不同方法提取蠶蛹油的GC－MS分析

林春梅 周鳴謙

(淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，連云港 222005)

蠶蛹(silkworm pupa)又名小蜂、蝶元、蠶女，為蠶蛾科家蠶(Bombyxmori L.)的蛹，是繅絲工業(yè)的主要副產(chǎn)品［1］。蠶蛹營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，其中不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過70%，人體必需脂肪酸α－亞麻酸含量高，不僅具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，而且具有多種藥理作用。我國蠶蛹資源豐富，除少量鮮食外，年均仍有近10萬噸干蠶蛹可供利用。但由于缺乏深加工技術(shù)，這些蠶蛹大部分加工成飼料和肥料或腐敗廢棄，少部分深加工成蠶蛹罐頭、蠶蛹精油、蠶蛹蛋白、多肽、氨基酸、蛹油軟膠囊等，用于食品、工業(yè)、醫(yī)藥、生物防治等領(lǐng)域［2－5］。其中，蠶蛹精油是以新鮮蠶蛹為原料，經(jīng)除雜、除臭等精煉而成，富含不飽和脂肪酸尤其是α－亞麻酸，為醫(yī)藥、保健食品、營養(yǎng)食品及高檔化妝品的優(yōu)質(zhì)原料是近年來開發(fā)研究熱點(diǎn)。

目前，提取蠶蛹油的方法主要包括有機(jī)溶劑浸出法、壓榨法、索氏提取法及超臨界 CO2萃取法等［6－12］。大部分學(xué)者研究重點(diǎn)集中于浸出法和超臨界CO2萃取法工藝方面，對(duì)提取的蠶蛹油中脂肪酸種類和含量研究較少［13－15］。本研究著重于考察索氏提取法和超臨界CO2萃取法對(duì)蠶蛹油提取率、GCMS法分析兩種方法得到的蠶蛹油脂肪酸組成和含量，為高品質(zhì)蠶蛹油工業(yè)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

桑蠶蛹:山東省棲霞市農(nóng)貿(mào)市場購得;CO2(純度＞99.0%)連云港特殊氣體有限公司提供;試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

HA 221－50－06型超臨界萃取儀:南通市華安超臨界萃取設(shè)備有限公司;LX－06A 300g多功能粉碎機(jī):江西省贛州市贛云食品機(jī)械廠;DHG－9035電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HW·YS數(shù)顯恒溫水浴鍋:浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠;索氏提取器:山東甄城永興儀器廠;Agilent 6890N/5973i氣相色譜－質(zhì)譜儀:美國Agilent科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 蠶蛹預(yù)處理

山東省棲霞市農(nóng)貿(mào)市場購得桑蠶蛹，適量溫水洗凈，置電熱鼓風(fēng)干燥箱中60℃烘至含水量低于5%，粉碎，過40目篩，備用。

1.3.2 蠶蛹油的索氏提取法工藝

工藝流程:干燥蠶蛹→粉碎過篩→稱量→裝料→索氏抽提4 h左右→回收石油醚→揮干殘留石油醚→蠶蛹油。

索氏提取操作:精確稱取15 g樣品，濾紙包好置索氏抽提器中，脂肪瓶中加入石油醚150 mL，恒溫水浴溫度設(shè)為50℃，虹吸次數(shù)為8～10次/h，回流提取4 h左右，觀察提取筒中液體顏色變得很淺時(shí)，停止加熱，從抽提管下口滴一滴石油醚于濾紙上，揮發(fā)后不留下油跡，說明抽提完全，回收石油醚，至脂肪瓶中剩余石油醚極少量，置烘箱中60℃過夜，揮干殘留石油醚。重復(fù)3次，計(jì)算得到每份樣品的蠶蛹油提取率，然后計(jì)算平均提取率。

索式提取法蠶蛹油提取率=提取得到的蠶蛹油質(zhì)量/蠶蛹粉質(zhì)量×100%

1.3.3 蠶蛹油的超臨界萃取

工藝流程:干燥蠶蛹→粉碎過篩→稱量→裝料密封→升溫升壓至設(shè)定值→萃取→分離→蠶蛹油。

超臨界萃取:分別精確稱取200 g樣品置于超臨界CO2萃取儀的萃取釜中，在CO2流量為20 kg/h的條件下，設(shè)定不同的萃取壓力，在萃取時(shí)間為120 min時(shí)，各個(gè)壓力下的得率有顯著差別，有助于分析，所以選用120 min作為萃取時(shí)間。通過單因素試驗(yàn)獲得萃取溫度、萃取壓力、分離溫度、分離壓力4個(gè)參數(shù)的大致范圍，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算出每個(gè)處理的平均提取率。

超臨界CO2法蠶蛹油提取率=萃取得到的蠶蛹油質(zhì)量/裝料質(zhì)量×100%

1.3.4 正交試驗(yàn)

以蠶蛹油的提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)。選擇萃取溫度(A)、萃取壓力(B)、分離溫度(分離釜Ⅰ溫度C)、分離壓力(分離釜Ⅰ壓力D)為變量，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)(表1)，每次裝料200 g。CO2流量為20 kg/h，萃取時(shí)間120 min，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算每個(gè)處理的平均提取率。

表1 因素水平表

1.3.5 蠶蛹油脂肪酸GC－MS分析

1.3.5.1 樣品處理

甲酯化:取2滴蠶蛹油于10 mL具塞試管中，加入2.0 mL 5%氫氧化鉀－甲醇溶液搖勻，于60℃恒溫水浴皂化至油珠消失，冷卻至室溫后加入2.0 mL14%三氟化硼－甲醇溶液，搖勻，于60℃恒溫水浴3 min，冷卻至室溫，加入2 mL正己烷，飽和氯化鈉1mL，搖勻、靜置，離心后取其上層溶液用于氣相色譜－質(zhì)譜分析。

1.3.5.2 色譜條件

氣相色譜分析條件:色譜柱:122－7032DBWAX 柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序:170℃以6.0℃/min升至230℃保持 6.0 min;載氣(He)流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量10 μL;分流比10:1。

質(zhì)譜分析條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;接口溫度250℃;離子源溫度200℃;掃描質(zhì)量范圍m/z 33～450，掃描速率150次/min;全掃描方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 索氏提取法提取率

3份15 g樣品，經(jīng)索氏提取，得到的蠶蛹油提取率如表2所示，平均為27.8%。

表2 索氏提取法得到的蠶蛹油提取率

2.2 超臨界CO2萃取蠶蛹油的正交試驗(yàn)

選取L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

采用直觀分析法分析表3數(shù)據(jù)，結(jié)果說明，各因素對(duì)蠶蛹油提取的影響程度依次為A ＞B ＞D＞C，即萃取溫度＞萃取壓力＞分離壓力＞分離溫度。最佳工藝條件為A2B2C2D1，即:萃取溫度40℃，萃取壓力30 MPa，分離溫度50℃，分離壓力10 MPa。采用A2B2C2D1組合工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件下蠶蛹油的提取率為19.22%，高于其他組合，與索氏提取法得到的蠶蛹油提取率相比較低，為此，采用最佳工藝進(jìn)行二次提取，綜合兩次提取結(jié)果，提取率為24.01%，但仍然低于索氏提取法。表4方差分析表明，四種因素對(duì)結(jié)果的影響都沒達(dá)到顯著水平，結(jié)果受因素綜合影響更大一些。超臨界法得到的蛹油顏色明亮黃色，香味更純正。

2.3 蠶蛹油脂肪酸組成及含量分析

蠶蛹油脂肪酸的GC－MS圖見圖1、圖2(扣除了溶劑峰)，蠶蛹油的脂肪酸成分及相對(duì)含量見表5。

從表5中可以看出，索氏提取法得到的蠶蛹油GC－MS分析鑒定出24個(gè)成分，3.23 min處得到正己烷，5.37 min處得到苯，6.86 min處得到二十二烷，12.56 min處得到十五烷;超臨界法得到的蠶蛹油GC－MS分析鑒定出22個(gè)成分，6.84 min處得到十六碳酸，12.55 min處得到2，3－二甲基十七碳烷。除此之外，這兩種方法得到的蠶蛹油GC－MS分析成分基本相同。

表5 索氏提取法及超臨界CO2法得到的蠶蛹油中脂肪酸成分及相對(duì)含量

索氏提取法得到的蠶蛹油飽和脂肪酸主要組成成分:硬脂酸8.16%，軟脂酸18.24%;不飽和脂肪酸主要組成成分:油酸35.69%，亞油酸6.20%，α－亞麻酸26.93%。其中油酸含量最高，其次是α－亞麻酸，總不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.18%。除此之外，還有少量的正己烷0.07%，苯1.25%，疑為對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化處理過程中帶入。超臨界CO2萃取蠶蛹油主要飽和脂肪酸成分:硬脂酸7.66%，軟脂酸18.81%;不飽和脂肪酸主要組成成分:油酸35.86%，亞油酸6.00%，α－亞麻酸28.03%，總不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.15%，較索氏提取法得到的蛹油中不飽和脂肪酸含量稍高。

3 討論與結(jié)論

兩種提取方法相比，石油醚索氏提取法提取蠶蛹油效率高，平均可達(dá)27.80%，超臨界CO2萃取法一次提取率為19.22%，二次提取率可達(dá)24.01%，與索氏提取法相近。兩種方法得到的蠶蛹油經(jīng)GC－MS分析，所含脂肪酸種類基本相同，都為硬脂酸、軟脂酸、花生酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等。各種脂肪酸含量差別不大，其中，超臨界CO2法得到的蛹油中總不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.15%，α－亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.20%，而索氏提取法得到的蛹油中總不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.18%，α－亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.93%。

索氏提取法是一種測定食品中粗脂肪含量的經(jīng)典方法，可將蠶蛹中絕大部分油脂溶出，但此方法一次處理原料量有限，并且需保證蛹粉的干燥，否則所用溶劑會(huì)吸收樣品中水分造成非脂成分溶出，通過這種方法得到的產(chǎn)品純度差，溶劑難以完全揮發(fā)，影響產(chǎn)品后續(xù)的精制。超臨界CO2萃取法是一種新型的無毒溶劑萃取技術(shù)，利用超臨界CO2流體在不同溫度和壓力下利用對(duì)不同物質(zhì)的溶解度差別將其分離，工藝簡單，生產(chǎn)成本低，特別適用于脂溶性、高沸點(diǎn)、熱敏性物質(zhì)的提?。?3］。本研究采用這種技術(shù)得到的蠶蛹油無腥味臭味，色澤亮黃，與索氏提取法得到的黃色半透明，略有腥味的蛹油相比較，更利于實(shí)現(xiàn)精制蠶蛹油的工業(yè)化生產(chǎn)。本課題的研究結(jié)果可為蠶蛹油的開發(fā)利用提供參考。

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