禾谷鐮孢菌β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基GLS2異源表達(dá)體系的建立

延揚(yáng)帆, 張 峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095)

由禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum引起的赤霉病 (Fusaruim head blight) 是危害我國(guó)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害[1]。在農(nóng)業(yè)上，禾谷鐮孢菌的防治措施主要包括抗性育種[2]、農(nóng)業(yè)防治[3]、生物防治[4]及化學(xué)防治[5-8]，其中化學(xué)防治是目前主要的防治措施。隨著病原菌抗藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重[9]，挖掘新的殺菌劑蛋白靶標(biāo)、設(shè)計(jì)具有新型作用機(jī)制的殺菌劑是解決病原菌抗藥性的關(guān)鍵手段。

真菌細(xì)胞壁是位于質(zhì)膜外的一種高可塑性骨架，是真菌的特征結(jié)構(gòu)，主要由葡聚糖、幾丁質(zhì)、糖蛋白組成，在細(xì)胞中起保護(hù)和支持等作用[10]，其中β-1,3-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁中較為豐富的一種多糖。大量的研究結(jié)果表明，抑制β-1,3-葡聚糖的合成將導(dǎo)致細(xì)胞溶解或形態(tài)改變[11-12]。此外，在植物免疫中存在病原體相關(guān)分子模式 (pathogenassociated molecular patterns, PAMPs)，該模式可以識(shí)別病原菌的β-1,3-葡聚糖，從而引起植物的免疫反應(yīng)[13]。真菌中β-1,3-葡聚糖主要由β-1,3-葡聚糖合成酶 (β-1,3-glucan synthase, GS) 以尿嘧啶二磷酸葡萄糖 (UDP-glucose) 為前體物質(zhì)合成[14]。該酶由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成，分別由FKS和RHO1基因編碼[15-18]。其中催化亞基Fksp 為膜蛋白，主要位于細(xì)胞膜中[19]，調(diào)節(jié)亞基Rho1p 蛋白為Rho家族蛋白，為三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate,GTP)結(jié)合蛋白，二磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine diphosphate,GDP)和三磷酸鳥(niǎo)苷作為調(diào)節(jié)因子與 Rho1p 蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)該酶的活性[17]。在釀酒酵母中，β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基由FKS1、FKS2、FKS33 種基因進(jìn)行編碼，F(xiàn)KS1編碼的FKS1p 與FKS2編碼的FKS2p 存在功能冗余，單獨(dú)敲除該基因不影響酵母的存活，但雙敲除基因會(huì)導(dǎo)致酵母死亡[20-21]。此外，其他酵母菌中該酶的催化亞基均由多個(gè)基因編碼，如在白色念珠菌Candida glabrata、裂殖酵母Schizogenesis pombe中均含有4 個(gè)編碼基因[22-23]。與酵母菌不同，在許多絲狀真菌中，該酶都僅含有一個(gè)編碼催化亞基的基因，如構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans[24]、煙曲霉Aspergillus fumigatus[25]、稻瘟菌Magnaporthe oryzae和茄腐鐮刀菌Fusarium solani[26]等。β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基在不同物種中都具有重要生物學(xué)功能，如煙曲霉在缺失唯一的β-1,3-葡聚糖合成酶編碼基因后仍能存活，但表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷[25]；而新生隱球菌缺失該基因就無(wú)法存活[27]。禾谷鐮孢菌中β-1,3-葡聚糖合成酶僅含有一個(gè)催化亞基GLS2，其參與β-1,3-葡聚糖的合成。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，該基因的敲除導(dǎo)致禾谷鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)受損，無(wú)法通過(guò)無(wú)性繁殖產(chǎn)生孢子 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。鑒于β-1,3-葡聚糖合成酶在禾谷鐮孢菌中的重要作用及醫(yī)藥領(lǐng)域已開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的抑制劑，因此該蛋白可作為開(kāi)發(fā)小麥赤霉病菌抑制劑的潛在靶標(biāo)。

β-1,3-葡聚糖合成酶在醫(yī)藥領(lǐng)域也是一個(gè)重要的靶標(biāo)蛋白，脂肽類(lèi)如棘白菌素[28]、三萜苷類(lèi)如enfumafungins[29]、C-芳基糖苷類(lèi)如papulacandins[30]等均是以該酶為靶標(biāo)開(kāi)發(fā)得到的β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑，其中棘白菌素類(lèi)藥劑已被批準(zhǔn)上市[31]。此外，由于β-1,3-葡聚糖合成酶在病原菌中普遍存在，而在哺乳動(dòng)物中不存在，所以該抑制劑對(duì)動(dòng)物等非靶標(biāo)生物安全性較高[32]。棘白菌素類(lèi)藥劑通過(guò)與真菌β-1,3-葡聚糖合成酶非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而抑制真菌生長(zhǎng)，但由于棘白菌素類(lèi)藥劑殺菌譜較窄，導(dǎo)致真菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，而藥劑和靶標(biāo)結(jié)合方式不明也限制了新型抑制劑的開(kāi)發(fā)[33]，所以藥劑與該蛋白靶標(biāo)互作的結(jié)構(gòu)解析是是近年來(lái)醫(yī)藥上的研究熱點(diǎn)。盡管目前對(duì)于β-1,3-葡聚糖合成酶的生物學(xué)性質(zhì)研究較多，但仍未見(jiàn)該酶被成功表達(dá)和純化的報(bào)道。Jimenez-Ortigosa 等利用Cryo-Electron Tomography 技術(shù)，觀察到白色念珠菌C.glabrata中的β-1,3-葡聚糖合成酶為六聚體復(fù)合物[34]。Inoue 等利用產(chǎn)物截留的方法富集到了700 倍的酶復(fù)合物[20]，但并未成功純化到完整的β-1,3-葡聚糖合成酶。Beauvais 等的研究結(jié)果表明，由于截短mRNA 的形成，未能成功利用草地貪夜蛾昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)來(lái)自煙曲霉的完整重組蛋白FKS1p[35]。異源表達(dá)和純化β-1,3-葡聚糖合成酶的失敗，嚴(yán)重限制了GS 抑制劑與β-1,3-葡聚糖合成酶互作的三維結(jié)構(gòu)的解析。本研究擬通過(guò)草地貪夜蛾昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9 表達(dá)系統(tǒng)，以禾谷鐮刀菌為供試菌株，篩選表達(dá)該菌株β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基的載體和分離純化所需的去污劑，旨在為該蛋白的生物化學(xué)功能及三維結(jié)構(gòu)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞 禾谷鐮孢菌菌株為野生型菌株P(guān)H-1；禾谷鐮孢菌菌株cDNA、桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pFastBac 和草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥靶標(biāo)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Escherichia coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞和大腸桿菌E.coliDH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥靶標(biāo)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 供試試劑 FastPfu Premix、DNA Marker、T4 DNA Ligase、2 × Ezmax-Single CloneMix Plus和質(zhì)粒小量抽提試劑盒，均購(gòu)自TOLOBIO；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，購(gòu)自Thermo Fisher；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、NheⅠ和NotⅠ，購(gòu)自TaKaRa；His 抗體、GFP 抗體和Strep 抗體，購(gòu)自Absin；去污劑十二烷基-β-D-麥芽糖苷 (ndodecyl-β-maltoside, DDM)、十烷基-β-D-麥芽糖苷(n-decyl-β-maltoside, DM) 購(gòu)自Glycon,n-正辛基-β-D-葡葡萄糖苷 (n-octyl-β-D-glucoside, βOG)、十二烷基二甲胺氧化胺 (dodecyldimethylamine oxide,DDAO) 和正壬基-β-D-麥芽糖苷 (n-nonyl-β-Dmaltoside, NM)，購(gòu)自Anatrace；Ni-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂購(gòu)自Cytiva；草地貪夜蛾昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基SIM SF、轉(zhuǎn)染試劑Sinofection 均購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司。氯化鈉，購(gòu)自生工；4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES )，購(gòu)自索萊寶；甘油(glycerol)，購(gòu)自永華；咪唑(imidazole)，購(gòu)自源葉生物。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 Trident960 PCR 擴(kuò)增儀，Heal Force 公司；FUSION FX7 RGB SPECTRA 生物大分子分析儀，Vilber 公司；MQD-B1R 搖床，旻泉儀器公司；SPX-500 智能型生化培養(yǎng)箱，寧波東南公司；Centrifuge 5424 高速離心機(jī)，Eppendorf公司；COULTER 超高速離心機(jī)，BECKMAN 公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 使用SnapGene 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物訂購(gòu)于金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.5 分離純化所用緩沖液 Buffer A (150 mmol/L NaCl，20 mmol/L HEPES，10%甘油，pH 7.5)；Buffer B (150 mmol/L NaCl，20 mmol/L HEPES，10%甘油，25 mmol/L 咪唑，pH 7.5)；Buffer C(150 mmol/L NaCl，20 mmol/L HEPES，10%甘油，250 mmol/L 咪唑，pH 7.5)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建 為了檢測(cè)蛋白的表達(dá)、增加蛋白的可溶性、促進(jìn)蛋白表達(dá)后定位于細(xì)胞膜上及便于蛋白的分離純化，擬在表達(dá)載體上添加綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 標(biāo)簽、血凝素 (hemagglutinin，HA) 信號(hào)肽、AcMNPV (autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 桿狀病毒包膜磷酸化糖蛋白 (glycoprotein，GP67) 信號(hào)肽、8 個(gè)組氨酸(Histidine, His)標(biāo)簽8 ×His、2 個(gè)鏈球菌抗生物素蛋白 (streptavidin，Strep)標(biāo)簽2 × Strep，同時(shí)添加煙草蝕紋病毒TEV 識(shí)別位點(diǎn)，以便于后續(xù)切除表達(dá)分離標(biāo)簽及信號(hào)肽。同時(shí)為了促進(jìn)FgGLS2 的穩(wěn)定表達(dá)，構(gòu)建FgRHO蛋白表達(dá)載體，與FgGLS2 表達(dá)載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá)。使用FgG-F 和FgG-R 一對(duì)引物擴(kuò)增FgGLS2 基因，使用引物 gp-F 和GFP-TEVR1、GFP-TEV-R2 擴(kuò)增GP67-8 × His-GFP-TEV 片段，使用引物HA-F 和GFP-TEV-R1、GFP-TEVR2 擴(kuò)增HA-8 × His-GFP-TEV 片段，將兩組片段和目的基因利用同源重組的方法分別進(jìn)行融合，同樣方法將其連接在用B a m H Ⅰ和H i n d Ⅲ酶切后的pFastBac 空載上，以構(gòu)建載體pFastBac-GP67(signal peptide)-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和pFastBac-HA(signal peptide)-8 × His-GFP-TEVFgGLS2。使用引物gp-F 和strep-R 擴(kuò)增標(biāo)簽GP67-6 × His-2 × Strep，使用引物HA-F 和strep-R 擴(kuò)增標(biāo)簽HA-8 × His-2 × Strep，將已構(gòu)建成功的兩個(gè)載體用NotⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切，將擴(kuò)增后的標(biāo)簽與酶切后的載體進(jìn)行T4 DNA Ligase 連接，以構(gòu)建載體pFastBac-GP67(signal peptide)-6 × His-2 ×Strep-TEV-FgGLS2 和pFastBac-HA(signal peptide)-8 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2。用引物FgR-F 和FgR-R1、FgR-R2 擴(kuò)增FgRHO-TEV 基因并用T4 DNA Ligase 連接將基因連接在用EcoRⅠ和NheⅠ酶切后的pFastBac-8 × His 載體上，以構(gòu)建載體pFastBac-FgRHO-TEV-8 × His (引物序列見(jiàn)表1)。

表1 本試驗(yàn)所需引物的序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.2 桿狀病毒質(zhì)粒的制備 將上述制備成功的載體熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑的篩選。挑選白斑的菌體搖培擴(kuò)繁后，于12 000 r/min 離心2 min，收集菌體。用質(zhì)粒小量抽提試劑盒中的buffer P1、P2、P3 裂解菌體，用純度100%的異丙醇沉降，于12 000 r/min離心10 min 后使用70%的乙醇清洗沉淀，待沉淀風(fēng)干后，加入適量ddH2O，充分溶解后即制得桿狀病毒質(zhì)粒DNA，置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組桿狀病毒的制備 100 μL 昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基與15 μL 轉(zhuǎn)染試劑、5 μL 桿狀病毒質(zhì)粒DNA攪拌混勻，加入2 mL 包含1 × 106個(gè)/mL Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中，27 ℃靜置培養(yǎng)6 d，2000 r/min離心，收集上清液即為P1 代病毒液。將其按體積比1 : 100 的稀釋比例加入至包含3 × 106個(gè)/mL Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞的10 mL 培養(yǎng)液中，于27 ℃、120 r/min搖培2 d，2000 r/min 離心后收集上清液，即為P2 代病毒液。同法制備P3 代病毒液。

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)純化 將P3 代病毒液按體積比1 : 100 的比例加入至50 mL 包含3 × 106個(gè)/mL Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中，于27 ℃ 120 r/min 搖培2 d，2000 r/min 下離心，收集菌體。用Buffer A 重懸破碎后，收集沉淀；用Buffer A 重懸后收集上清液。加入一定體積的Ni-NTA 瓊脂糖樹(shù)脂進(jìn)行孵育，使用Buffer B 和Buffer C 進(jìn)行親和純化。

1.2.5 結(jié)果檢測(cè) 單獨(dú)表達(dá)載體根據(jù)蛋白表達(dá)量分別選擇蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)兩種方式進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)gGLS2 蛋白取離心后的上清液和沉淀后，使用Western Blot 方法進(jìn)行檢測(cè)。GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2、HA-8 ×His-GFP-TEV-FgGLS2 使用His 和GFP 抗體進(jìn)行檢測(cè)。GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2，HA-8 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 使用His 和Strep 抗體進(jìn)行檢測(cè)。FgRHO-TEV-8 × His 使用Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂純化后通過(guò)SDS-PAGE 進(jìn)行檢測(cè)分析。蛋白共表達(dá)后取兩次離心后的上清液、沉淀和純化后的洗脫液共5 個(gè)樣用Western Blot 進(jìn)行雙抗體檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白序列分析

通過(guò)Uniprot 網(wǎng)站 (https://www.uniprot.org/uniprotkb/I1RUP6/entry) 對(duì)FgGLS2 蛋白序列進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白包含1944 個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)蛋白222 kD。使用NovoPro 網(wǎng)站 (https://www.novopro.cn) 對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(transmembrane helices ,TMH)的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有16 個(gè)跨膜域 (圖1)。

圖1 FgGLS2 蛋白序列分析Fig.1 FgGLS2 protein sequence analysis

2.2 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建圖譜

本研究通過(guò)添加信號(hào)肽的方式以便于目的蛋白定位于細(xì)胞膜上并在正確位置進(jìn)行折疊，通過(guò)添加GFP 標(biāo)簽以便于初步觀察載體是否能夠表達(dá)，通過(guò)添加His 和Strep 標(biāo)簽以便于后續(xù)對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)和純化，用材料與方法中所示策略構(gòu)建相應(yīng)載體，載體構(gòu)建圖譜如圖2 所示。通過(guò)Swiss Bioinformatics Resource Portal 網(wǎng)站 (https://www.expasy.org/) 計(jì)算重組蛋白的pI 值和重組蛋白的分子質(zhì)量 (圖2A)。載體pFastBac-FgRHO-TEV-8 ×His 用于表達(dá)重組蛋白FgRHO-TEV-8 × His (載體圖譜如圖2B 所示)，載體pFastBac-GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和pFastBac-HA-8 × His-GFPTEV-FgGLS2 用于表達(dá)重組蛋白GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2(載體圖譜如圖2C 和2D 所示)。載體pFastBac-GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 和pFastBac-HA-8 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 用于表達(dá)重組蛋白GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 和HA-8 ×His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 (載體圖譜如圖2E 和2F 所示)。

圖2 昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)載體構(gòu)建圖譜Fig.2 Construction maps of insect system expression vectors

2.3 禾谷鐮孢菌β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基FgGLS2 和調(diào)節(jié)亞基FgRHO 蛋白表達(dá)

根據(jù)分子質(zhì)量大小對(duì)相應(yīng)蛋白檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明：FgRHO-TEV-8 × His 可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá) (圖3A)；GP67-8 × His-GFP-TEVFgGLS2 和HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 可以用GFP 抗體檢測(cè)到，但His 標(biāo)簽斷裂較為嚴(yán)重，無(wú)法檢測(cè)到目的蛋白 (圖3B)；GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 可以用兩個(gè)抗體同時(shí)檢測(cè)到表達(dá)(圖3C ④)，而HA-8 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2無(wú)法檢測(cè)到表達(dá) (圖3C ⑤)。因此，F(xiàn)gRHO-TEV-8 × His、GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2、HA-8 ×His-GFP-TEV-FgGLS2 及GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 均可用于下一步研究，在FgGLS2和FgRHO 共表達(dá)條件下，篩選可以用于純化兩種蛋白的去污劑。

圖3 SDS-PAGE 檢測(cè)β-1,3-葡聚糖合成酶調(diào)節(jié)亞基FgRHO 蛋白表達(dá)結(jié)果和Western Blot 檢測(cè)β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基FgGLS2 蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 The expression results of β-1, 3-glucan synthetase regulatory subunit FgRHO protein were detected by SDS-PAGE and the expression results of β-1,3-glucan synthetase catalytic subunit FgGLS2 protein were detected by Western Blot

2.4 GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和FgRHOTEV-8 × His 共表達(dá)及去污劑的篩選

GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和FgRHOTEV-8 × His 共表達(dá)結(jié)果表明，F(xiàn)gRHO 蛋白穩(wěn)定了FgGLS2 蛋白的表達(dá)，使得FgGLS2 蛋白可同時(shí)被兩種抗體檢測(cè)到。用DDM、DM、NM、DDAO、βOG 5 種去污劑對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)DDAO處理可以較好地將蛋白從細(xì)胞膜上分離出來(lái)，并可在洗脫液中檢測(cè)到FgGLS2 和FgRHO 兩種蛋白 (圖4B)，而NM、βOG 處理僅能將FgRHO蛋白分離出來(lái) (圖4B、4C)，因此純化GP67-8 ×His-GFP-TEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His蛋白使用DDAO 進(jìn)行分離效果最佳。

圖4 GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His 共表達(dá)及去污劑篩選Fig.4 Co-expression of GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 and FgRHO-TEV-8 × His and screening of detergent

2.5 HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和FgRHOTEV-8 × His 共表達(dá)及去污劑的篩選

HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和FgRHOTEV-8 × His 共表達(dá)結(jié)果與GP67-8 × His-GFPTEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His 共表達(dá)結(jié)果一致。用5 種去污劑篩選后發(fā)現(xiàn)，使用DDM、DM、DDAO 處理，均可在洗脫液中檢測(cè)到FgGLS2蛋白和FgRHO 蛋白 (圖5A、5B)，使用NM 處理則僅可以在溶解細(xì)胞膜后的上清液中檢測(cè)到FgGLS2 蛋白，在洗脫液中可以檢測(cè)到FgRHO 蛋白 (圖5C)。綜上所述，對(duì)于HA-8 × His-GFPTEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His 蛋白的純化選擇DDM、DM、DDAO 均可。

圖5 HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His 共表達(dá)及去污劑篩選Fig.5 Co-expression of HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 and FgRHO-TEV-8 × His and detergents screening

2.6 GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His 共表達(dá)及去污劑的篩選

GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 和FgRHOTEV-8 × His 共表達(dá)結(jié)果與其他蛋白共表達(dá)結(jié)果一致。去污劑篩選結(jié)果表明，用DM 和DDAO 處理，均可在溶解細(xì)胞膜后將FgGLS2 蛋白和FgRHO蛋白從膜中提取出來(lái)，并在洗脫液中檢測(cè)到純化后的蛋白 (圖6A、6C)，用DDM、NM 處理后可在洗脫液中檢測(cè)到FgRHO 蛋白 (圖6A、6B)，而βOG 無(wú)法將任何蛋白提取出來(lái) (圖6B)。因此，GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His 蛋白的純化選擇DM 和DDAO 效果較好。

圖6 GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 和FgRHO-TEV-8 × His 共表達(dá)及去污劑篩選Fig.6 Co-expression of GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 and FgRHO-TEV-8 × His and detergents screening

3 討論

小麥赤霉病嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食安全和人畜健康，禾谷鐮孢菌作為引起小麥赤霉病的主要病原菌，研究其體內(nèi)重要蛋白的功能和結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)殺菌劑開(kāi)發(fā)的潛在靶標(biāo)，有助于新型作用機(jī)制殺菌劑的創(chuàng)制及該類(lèi)病害的高效防治。

細(xì)胞壁是包圍真菌細(xì)胞的外部結(jié)構(gòu)，對(duì)于細(xì)胞的機(jī)械保護(hù)和維持細(xì)胞形狀必不可少。在真菌感染期間，細(xì)胞壁是病原體與宿主細(xì)胞相互作用的界面，因此在真菌致病性和毒力方面起著關(guān)鍵作用[36-38]。大多數(shù)真菌的內(nèi)層由分支的β-1,3-葡聚糖組成[39]，因此，抑制β-1,3-葡聚糖的合成對(duì)抑制真菌具有重要意義。β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基Fksp 的分子質(zhì)量超過(guò)200 kDa，并含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)[40]，由于原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性[41]，對(duì)于該蛋白全長(zhǎng)蛋白的異源表達(dá)只能選擇真核表達(dá)系統(tǒng)。本研究在草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9 表達(dá)系統(tǒng)中成功對(duì)該酶進(jìn)行了異源表達(dá)，并成功構(gòu)建了可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)該酶的載體：pFastBac-GP67-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2、pFastBac-HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2、pFastBac-GP67-6 × His-2 × Strep-TEV-FgGLS2 和pFastBac-FgRHO-TEV-8 × His。β-1,3-葡聚糖合成酶主要包含催化亞基和調(diào)節(jié)亞基兩個(gè)亞單位，已有研究表明，從釀酒酵母RHO1 缺失突變體分離的細(xì)胞膜，可以在外源添加Rho1p 重組蛋白后恢復(fù)β-1,3-葡聚糖合成酶的活性[18]。Mazur 等的研究表明，兩個(gè)亞單位需要同時(shí)在同一系統(tǒng)中表達(dá)，才可能得到具有活性的酶復(fù)合體[42]。本研究結(jié)果也表明，在FgGLS2 蛋白與FgRHO 蛋白共表達(dá)時(shí)才穩(wěn)定了GP678 × His-GFP-TEV-FgGLS2 和HA-8 × His-GFP-TEV-FgGLS2 的表達(dá)。β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基為細(xì)胞膜蛋白，跨膜蛋白的提取需要合適的去污劑將蛋白從膜結(jié)構(gòu)中提取出來(lái)[43]，本研究結(jié)果表明，針對(duì)3 種不同的表達(dá)載體，DDAO 均對(duì)FgGLS2 蛋白的提取具有較好的效果。

β-1,3-葡聚糖合成酶是影響禾谷鐮孢菌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵蛋白，是殺菌劑開(kāi)發(fā)理想的藥物靶標(biāo)。本研究首次成功地在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)了禾谷鐮孢菌β-1,3-葡聚糖合成酶催化亞基GLS2，通過(guò)篩選異源表達(dá)載體和純化所需的去污劑，有助于進(jìn)一步研究該蛋白的生化功能及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，為后續(xù)新型靶向殺菌劑的開(kāi)發(fā)奠定了重要的基礎(chǔ)。