響應(yīng)面法分析丹皮酚與常見(jiàn)酚類(lèi)物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用

劉 建，趙貴紅，王 波，王京雪，于偉東，張大虎，段升霞

（1. 菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，山東菏澤 274000；2. 菏澤學(xué)院化工學(xué)院，山東菏澤 274000；3. 山東大樹(shù)達(dá)孚特膳食品有限公司，山東菏澤 274000）

隨著我國(guó)食品工業(yè)的快速壯大和不斷發(fā)展，單一食品抗氧化劑的應(yīng)用效果已經(jīng)無(wú)法滿足現(xiàn)代人對(duì)高品質(zhì)生活的追求，所以復(fù)配協(xié)同抗氧化劑也逐漸成為當(dāng)前食品生產(chǎn)過(guò)程中使用抗氧化劑的發(fā)展趨勢(shì)，且其協(xié)同抗氧化的作用機(jī)理也已經(jīng)逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[1-4]。如今，為找尋更加合理且高效的復(fù)合型協(xié)同抗氧化劑，人們將更多的精力放在研究這些天然的抗氧化劑間的相互作用上。復(fù)配型抗氧化劑是由2 種及以上的抗氧化劑進(jìn)行不同比例、濃度的配比，用以提高食品抗氧化能力的抗氧化劑。不同的抗氧化劑經(jīng)過(guò)復(fù)配可能會(huì)產(chǎn)生不一樣的效果。如果抗氧化劑復(fù)配合理，就能使其中的組成成分起到協(xié)同作用，進(jìn)而增強(qiáng)該食品的抗氧化能力。反之，則起不到協(xié)同效果。

丹皮酚，別稱(chēng)牡丹酚，是一種小分子酚類(lèi)化合物，提取自牡丹的干燥根皮。據(jù)相關(guān)試驗(yàn)研究表明，丹皮酚具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種對(duì)人體有益的藥理作用[5-6]，且具有多種生物活性。張延龍等人[7]通過(guò)試驗(yàn)，發(fā)明了一種含牡丹酚的牡丹籽油復(fù)合天然抗氧化劑。將牡丹酚、茶多酚、抗壞血酸棕櫚酸酯進(jìn)行復(fù)配，所得的研究結(jié)果表明此3 種物質(zhì)之間產(chǎn)生了明顯的協(xié)同抗氧化作用。由此說(shuō)明，該復(fù)合天然抗氧化劑具有顯著的協(xié)同抗氧化能力，且對(duì)人體不存在毒性損害，具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性等特性，可用于牡丹籽油的生產(chǎn)加工。

阿魏酸、槲皮素、兒茶素等多酚物質(zhì)是從植物體內(nèi)提取的一類(lèi)酚類(lèi)物質(zhì)。這些多酚有著優(yōu)良的抗氧化性，且清除自由基的能力較強(qiáng)[8-10]。它能與多種抗氧化物在生物體內(nèi)相互配合發(fā)揮抗氧化作用，已經(jīng)成為廣受大眾關(guān)注的天然抗氧化劑。石艷賓等人[11]為測(cè)定多酚物質(zhì)的抗氧化活性，以DPPH 自由基清除率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選取了茶多酚、兒茶素、綠原酸和沒(méi)食子酸，并運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)方法，比較這些酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力。結(jié)果表明，這4 種酚類(lèi)物質(zhì)在清除DPPH 自由基方面均表現(xiàn)出較強(qiáng)的能力。且它們之間存在某種程度上的交互作用，但并不明顯。

目前，丹皮酚與其他多酚類(lèi)化合物抗氧化協(xié)同作用的研究較少，其協(xié)同作用效果及機(jī)制尚不清楚，但是將丹皮酚和常見(jiàn)多酚復(fù)配成抗氧化劑，具備較高的可行性，且在果蔬、肉等冷鮮食品的保鮮方面應(yīng)用前景非常樂(lè)觀[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚對(duì)于DPPH 自由基的清除效果并不明顯，但表現(xiàn)出良好的清除ABTS 自由基活性。所以，研究以ABTS 自由基的清除活性評(píng)價(jià)丹皮酚、槲皮素、咖啡酸等的抗氧化活性，以期明確丹皮酚與常見(jiàn)酚類(lèi)物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹皮酚（純度98%），上海源葉生物技術(shù)有限公司提供；槲皮素（純度95%）、芥子酸（純度98%）、抗壞血酸（純度> 99%）、兒茶素（純度≥95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；ABTS（純度98%）、過(guò)硫酸鉀（純度99%）、咖啡酸（純度99%）、對(duì)羥基苯甲酸（純度≥99.5%）、阿魏酸（純度99%）、3,4 -二羥基苯甲酸（純度≥97%），上海麥克林生化科技有限公司提供；無(wú)水甲醇，煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司提供。

V-1200 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司產(chǎn)品；FA2004N 型電子天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；冰箱，海爾智家股份有限公司產(chǎn)品；快速混勻器，江蘇新康醫(yī)療機(jī)械有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ABTS+·清除能力的測(cè)定[2]

ABTS 可與過(guò)氧化鉀發(fā)生反應(yīng)，ABTS 被氧化，生成藍(lán)綠色的ABTS 陽(yáng)離子自由基，該陽(yáng)離子自由基較為穩(wěn)定，在波長(zhǎng)734 nm 處有最大吸收峰，在抗氧化劑的存在下，ABTS+·與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，使陽(yáng)離子自由基褪色。

將0.192 g ABTS（純度98%） 和0.033 g 過(guò)硫酸鉀（純度99%） 分別溶于50 mL 蒸餾水中，再等量混勻，室溫黑暗條件下靜置12~16 h 使其充分反應(yīng)，12~16 h 后將其取出，即可得ABTS 母液，再向母液中加入適量蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊湓?5 ℃，波長(zhǎng)734 nm 處的吸光度為0.70±0.02，即得試驗(yàn)所需的ABTS+·工作液，工作液呈現(xiàn)透明綠色，需避光保存。取0.5 mL 不同濃度的丹皮酚、多酚物質(zhì)或復(fù)配物溶液，分別將其加入已標(biāo)記好的試管中，再分別向各個(gè)試管中加入ABTS+·工作液5 mL（其中空白管加入0.5 mL 蒸餾水，對(duì)照管則用0.5 mL 70%甲醇替代樣品）。室溫黑暗下靜置600 s，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定其吸光度。若樣品具備清除ABTS 自由基的活性，則樣品反應(yīng)溶液吸光度會(huì)低于對(duì)照溶液。試驗(yàn)每份試樣重復(fù)3 次。

1.2.2 丹皮酚與槲皮素等的協(xié)同作用效果

應(yīng)用響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)（CCD）四因素五水平試驗(yàn)考查丹皮酚與槲皮素等的協(xié)同作用效果，四因素分別為槲皮素、兒茶素、阿魏酸與丹皮酚；丹皮酚質(zhì)量濃度分別為3，6，9，12，15 μg/mL；槲皮素質(zhì)量濃度分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 μg/mL；兒茶素質(zhì)量濃度分別為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 μg/mL；阿魏酸質(zhì)量濃度分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 μg/mL。所有試驗(yàn)均做3 次重復(fù)，并利用軟件SPSS 19.0 對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，接著建立多元二次回歸模型，分析該多酚物質(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用。

CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼/μg·mL-1

1.2.3 復(fù)配溶液抗氧化協(xié)同系數(shù)（SE） 計(jì)算

通過(guò)計(jì)算多酚物質(zhì)的復(fù)配溶液抗氧化協(xié)同系數(shù)（SE） 可得知，這些多酚物質(zhì)之間是否具有協(xié)同抗氧化作用。通過(guò)試驗(yàn)可得復(fù)配溶液的清除率（ESC） 及理論清除率（TSC） 的比率，即SE 值。

當(dāng)SE>1，表明該復(fù)配溶液有協(xié)同作用；SE<1，表明該復(fù)配溶液無(wú)明顯的抗氧化協(xié)同作用?？寡趸瘏f(xié)同系數(shù)SE 可由如下公式計(jì)算得知：

理論清除率（TSC） 的計(jì)算如下：

式中：ESC1，…，ESCn——各個(gè)溶液的試驗(yàn)清除率；

n——此評(píng)價(jià)體系中的所用抗氧化劑的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚物質(zhì)抗氧化能力比較

先配制不同質(zhì)量濃度的丹皮酚、槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、抗壞血酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、3,4 - 二羥基苯甲酸試樣，然后依據(jù)1.2.1中所示的試驗(yàn)方法，測(cè)定各個(gè)試樣的吸光度。再根據(jù)吸光度值計(jì)算半數(shù)清除率IC50。

不同多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基的清除率見(jiàn)圖1 和不同多酚物質(zhì)的IC50見(jiàn)表2。

圖1 不同多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基的清除率

表2 不同多酚物質(zhì)的IC50

由圖1 可知，隨著多酚物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，ABTS 自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中，當(dāng)阿魏酸的質(zhì)量濃度上升至15 μg/mL 后，ABTS 自由基清除率變化漸漸趨于穩(wěn)定；當(dāng)槲皮素的樣品質(zhì)量濃度上升至30 μg/mL 后，ABTS 自由基清除率變化不明顯且逐漸趨于穩(wěn)定。該試驗(yàn)對(duì)多酚物質(zhì)抗氧化性能的評(píng)價(jià)，以半數(shù)清除率IC50為指標(biāo)，比較丹皮酚、槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、阿魏酸、抗壞血酸、對(duì)羥基苯甲酸、3,4 -二羥基苯甲酸的抗氧化能力的強(qiáng)弱。文中IC50值可以定義為清除ABTS 自由基50%時(shí)樣品的質(zhì)量濃度，所以IC50值越高，其抗氧化能力越弱，反之則越強(qiáng)。由表2 可知，槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、阿魏酸、3,4 -二羥基苯甲酸的IC50值小于對(duì)照物質(zhì)維C 的IC50值，這些多酚物質(zhì)的抗氧化性均較強(qiáng)。各種多酚物質(zhì)的IC50值由低到高分別為槲皮素、阿魏酸、兒茶素、3,4 -二羥基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸。選取IC50值由低到高排列的前3 位多酚化合物，即槲皮素、阿魏酸和兒茶素，并與丹皮酚進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

2.2 多酚物質(zhì)間抗氧化作用分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)表1 進(jìn)行響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)（CCD），考查丹皮酚、槲皮素、阿魏酸、兒茶素間抗氧化能力的強(qiáng)弱。

CCD 試驗(yàn)結(jié)果及SE 值的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 CCD 試驗(yàn)結(jié)果及SE 值的計(jì)算結(jié)果

由表3 可知，CCD 試驗(yàn)的結(jié)果中，第29 組，即丹皮酚質(zhì)量濃度為3 μg/mL，槲皮素質(zhì)量濃度為2 μg/mL，兒茶素質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，阿魏酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL，復(fù)配協(xié)同系數(shù)SE 大于1。說(shuō)明在合適的濃度下，4 種多酚物質(zhì)有協(xié)同抗氧化作用。

2.2.2 方差分析

將表3 中所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用軟件Design Expert 8.06 進(jìn)行回歸分析。

回歸模型方差與分析見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差與分析

由表4 可知，丹皮酚（A）、兒茶素（C） 的p 值均大于0.005，說(shuō)明這2 種多酚對(duì)清除率的影響不大；但槲皮素（B）、阿魏酸（D） 的p 值接近0.000 1，表明這2 種多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基清除率的影響較明顯。各多酚物質(zhì)間存在某些程度上的交互作用，但均不明顯。多酚物質(zhì)間的交互作用由小到大的順序依次是B 與D、C 與D、A 與C、B 與C、A 與D、A與B。

2.2.3 回歸模型的建立及抗氧化性分析

根據(jù)CCD 試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行回歸分析，并創(chuàng)建全變量二次回歸模型：

ABTS 自由基清除率（%）= 44.35-0.67A+3.30B+1.97C+3.25D-1.19AB-0.37AC-0.61AD-0.46BC-0.04BD-0.36CD+1.25A2-0.63B2-0.17C2-0.30D2.

由表4 可知，模型中p<0.01 時(shí)，表明差異非常明顯；且失擬項(xiàng)p=0.063 1>0.05，表示失擬項(xiàng)不明顯，表明這是適宜丹皮酚、槲皮素、阿魏酸、兒茶素的協(xié)同抗氧化能力的數(shù)學(xué)分析模型?；貧w方程的系數(shù)表現(xiàn)其顯著性。由此可得，對(duì)ABTS 自由基的清除率的影響較明顯的是B，C，D，且影響因素由強(qiáng)到弱依為B，D，C。由于B，C，D 的一次項(xiàng)系數(shù)為正數(shù)，說(shuō)明它們?cè)谇宄鼳BTS 自由基方面存在正相關(guān)性。

2.2.4 響應(yīng)面交互作用分析

利用軟件Design Expert 8.06 對(duì)表3 所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。A 和B 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響見(jiàn)圖2，A和C 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響見(jiàn)圖3，A 和D 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響見(jiàn)圖4。

圖2 A 和B 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響

圖3 A和C 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響

圖4 A和D 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響

由圖2 ~圖4 可知，隨多酚物質(zhì)質(zhì)量濃度的提高，ABTS 自由基清除率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，即其對(duì)清除ABTS 自由基的能力逐漸增強(qiáng)。圖2 ~圖4 為多酚物質(zhì)兩兩之間的交互作用響應(yīng)曲面圖，可直觀地觀察到多酚物質(zhì)的響應(yīng)值變化。這幾組響應(yīng)曲面圖表現(xiàn)出，該4 種多酚物質(zhì)在清除ABTS 自由基方面都有影響。同時(shí)，由于各個(gè)響應(yīng)曲面圖的坡度不同，表明這4 種多酚物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基清除率的影響強(qiáng)度不同。在該響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中，復(fù)配組合第29組，即丹皮酚質(zhì)量濃度為3 μg/mL，槲皮素質(zhì)量濃度為 2 μg/mL，兒茶素質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，阿魏酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL，SE 值大于1。4 種多酚物質(zhì)在合適的質(zhì)量濃度下，能達(dá)到明顯的協(xié)同作用，進(jìn)而加強(qiáng)了丹皮酚的ABTS 自由基的清除能力。

3 結(jié)論

槲皮素、咖啡酸、兒茶素、芥子酸、阿魏酸、3,4 -二羥基苯甲酸對(duì)清除ABTS 自由基的能力高于對(duì)照物質(zhì)維C。丹皮酚與槲皮素、丹皮酚與兒茶素、丹皮酚與阿魏酸、槲皮素與兒茶素、槲皮素與阿魏酸、兒茶素與阿魏酸對(duì)ABTS 自由基清除率存在負(fù)相關(guān)作用。第29 組，即丹皮酚質(zhì)量濃度為3 μg/mL，槲皮素質(zhì)量濃度為2 μg/mL，兒茶素質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，阿魏酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL，SE 值大于1，4 種多酚在合適的質(zhì)量濃度下，能達(dá)到明顯的協(xié)同作用，進(jìn)而加強(qiáng)丹皮酚的ABTS 自由基清除能力。研究需要在后續(xù)的工作中優(yōu)化丹皮酚、槲皮素質(zhì)量濃度、兒茶素質(zhì)量濃度和阿魏酸的復(fù)配質(zhì)量濃度，明確其協(xié)同作用機(jī)制。