有效成分含量，預(yù)試驗(yàn)中考察不同系統(tǒng)和比例的流動(dòng)相，如0.1%磷酸水溶液（含十二烷基硫酸鈉0.2%）- 甲醇- 乙腈［13］、乙腈水溶液［14］等，最后確定流動(dòng)相采用乙腈- 甲醇- 0.1%磷酸水溶液（30∶32∶38，V/V/V）。在此條件下，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的保留時(shí)間短，分離度高，同時(shí)能避免其他組分的干擾。

3.3 提取工藝優(yōu)選

本研究中考察了分別采用超聲法、回流法、水煮法對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示，乙醇回流法提取活性成分含量更高，超聲法次之，水煮法最低，與吳茱萸湯活性成分醇溶性較高有關(guān)［15］；且方中生姜的主要成分為揮發(fā)油性物質(zhì)，人參和大棗的主要成分為水不溶性物質(zhì)［16］，水煮法不利于上述活性成分的溶出。故最終采用乙醇回流法提取。

綜上所述，本研究中優(yōu)選的工藝操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，可用于吳茱萸湯的提取。