三氟苯嘧啶在揚稻6 號和南粳46 水稻上的內吸與傳導能力比較

徐王瑾, 楊春梅, 繆心憶, 范添樂, 孟志遠, 陳小軍

(揚州大學 植物保護學院/農業(yè)與農產品安全國際合作聯合實驗室 (揚州大學)，江蘇 揚州 225009)

三氟苯嘧啶是杜邦公司 (現科迪華) 研制的新型介離子嘧啶酮類殺蟲劑，為煙堿乙酰膽堿受體抑制劑，現已在亞太地區(qū)廣泛登記[1]。三氟苯嘧啶主要用于水稻害蟲防治，也可用于棉花、玉米和大豆等作物。田間試驗證實，三氟苯嘧啶能高效防治稻飛虱和葉蟬等害蟲，速效性好，且持效期長[2]。在生產上，作用于煙堿型乙酰膽堿受體的殺蟲劑如呋蟲胺、吡蟲啉和啶蟲脒等在田間防治稻飛虱方面發(fā)揮了關鍵作用[3-4]，然而，由于這些殺蟲劑的濫用，其對稻飛虱的防治效果迅速下降[5]。新煙堿類殺蟲劑作用于昆蟲煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)，能引起急性興奮性癥狀，而三氟苯嘧啶是對nAChR 有抑制作用的殺蟲劑，與新煙堿類乙酰膽堿受體激活劑靶點相同，但作用相反。三氟苯嘧啶可導致稻飛虱中毒而昏睡，有較高的選擇性，對包括傳粉媒介在內的非目標生物體的影響也很小[6]。

不同水稻品種因生態(tài)和生理上存在差異，從而會導致其對外源物質的吸收和轉運有所不同，同時也會影響農藥到達作用靶標的時間[7]，因此，不同品種的水稻對農藥的吸收和利用存在較大差異。此外，不同品種的水稻對氮的利用率也不同。在低氮脅迫下，氮高效利用品種仍能夠獲得較高的有效穗數和千粒重，從而達到高產[8]。關于不同品種水稻對農藥的利用率已有一些研究報道，如陳志廷等研究了華南地區(qū)51 個水稻品種對呋蟲胺的利用率，找到了對呋蟲胺具有高效吸收利用和定向積累于病蟲害為害部位的主推水稻品種，有利于實現農藥的減施增效[9]。農藥在植物體內的內吸傳導特性與其施用方法和施用效果密切相關[10]。內吸性農藥可通過植物的根系和葉片吸收，在植物體內達到一定劑量后才能有效地防治有害生物[11]。揚稻6 號主要適宜生長在長江中下游及南方一季中秈稻地區(qū)，目前作為我國兩系雜秈應用面積最大的恢復系[12]，而南粳46 是江蘇省育成的優(yōu)質高產晚粳品系[13]，這兩種水稻在生產上都有重要的應用價值。然而，不同水稻品種之間理化性質差異較大，可能會影響其對農藥的內吸傳導特性。合理利用和改善農藥在植物體的內吸傳導特性，可大幅提高農藥在靶標部位的積累并減少農藥對環(huán)境的污染[14]。

目前，關于三氟苯嘧啶的研究主要集中在水稻生態(tài)系統(tǒng)的殘留及消解規(guī)律方面[15-16]，鮮有關于不同水稻品種間對三氟苯嘧啶內吸傳導差異的研究報道。鑒于此，本研究以揚稻6 號和南粳46 作為供試水稻，探究了三氟苯嘧啶在不同品種水稻中內吸、傳導能力的差異，以期為提高農藥利用率提供數據支持和研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日立LC-2000 高效液相色譜儀 (日本Hitachi公司)；SB25-12DTN 超聲波清洗機 (寧波新芝生物科技公司)；AUY120 電子天平 (日本島津公司)；RXZ 型智能人工氣候箱 (寧波江南儀器廠)；H/T-16MM 臺式高速離心機 (湖南赫西儀器裝備公司)；Milli-Q 超純水器 (美國Millipore 公司)；HY-2 漩渦混勻儀 (上海儀電科學儀器公司)；DCY-12S 水浴式氮吹儀 (青島海科儀器公司)；CX21 生物顯微鏡 (日本奧林巴斯株式會社)；接觸角測量儀 (美國KINO 公司)。

97%三氟苯嘧啶 (triflumezopyrim) 原藥，由揚州大學農藥實驗室研制并提純；乙腈 (色譜純，美國Tedia 公司)；其余試劑為國產分析純。

1.2 試驗材料

供試水稻品種：揚稻6 號 (YD 6)，秈型常規(guī)水稻，購自江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所；南粳46 (NJ 46)，粳型常規(guī)水稻，購自江蘇省農業(yè)科學院糧食作物研究所。挑選粒大飽滿均一的上述兩種水稻種子，用無菌水清洗后置于無菌水中浸泡24 h，用浸濕的紗布包裹后置于恒溫培養(yǎng)箱中(30 ℃黑暗恒溫) 催芽，保持紗布濕潤。待水稻種子根芽分化明顯后，挑選長勢一致的水稻苗移栽至96 孔板中，置于黑盒中水培培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 施藥劑量及方式 根據大田施藥量配制三氟苯嘧啶藥液[17]，供試質量濃度為2.5 和5 mg/L，并在藥液中加入體積分數為0.1%的吐溫-80。將水稻幼苗置于水培營養(yǎng)液中培養(yǎng)，其中水培營養(yǎng)液參照Hoagland 營養(yǎng)液配方[18]配制。水稻幼苗在光/暗周期為16 h/8 h、晝/夜溫度為30 ℃/28 ℃和晝/夜?jié)穸葹?0%/80%的人工氣候箱中生長。在水稻3 葉期時采用以下兩種施藥方式處理。所有樣品在分析前均置于 -20 ℃冰箱中保存。

1) 水培法：待水稻長至3 葉期，將96 孔板從黑盒中取出，用純水沖洗水稻根部至無水滴后，將其浸于2.5 mg/L 的三氟苯嘧啶藥液中繼續(xù)培養(yǎng)，隨后分別于2、24、48 和72 h 時在每組中隨機取出水稻30 株和培養(yǎng)液10 mL，依次用甲醇和純水沖洗水稻根部各3 次。將各組水稻植株分為根、莖和葉3 部分并稱重。每處理重復3 次。

2) 浸葉法：待水稻長至3 葉期，將上部同一高度的葉片浸漬于5 mg/L 的三氟苯嘧啶藥液中20 s，分別于葉片取出后2、24、48 和72 h 時在每組中隨機取出水稻30 株和培養(yǎng)液10 mL，依次用甲醇和純水沖洗水稻根部各3 次。將水稻植株分為處理葉、莖葉和根3 部分并稱重，每處理重復3 次。

1.3.2 樣品前處理 水樣的前處理采用液液萃取法。取10 mL 過濾后的水樣，用5 mL 乙酸乙酯振蕩提取，加入2 g 氯化鈉和1 g 無水硫酸鈉，在7500g下離心5 min。取1 mL 上清液過0.22 μm濾膜過濾，待高效液相色譜 (HPLC) 檢測分析。

水稻樣品的前處理采用QuECHERS 法[19]。取剪碎的水稻樣品1 g，用10 mL 乙腈超聲提取后，加入1 g 氯化鈉和2 g 無水硫酸鎂，振蕩后在7500g下離心5 min。取上清液4 mL，加入100 mg吸附劑m(PSA) :m(C18) = 1 : 1，在7500g下離心5 min。取2 mL 上清液在溫和的氮氣流下蒸發(fā)至干燥，殘留物用色譜純乙腈定容至1 mL，用0.22 μm 濾膜過濾，待HPLC 檢測分析。

1.3.3 HPLC 檢測條件 Supersil ODS-B 色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流速1.0 mL/min；流動相為V(乙腈) :V(水) = 35 : 65 混合溶液；波長233 nm；進樣量10 μL；柱溫25 ℃。三氟苯嘧啶保留時間為9.61 min。

1.3.4 標準曲線繪制、添加回收試驗及基質效應測定 將三氟苯嘧啶原藥溶于色譜純乙腈，配制成1000 mg/L 的母液，于4 ℃保存，備用。使用時將母液用色譜純乙腈稀釋，得到質量濃度分別為0.05、0.78、1.56、3.12 和12.5 mg/L 的三氟苯嘧啶標準溶液，按照1.3.3 節(jié)色譜條件測定。以三氟苯嘧啶質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。在進行三氟苯嘧啶的添加回收試驗時，設置3 個水平的三氟苯嘧啶標準溶液分別添加在兩種水稻中，每個水平重復3 次，按照上述方法處理和測定樣品，計算平均回收率及相對標準偏差 (RSD)。分別對不同濃度的混合標準溶液和基質混合標準溶液進行檢測，按 (1) 式計算基質效應 (ME)：

式中，km為基質標準曲線斜率，ks為純溶劑標準曲線斜率。

當|ME| ＜ 20%時為弱基質效應，可忽略而無需采取補償措施；當20% ≤ |ME| ≤ 50%時為中等程度基質效應；當|ME| > 50% 時為強基質效應，須采取措施補償基質效應[20]。

1.3.5 三氟苯嘧啶在兩種水稻中內吸、傳導差異機制研究

1) 根系吸附試驗：將2 g 水稻根用去離子水反復沖洗后切碎，取1/2 樣品在105 ℃下加熱40 min 后冷卻至室溫，另1/2 樣品不做處理，分別放入裝有10 mL 0.01 mol/L CaCl2溶液的錐形瓶中，其中含有100 mg/L NaN3和不同質量濃度(1、2、3、4 和5 mg/L) 的三氟苯嘧啶溶液。將錐形瓶在25 ℃下以150 r/min 的速度搖動24 h，同時，設置對照溶液 (無水稻根) 以校正由藥劑降解或搖動引起的損失。每處理重復3 次。吸附等溫線根據 (2) 式進行擬合[21]。

其中cΔ是水稻根部對三氟苯嘧啶的吸附質量濃度(mg/L)，cw是處理溶液中實際測量的三氟苯嘧啶的質量濃度(mg/L)，kpw是從相應吸附等溫線的斜率獲得的植物-水分配系數。

2) 根系活力的測定：參照蕭浪濤等[22]的方法，采用α-萘胺法測定。

3) 蒸騰速率的測定：利用電子天平迅速稱量30 株水稻葉片的鮮重，重復3 次，10 min 后再稱量1 次，其差值即為蒸騰水量。通過葉面積測量儀測定水稻葉片面積，根據 (3) 式計算蒸騰速率 (T)。

式中：m為蒸騰水量，g；S為水稻葉片面積，m2；t為蒸騰時間，h。

4) 含水量的測定：每個處理中隨機選取30 株水稻，分為根、莖和葉3 部分并稱其質量 (m1)，然后放入烘箱60 ℃下烘至恒重后稱其質量 (m2)。每處理重復3 次。按 (4) 式計算含水量 (W)。

5) 水稻根莖組織的觀察：取新鮮三葉期水稻根和莖，徒手橫切制片，并用0.1%結晶紫水溶液染色，在生物顯微鏡下觀察各組織。

6) 接觸角測定：通過接觸角測量儀測量1.3.1節(jié)中用于浸葉處理的藥液在兩種水稻葉片正、反面的動態(tài)接觸角，采用Young-Laplace 方程擬合法計算接觸角。每處理重復3 次。

1.4 數據處理

利用IBM SPSS Statistics 25 對試驗數據進行單因素方差分析，結合t檢驗比較處理間差異(P＜ 0.05)。采用Origin 2019 軟件作圖。轉移因子(translocation factor，TF) 按(5) ～ (6)式計算得到。TF 值越大，表示三氟苯嘧啶在植物中具有更強的向頂或向下傳導的能力[23]。

其中croot、cstem和cleaf分別表示水稻的根、莖和葉中三氟苯嘧啶的含量 (mg/kg)；TFs/r和TFs/l分別表示三氟苯嘧啶從水稻根到莖稈以及從葉到莖稈的傳導能力。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的線性范圍、正確度與精密度

測定結果表明，在0.05～12.5 mg/L 范圍內，三氟苯嘧啶的質量濃度與其峰面積間有良好的線性關系，線性方程為y= 45197x+ 1390，決定系數R2為0.9999。在此檢測條件下，三氟苯嘧啶的檢出限為0.006 mg/kg，定量限為0.02 mg/kg。添加回收試驗結果表明：在0.05～2.5 mg/kg 添加水平下，三氟苯嘧啶的回收率為84%～103%，RSD為1.1%～9.2% (表1)。

表1 三氟苯嘧啶在水稻和水中的添加回收率及相對標準偏差 (n = 3)Table 1 Recoveries and relative standard deviations of triflumezopyrim in paddy rice and water (n = 3)

基質效應用于可視化樣品基質對色譜中出現的數據信號的影響。在0.05～12.5 mg/L 范圍內，對水稻各部分基質的標準曲線進行了線性評價。結果 (表2) 表明：基質對三氟苯嘧啶表現出輕微的抑制作用，|ME| 在1.3～5.4 之間，表明在所有基質中沒有明顯的基質效應。以上試驗表明，本研究所建立的檢測方法適用于檢測水稻樣品中的三氟苯嘧啶。

表2 三氟苯嘧啶在不同基質中的標準曲線比較Table 2 Comparison of standard curves of triflumezopyrim in different matrices

2.2 三氟苯嘧啶在兩種水稻不同部位的吸收與分布

水培處理結果表明：在兩種水稻的根、莖和葉中均能檢測到三氟苯嘧啶。藥劑處理后2 h，在兩種水稻根部便均可檢測出三氟苯嘧啶，同時在南粳46 的莖、葉中也檢測出了三氟苯嘧啶，但在揚稻6 號中未檢出，表明三氟苯嘧啶能快速被兩種供試水稻的根系吸收，但南粳46 能將其快速向頂傳導。在72 h 內，南粳46 莖中三氟苯嘧啶的含量均顯著高于揚稻6 號，葉中的含量也高于揚稻6 號，但僅在2 和72 h 時差異顯著。三氟苯嘧啶在兩種水稻根中的情況與莖、葉中的相反，并且僅在72 h時差異顯著 (圖1)。

圖1 水培條件下三氟苯嘧啶在兩種水稻不同部位的含量Fig.1 Content of triflumezopyrim in different parts of two kinds of paddy rice under hydroponic culture

浸葉處理結果表明：僅能在水稻的處理葉和莖葉中檢測到三氟苯嘧啶，并且兩者含量差異不大，但南粳46 對三氟苯嘧啶的吸收能力在48 h 內顯著高于揚稻6 號 (圖2)。

圖2 浸葉處理條件下三氟苯嘧啶在兩種水稻不同部位的含量Fig.2 Content of triflumezopyrim in different parts of two kinds of paddy rice in the leaf soaking treatment

2.3 三氟苯嘧啶在兩種水稻中的傳導能力

不同品種水稻的根系和葉片對三氟苯嘧啶的吸收和傳導存在較大差異，從水培處理的結果可以 (圖3) 看出，揚稻6 號的根系對三氟苯嘧啶的吸收能力更強，但三氟苯嘧啶在南粳46 中向頂傳導的速度更快。計算兩種水稻TFs/r值 (表3) 得出，南粳46 莖部和葉部的TF 值明顯大于揚稻6 號的，由此可知，三氟苯嘧啶在南粳46 的根部向頂傳導能力要顯著優(yōu)于揚稻6 號。

圖3 水培條件下三氟苯嘧啶在兩種水稻中的分布Fig.3 Distribution of triflumezopyrim in two kinds of paddy rice under hydroponic culture

表3 水培條件下三氟苯嘧啶在兩種水稻中的轉移因子 (n = 3)Table 3 Translocation factor of triflumezopyrim in two kinds of paddy rice under hydroponic culture (n = 3)

浸葉處理結果 (圖4) 表明，三氟苯嘧啶在兩種水稻根中未檢出，說明三氟苯嘧啶向下傳導能力較弱。通過比較兩種水稻的TFs/l值 (表4) 發(fā)現，兩種水稻莖部的TF 值沒有顯著差異。

圖4 浸葉處理中三氟苯嘧啶在兩種水稻中的分布Fig.4 Distribution of triflumezopyrim in two kinds of paddy rice in the leaf soaking treatment

表4 浸葉處理中三氟苯嘧啶在兩種水稻中的轉移因子 (n = 3)Table 4 Translocation factor of triflumezopyrim in two kinds of paddy rice in the leaf soaking treatment (n = 3)

2.4 三氟苯嘧啶在兩種水稻中內吸、傳導差異機制

2.4.1 水稻根系和葉面吸收三氟苯嘧啶的途徑

根系吸附研究中，水稻根部的三氟苯嘧啶含量隨著水培溶液濃度的增加而增加，與吸附等溫線高度擬合 (圖5)。雖然加熱增強了細胞膜的通透性，但并沒有抑制細胞內的水分擴散[24]。同時，細胞中的主動轉運受到抑制，導致共質通路減少。因此，死根主要通過質外體途徑運輸三氟苯嘧啶。本研究結果表明：兩種水稻鮮根和死根中的吸收斜率相似，所以三氟苯嘧啶在這兩種水稻的根系吸收是通過質外體和共質體途徑進行的。對于浸葉處理，三氟苯嘧啶進入水稻體內需要克服葉片表面的角質層等屏障，同時揚稻6 號葉片上茸毛較多，南粳46 葉片較光滑[25]，而這種水稻品種間葉片表面結構的差異，將導致葉片吸收農藥含量不一致，也將導致其向下傳導存在差異[26]。

圖5 水稻根中三氟苯嘧啶的吸附等溫線Fig.5 Adsorption isotherms of triflumezopyrim in paddy rice roots

2.4.2 三氟苯嘧啶在兩種水稻根系中的吸收和傳導差異機制α-萘胺法測定發(fā)現，南粳46 的根系活力顯著高于揚稻6 號 (圖6)。因此，南粳46 可以通過根系吸收更多的三氟苯嘧啶。通過根吸附試驗發(fā)現，三氟苯嘧啶可以通過質外體途徑進入植物體內，以植物體內的水為載體通過蒸騰作用不斷從根中向上傳導。測定兩種水稻葉片蒸騰速率，發(fā)現南粳46 的蒸騰速率顯著高于揚稻6 號，并且南粳46 莖中含水量要高于揚稻6 號 (圖6)，最終可能會導致葉片中三氟苯嘧啶含量的差異。此外，對比兩種水稻根莖的切片 (圖7)，發(fā)現揚稻6 號根中的初生木質部明顯多于南粳46，初生韌皮部也較發(fā)達，而在兩種水稻莖中的情況則相反。木質部和韌皮部在植物體內主要起輸導作用，農藥通過質外體途徑較經共質體途徑向上傳導更為容易，因為質外體途徑能通過木質部的蒸騰作用將農藥迅速向上傳導[27]。這能很好地解釋水培處理時三氟苯嘧啶在南粳46 中轉移能力更強這一現象。

圖6 兩種水稻理化性質的差異Fig.6 Differences in physical and chemical properties of two kinds of paddy rice

圖7 水稻幼苗根莖的橫切面生物顯微鏡圖(放大倍數10 × 10)Fig.7 Biomicrograph image of the cross-section of the rhizome of paddy rice seedlings (magnification 10 × 10)

2.4.3 三氟苯嘧啶在兩種水稻葉片中的吸收和傳導差異機制 通過測定10 min 內液滴在兩種水稻葉片上的動態(tài)接觸角，發(fā)現南粳46 葉片正面上的接觸角下降了6.5°，反面下降了3.5°。揚稻6 號葉片正面上的接觸角下降了3.3°，反面下降了2.2°(圖8)。液滴在南粳46 上的葉面接觸角下降幅度明顯高于揚稻6 號，表明南粳46 葉片吸收三氟苯嘧啶的能力要強于揚稻6 號。此外，揚稻6 號葉片含水量顯著高于南粳46 (圖6) ，且葉片較大，蒸騰作用較強，也會導致三氟苯嘧啶更難向下傳導。

圖8 三氟苯嘧啶溶液在兩種水稻葉片正、反面的動態(tài)接觸角Fig.8 Dynamic contact angles of triflumezopyrim solution on the front and back of two paddy rice leaves

3 結論與討論

本研究結果表明：兩種供試水稻經三氟苯嘧啶藥液水培處理后，揚稻6 號的根對三氟苯嘧啶吸收多于南粳46，但南粳46 莖、葉中三氟苯嘧啶的含量更高，表明南粳46 具有更強的向頂傳導能力；而水稻經浸葉處理后，南粳46 莖、葉中三氟苯嘧啶的含量明顯高于揚稻6 號，但三氟苯嘧啶在南粳46 中向下的傳導能力與揚稻6 號沒有顯著差異，三氟苯嘧啶在兩種水稻中都表現出較弱的向下傳導能力。

研究發(fā)現，由木質部介導的砷、鎘從根系向地上部的轉運是決定水稻、小麥莖稈和籽粒中砷、鎘含量的一個關鍵過程[28]。此外，有研究表明，高氯酸鹽可在植物體內或植物-水體系統(tǒng)中發(fā)生轉移，并主要經木質部轉移至地上部。受蒸騰作用影響，不同植物不同部位高氯酸鹽含量差異巨大，并且葉片是高氯酸鹽的主要累積部位。通過亞細胞試驗發(fā)現，高氯酸鹽主要分布在細胞可溶性組分中并且具有較高的移動性[29]。水溶性化合物多分布在植物組織的可溶性組分中，而三氟苯嘧啶和高氯酸鹽均屬于水溶性化合物[30]。

水稻吸收三氟苯嘧啶的能力與其理化性質有很大關系，根系活力和蒸騰速率等可反映其對農藥的吸收和傳導能力。Chiou 等[31]指出，對于辛醇-水分配系數 (Kow) 小于10 的有機物，水稻根部水分對于藥劑的吸收貢獻較大 (85%以上)。三氟苯嘧啶屬于親水性農藥，Kow為1.24，因此，水稻根部含水量的差異會導致水稻對三氟苯嘧啶的吸收產生影響。此外，植物根系可以通過質外體和共質體途徑吸收有機化合物，并通過木質部向上運輸[32]。本研究中，南粳46 的根系活力顯著高于揚稻6 號，莖中的初生木質部也要多于揚稻6 號，而大多數親水化合物主要轉移到木質部中[33]，并且南粳46 莖部含水量更高，通過較強的蒸騰作用可以向上傳導更多的三氟苯嘧啶[34]。因此，根系活力、蒸騰速率以及木質部的差異是三氟苯嘧啶在南粳46 中向頂傳導能力優(yōu)于揚稻6 號的主要原因。浸葉處理中，農藥通過葉片吸收主要靠共質體途徑，即從吸收部位通過胞間連絲或細胞間的滲透進入維管束組織，向上到達芽、葉等部位，向下進入根部，但有時因為環(huán)境條件、農藥分子特性、植物體內物質等因素并不能由施藥葉片向上或向下傳遞[35]，蒸騰作用和葉片性狀等差異是否會導致葉片吸收三氟苯嘧啶的含量不同以及影響向下傳導的能力，需要進一步探究。此外，由于取樣的時間較短，未能探究三氟苯嘧啶代謝方面的內容，值得深入研究以明確其在水稻生產中的安全性問題。雖然本研究僅采用了兩種水稻品種，但揚稻6 號和南粳46 分別是揚州地區(qū)秈稻和粳稻的典型品種，由此可推測，三氟苯嘧啶能穿透水稻的根與葉表面以及快速的被植物吸收，并且能夠雙向傳導，但具有更強的向上傳導能力。稻飛虱主要刺吸水稻莖稈汁液，建議在進行田間防治時對準根莖處施藥或者采用種子和土壤處理，在粳稻田中可以適當減少用量，從而提高農藥的利用率。