響應面法優(yōu)化低咖啡因紅茶工藝及其品質分析

王熙瀅，吳 點，劉雅杰，汪 鵬，王平航，胡長玉

（黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽屯溪 245041）

如今，食品的健康問題越來越受人們的關注，對健康的質量要求也變得越來越高[1]。紅茶富含茶多酚、茶色素、茶多糖、茶蛋白、茶氨酸和咖啡因等功能成分，具有抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗疲勞、抗輻射、抗齲齒、消除重金屬毒害、代謝調節(jié)和生理調節(jié)、美容、抑制有害微生物、增強記憶及改善大腦功能等[2]醫(yī)療保健功效。

咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，具有提神和抗疲勞效果，是世界上使用最普遍的中樞神經興奮劑。目前，消費品市場上咖啡、茶、軟飲料及能量飲料十分暢銷的原因也是因為含有咖啡因成分[3]?？Х纫蜃鳛椴枞~中的主要呈味物質之一，咖啡占茶葉干物質總含量的2%~5%[4]。經常攝入高劑量的咖啡因會刺激中樞神經、影響睡眠、增加血壓、提高類風濕關節(jié)炎的患病率、引起嬰兒早產等[5-8]。對于兒童、哺乳期婦女及某些病患者來說，茶葉中的咖啡堿成了他們望茶生畏的主要原因[9]。因此，如何盡可能地脫除紅茶中咖啡因具有一定的研究價值。

目前，脫咖啡因技術主要有水脫除、溶劑萃取、吸附分離和超臨界CO2萃取等傳統(tǒng)方法，以及后來發(fā)展的微生物和酶法降解咖啡因、培育低咖啡因茶樹等[10]。研究表明，對于茶鮮葉、蒸青葉或萎凋葉在85 ℃的熱水中快速浸取1 min，咖啡堿脫除率達71%，浸取3 min 后，咖啡堿的脫除率達83%，說明提高浸取時間可能會提高咖啡堿脫除率[11]。研究表明，加溫2~3 min，熱水溫度從80 ℃上升到90 ℃[12]，咖啡堿的脫除率可以從60.51%提高到72.26%，以1∶20 的茶水比于100 ℃下浸泡3 min，可脫除83%的咖啡因，而鮮葉中保留了95%的兒茶素。由于熱水高溫處理會導致茶鮮葉中多酚氧化酶失活，在揉捻及發(fā)酵酶活性難以達到制作紅茶要求[13-14]，為了提高紅茶中咖啡因脫除率，保持紅茶品質，以紅茶為研究對象，通過單因素試驗及響應面試驗優(yōu)化制作低咖啡因紅茶工藝，并對其品質進行分析，旨在為低咖啡因紅茶的制作工藝提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶鮮葉，谷雨前購于休寧榮山茶廠；多酚氧化酶（食品級生產批號21096582 酶活度10 000 U/g），青島隆川生物科技有限公司提供。

鹽酸、咖啡因、氧化鎂、甲醇（分析純），太倉滬試試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

手提式萬能粉碎機，濟寧凌琛機械設備有限公司產品；發(fā)酵箱，廣州市尼科機械設備有限公司產品；QYGDW-s10a 型真空干燥箱，上海琦意工業(yè)設備有限公司產品；高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產品；電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公公司產品；恒溫水浴鍋，上海聲彥超聲波儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

低咖啡因紅茶工藝流程圖見圖1。

圖1 低咖啡因紅茶工藝流程圖

1.3.2 操作要點

（1） 萎凋。將采摘的鮮葉在15~23 ℃下萎凋6~8 h，攤葉厚度12~15 cm ，翻葉頻次2 h /次，得到萎凋葉。

（2） 熱水浸提、脫水。將萎凋葉浸泡在一定溫度的水中一定時間后撈出脫水得到處理葉。

（3） 加酶。用一定濃度的多酚氧化酶液噴灑處理葉，表面濕潤為宜，空白組噴灑蒸餾水。

（4） 揉捻。將萎凋葉與處理葉按一定比例混合揉捻0.5 h，從同一個方向先空揉再加壓，成塊后抖開再重復之前操作，利于保持芽葉完整性。

（5） 發(fā)酵。將經揉捻處理的二次處理葉置于溫度30 ℃的恒溫發(fā)酵室，攤葉厚度6~8 cm，保持濕度95%以上發(fā)酵5 h。

（6） 干燥。用烘干機分2 次烘干。在第1 次烘干結束后，待茶葉冷卻回潮后再進行第2 次烘干。

（7） 篩分。用4.5 目和14 目的平圓篩機對毛茶的頭腳進行分揀，除去過大的頭茶和過小的碎茶。利用風力通過風力分離器去除淡黃色片狀、碎片等。

（8） 挑揀。主要為人工挑揀。挑去紅茶中風選后留下的紅片、紅筋、黃片等影響紅茶品相的低等茶。

（9） 提香。于70~80 ℃條件下提香2 h。

1.4 咖啡因脫除率的測定

1.4.1 標準曲線的繪制

（1） 標準液的制備。稱取咖啡因125 mg（純度不低于99%），按1∶4 的比例加入乙醇和蒸餾水，溶解并定容至250 mL，搖勻，相當于每1 mL 標準儲備溶液含0.5 mg 咖啡因，吸取1.0，2.0，5.0，10.0 mL 上述標準儲備液，分別加蒸餾水定容至50 mL 作為系列標準工作液，每1 mL 該系列標準儲備液中，分別相當于含10，20，50，100 μg 咖啡堿。

（2） 處理液的制備。稱取1.0 g 的制備的紅茶樣葉，磨碎后置于500 mL 燒杯中，加入氧化鎂4.5 g，加入300 mL 沸水，沸水浴加熱20 min，每隔5 min晃動燒瓶搖勻。沸水浴完成后，立即轉入抽濾機中進行過濾，將濾液移入500 mL 容量瓶中，冷卻后用蒸餾水定容，混勻制成處理液待測。

（3） 繪制標準曲線。取適量咖啡因標準液置于HPLC 進樣瓶中，分別以咖啡因標準液質量濃度為5，10，25，50 μg/mL，按照高效液相色譜條件為檢測波長：紫外檢測器，波長280 mm；流動相：取600 mL 甲醇加入1 400 mL 蒸餾水，混勻，過0.45 μm膜；流速0.5~1.5 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10~20 μL 進行測定。以咖啡因標準液質量濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程，得到標準曲線的回歸方程為：Y=96.892X+523.64（R2=0.992 7）。

1.4.2 咖啡因含量的計算方法

參照GB/T 8312—2013，對標準樣品和處理樣品的峰面積進行定量，將茶葉中咖啡因的含量表示為干態(tài)質量分數，再根據標準曲線測定咖啡因含量，計算方法如下：

式中：C1——根據標準曲線上計算得出的測定液中咖啡堿質量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

m——試樣的質量，g；

ω——試樣干物質含量（質量分數），%。

1.4.3 咖啡因脫除率的計算

1.4.4 感官評分的測定

按照國標GB/T 23776—2018，從干茶外形、香氣、滋味、葉底和湯色5 個方面對茶葉進行專業(yè)品評，采用百分制評分。

茶葉感官評分標準見表1。

表1 茶葉感官評分標準

1.4.5 產品品質指標的測定

氨基酸含量：按GB/T 8314—2013《游離氨基酸總量的測定》執(zhí)行。

總糖：采用蒽酮比色法測定總糖的含量。

1.5 單因素試驗設計

1.5.1 浸提溫度對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，按萎凋葉與處理葉比例1∶2 制作紅茶，其中處理葉按固定熱水浸提時間30 s，多酚氧化酶添加量2%，考查燙漂溫度（50，60，70，80，90 ℃） 對制作完成后的紅茶咖啡因脫除率以及感官評分的影響。

1.5.2 浸提時間對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，其中固定熱水浸提溫度70 ℃，萎凋鮮葉與處理葉質量比為1∶2，多酚氧化酶添加量2%，考查熱水浸提時間（0，15，30，45，60 s） 對紅茶咖啡因脫除率以及感官評分的影響。

1.5.3 萎凋鮮葉與處理葉的質量比對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，其中固定熱水浸提時間30 s，熱水浸提溫度70 ℃，多酚氧化酶添加量2%，考查萎凋鮮葉與處理葉質量比（0∶1，1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4） 對紅茶咖啡因脫除率以及感官評分的影響。

1.5.4 多酚氧化酶添加量對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，固定熱水浸提工藝條件為溫度70 ℃，萎凋鮮葉與處理葉質量比為1∶2，浸提時間30 s。在茶堆上噴灑多酚氧化酶溶液后進行揉捻，探討不同添加量（0，2%（酶活度200 U/g），4% （酶活度400 U/g），6% （酶活度600 U/g），8%（酶活度800 U/g）） 的多酚氧化酶液對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響。

1.6 響應面試驗優(yōu)化

以單因素試驗結果為參考，采用Box-behnken中心組合試驗設計原理，選取浸提溫度（A）、浸提時間（B）、萎凋鮮葉與處理葉的質量比（C） 3 個因素作為自變量，以咖啡因脫除率為評價指標。分別以A、B、C 為代表，將每一個自變量的低中高試驗水平分別以-1，0，1 進行編碼，將咖啡因脫除率（Y） 記為響應值，采用三因素三水平試驗設計，優(yōu)化低咖啡因紅茶加工工藝。

響應面試驗設計的因素與水平設計見表2。

表2 響應面試驗設計的因素與水平設計

1.7 數據處理

所得試驗數據為3 次重復試驗所得數據的平均值。Excel 2016 用于數據統(tǒng)計，Origin pro 2018 用于數據繪制，Expert-Design 10.0 用于響應面優(yōu)化分析、回歸模型方差分析和顯著差異分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 浸提溫度對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

浸提溫度對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響見圖2。

圖2 浸提溫度對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

由圖2 可知，隨著溫度的升高咖啡因脫除率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在70 ℃達到最大值51.82%±1.41%。因為隨著溫度的提升，咖啡因會在熱水中迅速溶解、浸出，使得茶葉中的咖啡因含量不斷減少，脫除率升高[15]。但是，當溫度高于70 ℃時，咖啡因脫除率變化不顯著，同時高溫會使多酚氧化酶失活，從而使兒茶素不能被氧化成茶紅素，使紅茶色澤受到影響，造成紅茶感官評分下降。綜合考慮，選擇70 ℃作為浸提溫度是較適宜的。

2.1.2 浸提時間對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

浸提時間對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響見圖3。

圖3 浸提時間對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

由圖3 可知，隨著浸提時間的增長，紅茶咖啡因脫除率及感官品質呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在30 s 達到最大值?？赡芤驗樵谝欢ǖ臅r間內，咖啡因會在熱水中迅速浸出，咖啡因脫除率不斷升高，一旦時間過長，茶葉由于升溫收縮，導致茶葉中的咖啡因脫除率下降。同時，隨著浸提時間的延長，茶湯顏色變深，影響其感官品質，因此浸提時間不是越長越好，浸提時間30 s 較為適宜。

2.1.3 萎凋鮮葉與處理葉的質量比對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

萎凋鮮葉與處理葉的質量比對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響見圖4。

圖4 萎凋鮮葉與處理葉的質量比對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

由圖4 可知，萎凋鮮葉和處理葉的質量比對紅茶咖啡因脫除率和感官評分存在顯著性影響（p<0.05）。咖啡因脫除率隨著萎凋鮮葉和處理葉質量比的增大出現(xiàn)逐漸升高的趨勢，因為鮮葉中咖啡因很容易從熱水浸出，咖啡因的脫除率與處理葉的量密切相關。但是隨著處理葉質量的增加，感官評分呈下降趨勢，因此，萎凋鮮葉和處理葉的質量比確定為1∶2 較為合適。

2.1.4 多酚氧化酶添加量對感官評分和咖啡因脫除率的影響

多酚氧化酶添加量對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響見圖5。

圖5 多酚氧化酶添加量對紅茶咖啡因脫除率及感官評分的影響

紅茶中的茶黃素具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗癌等多種生物活性功能。由圖5 可知，多酚氧化酶添加量高于2%時對紅茶咖啡因脫除率的影響不顯著。研究表明，多酚氧化酶會降解茶葉中的咖啡因，使得咖啡因的脫除率上升，但是隨著多酚氧化酶添加量的增加，咖啡因脫除率變化不顯著。綜上所述，添加2%的多酚氧化酶較為適宜。

2.2 響應面優(yōu)化結果分析

綜合單因素試驗結果，為了優(yōu)化咖啡因的最大脫出率，選取浸提溫度（A）、浸提時間（B）、萎凋鮮葉∶處理葉（C） 為自變量，以咖啡因脫除率為指標進行三因素三水平Box-behnken 響應面試驗設計。

Box-behnken 試驗結果見表3。

表3 Box-behnken 試驗結果

用Design Expert 軟件對表3 中數據進行分析，得到三因素與咖啡因脫除率之間的二次多項回歸模型方程為：

2.2.1 響應面試驗方差分析

模型回歸方程及方差分析見表4。

表4 模型回歸方程及方差分析

由表4 可知，模型p<0.000 1，呈現(xiàn)出極顯著差異，說明回歸模型對咖啡因脫除率具有很好的預測性。模型決定系數R2=0.995 3>0.95，模型修正決定系數R2Adj=0.989 2，說明回歸模型可信度高，并且與實際試驗所得數據擬合情況較好，呈現(xiàn)高度相關性；失擬項p=0.387 3>0.05，不顯著，說明模型研究以外的因素對咖啡因脫除率的影響較小。單因素A、C、AB、AC、A2、B2、C2對咖啡因脫除率的影響極顯著（p<0.01），B、BC 影響不顯著（p>0.05）。由顯著性檢驗F、p 值的大小得出各因素對咖啡因脫除率影響的順序為萎凋鮮葉與處理葉質量比（C） >浸提溫度（A） >浸提時間（B）。綜上所述，可以用該模型回歸方程分析和預測咖啡因脫除率工藝的結果，具有一定的實用性。

2.2.2 響應面面圖分析

各因素的交互作用顯著情況，可根據曲面圖進行分析，曲面的傾斜程度與顯著性呈正相關。響應面圖顯示了浸提溫度、浸提時間、萎凋鮮葉與處理葉質量比三因素之間的交相互作用對咖啡因脫除率的影響。采用Design Expert 11 軟件對影響紅茶咖啡因脫除率的3 個因素進行交互分析。

各因素交互作用對紅茶咖啡因脫除率的影響響應面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對紅茶咖啡因脫除率的影響響應面圖

3 個響應因素與紅茶咖啡因含量之間形成的響應曲面坡度均較陡，表明該3 個因素對咖啡因脫除率的影響較大，同時隨著浸提時間、浸提溫度和萎凋鮮葉與處理葉質量比的增加，紅茶的咖啡因脫除率先下降后上升。等高線呈橢圓形，表明所研究因素之間的交互作用顯著。AC 兩因素的傾斜程度最大，BC 兩因素的傾斜程度次之，AB 兩因素傾斜程度最小，表明浸提溫度和萎凋鮮葉與處理葉的質量比這2個因素之間對紅茶咖啡因脫除率的交互影響最顯著。

2.2.3 最佳工藝條件確定及驗證試驗

依據Design Expert 11 軟件，以咖啡因脫除率為指標，將模型進行最優(yōu)分析，確定低咖啡因紅茶最佳生產工藝參數為熱水浸提溫度71.57 ℃，浸提時間29.25 s，萎凋鮮葉∶處理葉質量比1∶2.133 7（g∶g），此時的咖啡因脫除率為52.87%?？紤]到實際情況，將最佳工藝參數修正為72 ℃，浸提時間為30 s，萎凋鮮葉∶處理葉質量比為1∶2（g∶g），在此條件下進行驗證試驗，所得紅茶的咖啡因脫除率為53%，與模型預測值接近，證明工藝參數具有準確性，試驗的優(yōu)化條件可行。

2.2.4 紅茶品質分析

不同處理方式對紅茶品質的影響見圖7。

圖7 不同處理方式對紅茶品質的影響

由圖7 所知，對照組、熱水浸提處理、熱水浸提+多酚氧化酶處理對紅茶感官品質、總糖、咖啡因含量及氨基酸含量產生了不同程度的影響。熱水浸提處理組與對照組相比，紅茶的感官品質有所提升，總糖含量、氨基酸含量及咖啡因含量均降低。采用熱水浸提+多酚氧化酶處理可提高紅茶總糖及氨基酸含量，改善紅茶感官品質，降低紅茶咖啡因含量。熱水浸提處理和熱水浸提+多酚氧化酶處理對紅茶咖啡因含量影響不顯著，兩者咖啡因含量相比于對照組分別下降了51%，51.6%。因此，熱水浸提+ 多酚氧化酶處理不僅可以改善紅茶感官品質，提高總糖、氨基酸含量，還顯著降低了咖啡因含量，在此條件下紅茶咖啡因含量僅為1.58%，符合低咖啡因紅茶的標準。

3 結論

以茶鮮葉作為原料，以紅茶中咖啡因含量為響應值，通過單因素試驗和響應曲面法確定低咖啡因紅茶制作的最佳工藝參數為浸提溫度72 ℃，浸提時間30 s，萎凋鮮葉與處理葉質量比為1∶2（g∶g），多酚氧化酶添加量為2%，在此最優(yōu)條件下制備的紅茶咖啡因脫除率為53%，咖啡因含量為1.58%，氨基酸含量為0.36%，總糖含量為2.82%。所制作的低咖啡因紅茶外形較為較細緊，尚烏潤，尚勻整，凈度尚好，具有純正的香氣和香醇的滋味，葉底尚嫩，多筋，尚紅亮，且茶湯色澤尚紅亮。