北沙柳株型候選基因表達量與株型相關(guān)性的驗證

賀嶸，趙愷，賀玉嬌，阿拉騰蘇和，王愛君，寧靜，韓若霜，孫貴榮，王瑞平，張國盛*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.鄂爾多斯市造林總場，內(nèi)蒙古 樹林召 014300；3.內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010013；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原種苗總站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；5.鄂爾多斯市林業(yè)和草原局，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010）

植物株型的形成是指植物在生長和發(fā)育全過程中，與其有關(guān)的組織器官發(fā)生的改變。隨著植株的生長，側(cè)生分生細胞會不斷地生長和分化，并逐漸形成自己的器官。這一過程中，通過一個或多個基因的調(diào)節(jié)，使得枝條呈現(xiàn)出不同的形態(tài)，進而影響植株的株型。植物株型是影響生物量和利用效率的關(guān)鍵性狀之一，開展株型定向培育的重要意義，已經(jīng)在農(nóng)作物及經(jīng)濟樹種育種中得到了充分的證明。植物株型多數(shù)是數(shù)量遺傳性狀，由多個彼此獨立或協(xié)同的基因共同決定的，基因表達發(fā)生改變，性狀也會變化。植物基因的調(diào)控功能是多方位的，綜合研究分析對挖掘完善基因功能是十分必要的。李忠南等報道玉米（Zea mays）的分蘗率由4 對主基因與多對微效基因功能決定的［1］。WRKY家族參與調(diào)控植物的生長發(fā)育等生理過程，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中WRKY34與WRKY2共同調(diào)控植物花粉的發(fā)育［2］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子也可以通過調(diào)控HY5的表達來調(diào)控植物下胚軸的生長發(fā)育［3］。在水稻（Oryza sativa）理想型形成過程中克隆得到的IPA1其功能獲得性突變體表現(xiàn)為分蘗數(shù)少、抗倒伏、莖稈粗壯［4］，IPA1不僅可以結(jié)合DEP1來調(diào)控水稻的株型與產(chǎn)量，還可以增強水稻的抗病性［5］。

北沙柳（Salixpsammophila）是“三北”地區(qū)土地荒漠化防治的首選樹種［6］，也是木型材、纖維板、刨花板、造紙、柳編、活性炭等產(chǎn)業(yè)的重要原料。北沙柳的株型呈現(xiàn)直立型、開散型、中間型等特征。不同的利用方式對北沙柳株型的要求不同，作為木材產(chǎn)業(yè)化的原料，理想的株型是通直少（或無）側(cè)枝的直立型；而多分枝開散生長的株型（開散型）對于防沙固土是理想株型。北沙柳纖維短，壁腔比小，細胞壁薄，易打漿成紙，馮文莘等［7］對北沙柳硫酸鹽法紙漿造紙進行了可行性研究。周寶［8］發(fā)現(xiàn)北沙柳漂白硫酸鹽漿和針葉木漂白鹽漿混在一起可以增強紙的撕裂指數(shù)。聶勛載等［9］通過實驗證明了，去皮的北沙柳枝條能生產(chǎn)出品質(zhì)好的瓦楞紙和紙箱板。北沙柳平茬后更新速度快，原材料價格低，枝條直徑小，利于纖維分離，可降低人造板材的成本。內(nèi)蒙古伊金霍洛旗建立了第一個北沙柳刨花板廠［10］。隨著人們對北沙柳的研究的深入，北沙柳的應(yīng)用范圍也越來越廣。如何能夠通過現(xiàn)代生物技術(shù)，結(jié)合北沙柳生物學(xué)特性，開展快速精準(zhǔn)定向化育種，以滿足沙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要是北沙柳資源精細化利用核心技術(shù)之一。

本研究利用定量PCR 技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過分析預(yù)測群體、訓(xùn)練群體、驗證群體基因表達量與冠高比的相關(guān)性，創(chuàng)建基于相關(guān)系數(shù)篩選北沙柳株型后備基因方法，為北沙柳株型定向育種提供理論基礎(chǔ)，具有一定的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究試驗材料全部來自于鄂爾多斯市造林總場沙柳國家林木種質(zhì)資源庫的無性系測定林（2017 年營造）。水培群體均于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室進行培育（平均空氣濕度為60%RH，平均空氣溫度為24 ℃，平均土壤濕度為44%RH，平均土壤溫度為17 ℃，平均CO2濃度為550 g·m-3）。水培裝置主要使用塑料盆等體積較大的容器作為培養(yǎng)容器，但過程中要更換水和營養(yǎng)液、人工供氣或在營養(yǎng)液中加入過氧化氫來解決氧氣供應(yīng)問題。

1.2 研究方法

1.2.1 株型特征的調(diào)查

2020 年9 月和2021 年9 月分別對無性系測定林的株高、冠幅（東西向和南北向）、地徑、萌生枝條數(shù)量、葉片特征等指標(biāo)進行了調(diào)查，計算株型特征值冠高比（平均冠幅與高度之比）。2 年計算獲得的冠高比呈現(xiàn)相同的趨勢，既能體現(xiàn)無性系間的差異，又具有穩(wěn)定性，且具有正態(tài)分布趨勢，是體現(xiàn)株型性狀較理想的特征值（圖1）。

圖1 無性系群體冠高比變化趨勢Fig.1 Trends of crown-to-height ratio in training groups

1.2.2 預(yù)測群體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序分析

2021 年5 月篩選9 個北沙柳無性系，即直立型、中間型、開散型各設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)（直立型12-27，11-30，5-25；中間型7-35，17-12，17-13；開散型13-15，16-36，19-49），分別采集枝條，在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室中進行水培構(gòu)成預(yù)測群體，水培2個月采集嫩莖。

采用TIANGEN RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取RNA。將預(yù)測群體嫩莖的RNA 送到基迪奧生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。為了保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量，在使用信息前要對原始數(shù)據(jù)進行過濾，最終得到clean reads，并將clean reads 進行堿基分析［11］。共檢測出40 049 個基因，已知基因有37 865 個，未知基因有2184 個。并利用RSEM 計算每個樣本中所有基因的表達量，表達量用FPKM 展示［12］。利用Excel 中CORREL 的平方計算所有基因序列FPKM 值與冠高比的相關(guān)系數(shù)作為預(yù)測值，將預(yù)測值按由大到小的順序進行排列。不同基因的預(yù)測值不同，預(yù)測值的變化范圍是0.0～0.9。

將基因reads count 的數(shù)據(jù)使用DESeq2［13］進行差異分析：首先對reads count進行標(biāo)準(zhǔn)化，然后計算假設(shè)檢驗的概率，最后通過多重假設(shè)檢驗進行校正，得到FDR 值?；诓町惙治龅慕Y(jié)果，篩選FDR＜ 0.05 且|log2FC|＞ 1 的基因為差異顯著基因。為了更清晰的進行數(shù)據(jù)分析，可使用火山圖分析，越靠近兩端的基因，差異程度越大。GO 功能分析可以給出基因的GO 功能分類注釋。KEGG 是有關(guān)Pathway 的主要公共數(shù)據(jù)庫。通過Pathway 顯著性富集能確定差異基因參與的主要生化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。蛋白互作關(guān)系是通過差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行分析的。

本試驗是通過直立型與中間型相比，將差異基因進行GO 功能分析與KEGG 通路分析進而篩選北沙柳株型相關(guān)候選基因。

1.2.3 目標(biāo)基因的選擇

為了驗證目標(biāo)基因在訓(xùn)練群體中的表達特征，探討預(yù)測值與北沙柳的株型是否相關(guān)，主要從以下幾個方面選擇目標(biāo)基因。首先選擇已在北沙柳中克隆并驗證與分枝有關(guān)的SpsLAZY1b［14］和SpsTAC2［15］基因。然后將預(yù)測值與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相結(jié)合，選擇與調(diào)控株型有關(guān)的差異基因ZFP4［16］、TB1［17］、SPA2［18］、ABF2［19］、PYL1［20］。最后選擇預(yù)測值較大的ATX1［21］、FHY1［22］和RFK1［23］基因。

將目標(biāo)基因登錄號在數(shù)據(jù)庫Phytozome 13（https：//phytozome-next. jgi. doe. gov/）中進行比對，獲得對應(yīng)的榿柳CDs 序列，將CDs 序列在Primer3Plus（https：//www. bioinformatics. nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）設(shè)計引物（表1），然后由擎科公司（北京）合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 訓(xùn)練群體、驗證群體的構(gòu)建

2021 年7 月按照生長旺盛、病蟲害少且株型特征有明顯變化的標(biāo)準(zhǔn)篩選100 個無性系，標(biāo)記后組成北沙柳訓(xùn)練群體，并采集嫩莖（液氮低溫保存待用）。

將訓(xùn)練群體按照“冠高比的平均值±0.5 倍標(biāo)準(zhǔn)差”分為6 個株型組，每組抽取4 個無性系，共24個無性系作為驗證群體。2022 年7月采取枝條于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室進行水培，作為水培驗證群體；同時2022 年7 月進行野外采樣，作為野外驗證群體，均每隔10 d 進行一次采樣，共采5 次。將采集嫩莖用液氮低溫保存。

1.2.5 基因表達量的測定

采用TIANGEN FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在-80 ℃冰箱中進行保存。以訓(xùn)練群體與驗證群體的cDNA 作為模板，UBQ基因穩(wěn)定性好，在植物中核苷酸序列的同源性在88% 以上，且袁夢如等人已在北沙柳中選擇UBQ作為內(nèi)參基因進行試驗結(jié)果良好，所以選擇UBQ作為內(nèi)參基因［24］，用Roche LightCycler 480 Ⅱ儀器進行定量PCR 測定。反應(yīng)體系為20 μL，程序設(shè)置為95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，45 個循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min；40 ℃ 10 s；3 個重復(fù)，4 ℃保存。

1.2.6 調(diào)控株型最優(yōu)基因組合的篩選

利用SPSS 中秩和分析計算目標(biāo)基因在株型組中的差異顯著性、平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和極值。選擇達到統(tǒng)計顯著水平（P＜0.05）的基因，然后將基因進行隨機組合統(tǒng)計，組合方式為Cmn（m≤n，其中n為顯著水平P＜0.05 的基因數(shù)量，并從n 中隨機抽取m 個基因）。利用多元回歸分析計算每個組合中基因表達量與冠高比的相關(guān)性系數(shù)。并以“基因個數(shù)最少，相關(guān)系數(shù)最高”為原則，初步篩選最佳與調(diào)控株型有關(guān)的基因組合。

1.2.7 高相關(guān)目標(biāo)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING（https：//cn. string-db. org/）對相關(guān)系數(shù)高的目標(biāo)基因分別進行蛋白互作分析。通過分析PPI 圖中蛋白結(jié)構(gòu)信息、蛋白與蛋白之間的相互作用以及蛋白與蛋白間的連接程度，來預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析

通過Pathway 顯著性富集能確定差異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。差異基因GO 功能富集分析得出差異基因主要富集在生物過程和分子功能中。在生物過程中，差異基因在新陳代謝過程、單一生物過程、細胞過程等過程中富集；在分子功能中，差異基因在催化作用、結(jié)合性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性等功能中富集。且下調(diào)的差異基因數(shù)量比上調(diào)的多?；诓町惙治鼋Y(jié)果，以P＜0.05 且|log2FC|＞1 為基礎(chǔ)選擇顯著差異基因。嫩莖中與調(diào)控株型相關(guān)的差異基因有CCD、MYB4、WRKY75、RGA1、TCP12、RFK1、SPA、ATX1、ZFP4、PYL1、ABF、TB1等。

2.2 訓(xùn)練群體中目標(biāo)基因相關(guān)系數(shù)變化特征

采集訓(xùn)練群體的嫩莖進行定量PCR 試驗，驗證目標(biāo)基因表達量與北沙柳冠高比的關(guān)系。在嫩莖中，預(yù)測群體的相關(guān)系數(shù)高于訓(xùn)練群體，但基因表達量具有相同的變化趨勢。預(yù)測值的變化范圍為0.04～0.79，訓(xùn)練群體中相關(guān)系數(shù)的變化范圍為0.05～0.60。ATX1的相關(guān)系數(shù)在兩個群體中均相對較高為0.595 1，TAC2相對較低為0.051 7。FHY1、TAC2表達量與冠高比呈正相關(guān)，其余都呈現(xiàn)負相關(guān)（圖2）。

圖2 嫩莖中目標(biāo)基因表達量趨勢Fig.2 Expression trends of target genes in the axillaries in the hydroponic and training populations

2.3 驗證群體中目標(biāo)基因相關(guān)系數(shù)變化特征

野外驗證群體與水培驗證群體中目標(biāo)基因表達量與冠高比的相關(guān)系數(shù)如表2 和表3 所示。在不同采樣時間下，LAZY1b、ZFP4、TB1、SPA2、ABF2、PYL1、ATX1、RFK1基因與冠高比成負相關(guān)，TAC2、FHY1基因與冠高比成正相關(guān)，這與預(yù)測群體、訓(xùn)練群體結(jié)果一致。預(yù)測值較高的ATX1、FHY1、RFK1基因在驗證群體中，相關(guān)系數(shù)仍然高于其它目標(biāo)基因。

表2 野外驗證群體相關(guān)系數(shù)Table 2 Field validation of population correlation coefficients

表3 水培驗證群體相關(guān)系數(shù)Table 3 Hydroponic validation of population correlation coefficients

2.4 基因組合法

大群體下（訓(xùn)練群體），對目標(biāo)基因進行秩和分析。結(jié)果表明，達到顯著差異（P≤0.05）的有ATX1、TB1、ABF2、FHY1、RFK1、PYL1。將差異基因按照的組合方式進行組合。

ATX1、FHY1在6 個株型組中的差異顯著性如圖3 和圖4 所示。6 個株型組的冠高比依次增大，ATX1基因表達量隨著冠高比的增大而降低，且1組，2、3、4 組與5、6 組基因表達量之間有顯著差異（P＜0.05）；FHY1基因表達量隨著冠高比的增大而增大，且在1 組，3、4 組與5、6 組基因表達量有明顯差異（P＜0.05）。

圖3 ATX1 顯著性分析Fig.3 ATX1 significance analysis

圖4 FHY1 顯著性分析Fig.4 FHY1 significance analysis

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將相關(guān)系數(shù)較高的ATX1、FHY1、RFK1基因進行蛋白互作分析，預(yù)測其功能，置信度為0.7（高等），結(jié)果如圖5所示。

圖5 高相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（a）ATX1 蛋白（b）FHY1 蛋白Fig.5 Highly relevant gene protein interactions network： （a） ATX1 protein and （b） FHY1 protein

在ATX1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，與ATX1直接相關(guān)的基因有HMA5、RAN1、COPT5和HMA6。COPT1-6為銅轉(zhuǎn)運蛋白，ATX1、CCH、CCS為銅伴侶蛋白。銅蛋白CCS可以提供銅離子，ATX1和CCH可將銅離子傳遞給HMA5、RAN1，RAN1再將銅離子整合到乙烯受體里，產(chǎn)生乙烯信號，通過調(diào)控乙烯的合成來影響植物的生長。

在FHY1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，與FHY1直接相關(guān)的是PHYA基因。COP1、PHYA、CRY1基因可以通過調(diào)控光的形態(tài)建成來影響植物的生長。AUX1為生長素受體，F(xiàn)HL為FHY1互為同源蛋白。PIFs是一種光敏色素蛋白，可以與赤霉素信號通路中的DELLA蛋白相互作用來調(diào)控植物的生長發(fā)育。

RFK1被報道是與植物育性恢復(fù)有關(guān)的基因，但與調(diào)控植物生長發(fā)育方面的基因互作較少，數(shù)據(jù)支撐較少，但仍具有一定的參考價值，可能在調(diào)控北沙柳生長發(fā)育方面有著重要作用。

3 討論

3.1 北沙柳株型與目標(biāo)基因相關(guān)系數(shù)的關(guān)系

IGT基因家族是與調(diào)節(jié)分枝角度有關(guān)的一類基因家族，包括LAZY、TAC等基因。在水稻中LAZY1基因調(diào)節(jié)莖向地性反應(yīng)調(diào)控水稻分蘗角度［25］；在擬南芥中，lazy1突變體可增加分枝角度［26］。在桃樹（Prunus persica）中，TAC1 突變后可導(dǎo)致分枝角度變?。?7］。張磊［14］、袁夢如等［15］在北沙柳中分別克隆了SpsLAZY1b、SpsTAC2基因，并驗證了SpsLAZY1b、SpsTAC2與北沙柳的分枝有關(guān)，但實驗結(jié)果表明基因表達量與北沙柳的冠高比相關(guān)性較小。這可能是因為SpsLAZY1b、SpsTAC2在北沙柳株型中為非主效基因，是通過調(diào)節(jié)其他基因間接來影響株型；也可能受內(nèi)源激素的調(diào)控影響基因的表達。

ZFP4、TB1、SPA2、PYL1、ABF2是轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中通過GO 分析及KEGG 富集通路分析篩選出的差異基因，同樣也是在其他物種中已被證明是與植物株型發(fā)育有關(guān)的基因。在北沙柳中可找到對應(yīng)的同源基因。在麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）中赤霉素與細胞分裂素共同作用對TB1起著負調(diào)控的作用，促進側(cè)芽的萌發(fā)［28］；在擬南芥中SPA被認定為紅光和遠紅光受體光敏色素信號傳導(dǎo)過程中的下游負調(diào)控因子，光照強度或紅光、遠紅光降低時，植物的分枝會受到抑制［29］；秦琳琳發(fā)現(xiàn)白樺（Betula platyphylla）中ZFP4基因含有多個脫落酸響應(yīng)順式作用元件，通過調(diào)控脫落酸信號途徑來調(diào)控植物的生長［30］。PYL1與ABF2則可以通過調(diào)控脫落酸的合成來影響植物株型的發(fā)育［31］，這些基因都是通過調(diào)控下游基因或其他途徑間接影響株型。在北沙柳中，水培群體預(yù)測值、訓(xùn)練群體以及驗證群體實驗結(jié)果的趨勢一致，在大群體下（訓(xùn)練群體）相關(guān)系數(shù)在0.0～0.2 范圍之間為低相關(guān)，但有一定的線性關(guān)系，初步預(yù)測這些基因在北沙柳中同樣可以可調(diào)控植物的生長發(fā)育。

FHY1、ATX1、RFK1是與北沙柳株型相關(guān)性高的基因。在大群體（訓(xùn)練群體）中ATX1相關(guān)性最高為0.595 1，RFK1相關(guān)性為0.229 3，相關(guān)系數(shù)在0.2～0.6 范圍之間為中等程度的相關(guān)。FHY轉(zhuǎn)錄因子現(xiàn)已證明是遠紅光信號通路的重要組成部分，在擬南芥中，F(xiàn)HY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)開花時間、枝條分生組織的發(fā)育等重要生命過程中都具有非常重要的功能［32］。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析可知，F(xiàn)HY1可能通過與光敏色素的相互作用來影響北沙柳的株型，也可能在生長素或赤霉素的影響下調(diào)節(jié)北沙柳的株型；銅是植物生長發(fā)育所需的微量元素，ATX1為銅伴侶蛋白，其作用就是供應(yīng)植物生長所需的金屬離子，將過量的金屬離子排出從而達到解除重金屬毒害的作用。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析可知，ATX1可能通過轉(zhuǎn)運銅離子調(diào)節(jié)銅的濃度來影響北沙柳的生長發(fā)育，也可能通過調(diào)節(jié)乙烯信號來影響北沙柳的生長發(fā)育；RFK1目前在北沙柳上未見報道，在本研究中嫩莖部分的RFK1基因與北沙柳的株型相關(guān)性較高，這說明RFK1基因作為北沙柳株型的后備基因作用是不可忽視的。

3.2 水培試驗對北沙柳株型的影響

北沙柳是一種沙生植物，耐干旱。本試驗中，將水培后的北沙柳作為預(yù)測群體進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選目標(biāo)基因。通過訓(xùn)練群體與驗證群體的定量PCR 結(jié)果可知，水培群體與野外群體中目標(biāo)基因與冠高比的相關(guān)系數(shù)差異不大，具有相同的規(guī)律。這說明水培實驗不會影響北沙柳的株型。

在水培試驗中，水培北沙柳的根系潔白光滑，新生不定根較直，二級根較短，木質(zhì)化程度低，因為水環(huán)境中存在低氧脅迫，激發(fā)北沙柳特有的生理生化過程，保證根部缺氧部位獲得氧氣。雖然生理生化過程有所改變，但通過試驗發(fā)現(xiàn)，水培群體與野外群體變化規(guī)律一致。水培技術(shù)，是無土栽培技術(shù)中的一種，其原理是運用現(xiàn)代生物技術(shù)，在不改變植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過外源激素或者環(huán)境脅迫等方式激發(fā)原有生根基因的表達，促使其形成新根。作為一種新型的農(nóng)業(yè)栽培方式，具有以下幾方面的優(yōu)點：（1）植物長勢好，產(chǎn)量高，品質(zhì)好。水培能提供并穩(wěn)定維持作物生長所需的光、溫、水、氣、肥等環(huán)境條件，可充分發(fā)揮作物的生產(chǎn)潛力。相比土培，水培植株生長速度快、長勢強。（2）節(jié)省資源。水培系統(tǒng)避免了水資源與營養(yǎng)液的流失以及被土壤中的微生物吸收固定，節(jié)約資源的同時又提高了肥水的利用率。水培能擺脫土壤的制約，使植物生長不再依附于土壤的限制，擴大種植范圍和空間，節(jié)省土地。（3）病蟲害少。水培技術(shù)是室內(nèi)栽培方式，屬于相對封閉的環(huán)境，在一定程度上可避免外界環(huán)境的傷害，如土壤微生物、害蟲、化學(xué)有害物、重金屬等對植物的傷害。

3.3 預(yù)測群體的構(gòu)建

本試驗是基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用性狀與相關(guān)基因建立北沙柳株型后備基因的篩選。構(gòu)建預(yù)測群體的目的是為了初步得到植物株型與基因表達量之間的相關(guān)性，即以使用較少的樣本，獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)為基本原則，預(yù)測功能基因與性狀之間的相關(guān)性。

北沙柳開散程度不同使其株型多種多樣。本實驗選擇9 個樣本（直立型、中間型、開散型并各設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)）進行了轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果表明，F(xiàn)PKM 值與冠高比的預(yù)測值差異非常大，高的可達到0.9 以上，低的在0.000 1 以下。目標(biāo)基因（SpsLAZY1b、SpsTAC2基因預(yù)測值較小，F(xiàn)HY1、ATX1、RFK1基因預(yù)測值較大，ZFP4、TB1、SPA2、ABF2、PYL1基因的預(yù)測值趨中）在9 個樣本中的預(yù)測值與在大群體中的相關(guān)系數(shù)變化趨勢一致，預(yù)測值大的相關(guān)系數(shù)也大，預(yù)測值小的相關(guān)系數(shù)也小，且在不同采樣時間點下相關(guān)性均與預(yù)測值一致，驗證了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，證明了9 個北沙柳無性系可以用來構(gòu)建預(yù)測群體。

4 結(jié)論

本研究以不同株型北沙柳作為研究材料，構(gòu)建預(yù)測群體、訓(xùn)練群體及驗證群體。選擇ZFP4、TB1、SPA2、PYL1、ABF2、SpsLAZY1b、SpsTAC2、FHY1、ATX1、RFK1為目標(biāo)基因。試驗證明目標(biāo)基因表達量與北沙柳冠高比的相關(guān)性在預(yù)測群體、訓(xùn)練群體以及驗證群體中具有相同的趨勢，可以利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選北沙柳株型候選基因，基因表達量與目標(biāo)性狀相關(guān)系數(shù)越高，功能基因與性狀的關(guān)系越密切。且水培試驗不會改變北沙柳的株型。按照“基因個數(shù)最少，相關(guān)系數(shù)最高”的原則，選擇（ATX1+FHY1）為鑒別北沙柳株型的最佳基因組合。