新生兒6 698例常見遺傳性聾基因篩查結(jié)果分析

韋柳婷，吳秋龍，黃之虎

聽力受損是常見的出生缺陷，全球先天性聽力受損的病人60%~80%與遺傳因素有關(guān)，攜帶有基因突變的新生兒，其聽力損失發(fā)生率是普通新生兒的10 倍以上［1］。新生兒聽力損傷的早期診斷非常重要，有聽力受損的新生兒能夠被及早識別并進(jìn)行干預(yù)治療，可以避免由于聽力損失而導(dǎo)致的語言和社交障礙。有研究表明，青少年及成人語前耳聾病人人工耳蝸植入術(shù)后的聽覺語言能力康復(fù)效果不如幼兒及學(xué)齡期語前耳聾病人［2］。除了新生兒聽力篩查外，耳聾基因篩查也逐步成為新生兒聽力損失早期的有效篩查方法。耳聾基因的突變頻率在不同國家、地區(qū)和民族之間存在差異，有明顯的種族和區(qū)域差異［3］。廣西壯族自治區(qū)是少數(shù)民族地區(qū)，除了壯族，還有苗族、瑤族、侗族、仫佬族等，南寧地區(qū)的少數(shù)民族主要以壯族居多。本研究對新生兒進(jìn)行耳聾基因檢測，研究的突變位點(diǎn)有13 個，除了tRNA的2個位點(diǎn)外，其他11個是各基因中的熱點(diǎn)突變。與耳聾相關(guān)tRNA 的檢測在我國的研究少見，增加tRNA 的檢測位點(diǎn)，可以了解南寧地區(qū)的耳聾基因突變類型的分布情況，分析漢族與壯族之間的差異，希望能夠?yàn)槟蠈幍貐^(qū)先天性聽力損傷的預(yù)防和保健工作提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017 年8 月至2021 年4 月在廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院出生并進(jìn)行耳聾基因篩查的6 698例新生兒，男性3 583例，女性3 115例，男女比例為1∶0.87。壯族有2 697 例（男性1 349 例，女性1 348 例），漢族3 607 例（男性1 833 例，女性1 774例），其他少數(shù)民族392 例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有研究對象監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法新生兒于出生時采集臍帶血，EDTA-K2抗凝，2～8 ℃冷藏保存。在一個星期內(nèi)進(jìn)行DNA 提取，對4個耳聾基因的13個突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和導(dǎo)流雜交基因分析，通過對雜交膜條的顯色位點(diǎn)來分析是否存在耳聾基因的位點(diǎn)突變。

1.3 檢測指標(biāo)GJB2 基因5 個突變位點(diǎn)：c.235 del C、c.35 del G、c.299-300 del AT、c.155-158 del TCTG、c.176-191 del 16；SLC26A4 基因3 個突變位點(diǎn)：c.919-2A>G、c.1229 C>T、c.2168 A>G；mt DNA 4 個位點(diǎn)：12S rRNA 2個突變位點(diǎn)（g.1555 A>G、g.1494 C>T），tRNA 2 個突變位點(diǎn)（G.7445 A>G、G.12201 T>C）；GJB3基因1個突變位點(diǎn)：c.538 C>T。

1.4 試劑和儀器DNA的提取、擴(kuò)增和雜交分析全部采用廣東潮汕凱普生物化學(xué)科技股份有限公司的耳聾易感基因檢測試劑盒配套試劑。DNA 提取采用凱普HBNP-4801A 自動核酸提取儀，PCR 擴(kuò)增應(yīng)用博日TC-96/G/H（b）擴(kuò)增儀，導(dǎo)流雜交使用凱普HBHM3000S醫(yī)用核酸快速雜交儀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組間檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)分析，以P<0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。當(dāng)n≥40 且所有T≥5，用普通χ2檢驗(yàn)；當(dāng)n≥40，但1≤T<5 時，用校正χ2檢驗(yàn)；當(dāng)n<40 或T<1時，用Fisher確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因篩查總體情況篩查陽性119 例，總體檢出率為1.78%，其中，漢族人群3 607 例，耳聾基因的檢出率為73 例（2.02%），其中男35 例（1.91%），女38 例（2.14%）；壯族人群2 697 例，耳聾基因檢出率為44 例（1.63%），其中男24 例（1.78%），女20 例（1.48%），其余2例陽性為其他少數(shù)民族。常見耳聾基因在壯漢兩民族的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.30，P=0.253），且不同性別壯漢兩民族人群耳聾基因檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 四個耳聾基因篩查結(jié)果在119 例陽性樣本中，67 例檢出GJB2 基因突變，檢出率為1.00%（67/6 698），是最常見的耳聾突變基因，其次是SLC26A4基因（0.48%），然后依次為mt DNA（0.27%）和GJB3（0.03%），見表1。漢族GJB2 基因的檢出率為1.11%，壯族為1.00%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.171，P=0.680），同時，GJB3、SLC26A4 和mt DNA 在壯漢兩民族間的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。不同性別壯漢兩民族人群4個耳聾基因的分布均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 不同性別壯漢兩民族4個耳聾基因的檢出率/例（%）

表2 壯漢兩民族4個耳聾基因的檢出率比較/例（%）

2.3 漢族與壯族人群耳聾基因突變位點(diǎn)分布情況c.235 del C 突變是GJB2 基因最常見的突變位點(diǎn)，總體檢出率為0.87%，漢族為0.89%，壯族為0.96%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.00，P=0.752）。c.299-300delAT 在漢族有檢出，在壯族未檢出，但是在壯漢兩民族間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.64，P=0.057）。c.919-2A>G 是SLC26A4基因的主要突變位點(diǎn)，總體檢出率為0.33%，漢族為0.47%，壯族為0.15%，漢族高于壯族，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.85，P=0.028）。其他突變位點(diǎn)在兩民族的檢出率均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 漢族和壯族耳聾基因13個突變位點(diǎn)的檢出率/例（%）

檢出1例c.176-191del16位點(diǎn)與c.299-300delAT位點(diǎn)雙重雜合突變。未檢出c.35 del G 和c.155-158del TCTG 突變，壯族c.1229 C>T 突變的檢出率與c.919-2A>G 突變一致。g.1555 A>G 檢出率為0.22%，有8 例為g.1555 A>G 的均質(zhì)突變，壯族5 例，漢族3例。mt DNA 12201 T>C突變在壯漢兩民族中均未檢出，壯族未檢出g.1494 C>T 突變，壯族檢出1例G.7445 A>G 均質(zhì)突變，漢族檢出1 例G.7445 A>G異質(zhì)突變。壯漢兩民族各檢出GJB3c.538 C>T 突變1 例。由表4 可發(fā)現(xiàn)，耳聾基因的13 個突變位點(diǎn)在壯漢兩民族的男女當(dāng)中的分布均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 耳聾基因13個突變位點(diǎn)在壯漢兩民族男女當(dāng)中的檢出率/例（%）

3 討論

遺傳性聾主要是單基因遺傳病，可以分為非綜合性耳聾和綜合性耳聾，非綜合性耳聾是指不伴隨有其他組織器官癥狀和體征的聽力損傷［4］。我國遺傳性聾相關(guān)的主要有4 個基因［5］，GJB2、SLC26A4、12S rRNA 和GJB3。本研究均涉及這四個耳聾基因，總檢出率為1.78%，GJB2 基因檢出率為1.00%，依次為SLC26A 基因0.48%、mt DNA0.27%和GJB3 0.03%。與相同檢測位點(diǎn)或者少于本研究檢測位點(diǎn)的研究對比發(fā)現(xiàn)，南寧地區(qū)的耳聾基因陽性檢出率低，佛山地區(qū)新生兒耳聾基因陽性率為2.98%［6］，浙江紹興地區(qū)為4.00%［7］，山西晉東南地區(qū)為5.03%［8］，北京4.38%［9］。研究顯示，隨著檢測位點(diǎn)的擴(kuò)大，檢出率增加［10-11］，研究篩查的基因位點(diǎn)數(shù)量較少，會導(dǎo)致一定的漏檢率。本研究耳聾基因檢出率低，除了與地區(qū)差異和檢測基因突變位點(diǎn)數(shù)量有關(guān)外，耳聾基因的攜帶率與民族有關(guān)系［12］。研究分析了漢族與壯族的差異，兩者不僅在耳聾基因的總體檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，漢族2.02%，壯族1.63%，而且，4個耳聾基因在壯漢兩民族的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

GJB2基因是本次研究最主要的突變基因，其不同突變位點(diǎn)c.235 del C、c.35 del G、c.299 - 300de?lAT、c.176-191del16 和c.155-158 del TCTG 的總體檢出率分別為0.87%、0、0.10%、0.03%和0，在壯漢兩民族的檢出率均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。GJB2 c.235 del C突變檢出率最高，其中漢族的檢出率為0.89%，壯族0.96%。然后是c.299 - 300delAT 突變，漢族c.299 - 300delAT 突變檢出率為0.19%，壯族未檢出該突變位點(diǎn)。c.235 del C 是亞洲人群的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)［13］，但是在臺灣的一項研究中發(fā)現(xiàn)，GJB2 c.109G> A 的突變頻率大于c.235 del C［14］。研究中，c.176-191del16 位點(diǎn)均在女性中檢出，檢出1 例c.176-191del16 位點(diǎn)與c.299-300delAT 位點(diǎn)的雙重雜合突變，可導(dǎo)致耳聾的發(fā)生，病兒需要使用助聽器。而本次研究未檢出的c.35 del G 突變則多發(fā)現(xiàn)在歐洲和中東［15-16］。

SLC26A4 基因突變可導(dǎo)致Pendred 綜合征或非綜合性耳聾，c.919-2A>G 突變是SLC26A4 基因中最常見的突變類型，檢出率為0.33%，也是本研究中唯一在壯漢兩民族的檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義的突變位點(diǎn)（P=0.028），漢族SLC26A4 基因的c.919-2A>G 突變位點(diǎn)的檢出率高于壯族，漢族為0.47%，壯族為0.15%。其次是c.1229 C>T 突變，檢出率為0.12%，在雷潔等［17］的研究中發(fā)現(xiàn)，深圳南山區(qū)c.2168 A>G 突變是僅次于c.919-2A>G 的突變類型，與本研究存在不同，差異體現(xiàn)了SLC26A4 基因突變類型的分布與地區(qū)相關(guān)。c.919-2A>G 突變是漢族SLC26A4 基因主要的突變位點(diǎn)，與其他研究一致［18-19］。而壯族的c.919-2A>G 和c.1229 C>T 位點(diǎn)的檢出率一致，均為0.15%，有研究顯示，壯族女性常見的SLC26A4 基因突變位點(diǎn)為c. 1983C>A、c.1547dup、c.754T>C、c.1905G>A、c.919-2A>G 和c.678T>C，只有c.919-2A>G 突變位點(diǎn)在本次研究中，其他5個并未進(jìn)行檢測［20］。因此，壯漢兩民族在SLC26A4 基因攜帶率是否存在差異，c.919-2A>G 是否為本地區(qū)壯族SLC26A4 基因的熱點(diǎn)突變，需要增加檢測位點(diǎn)和擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

mt DNA 是線粒體相關(guān)的耳聾基因，其中12S rRNA 屬于藥物性耳聾基因，突變可導(dǎo)致使用氨基糖苷類抗生素引起的聽力損傷。本研究顯示，南寧地區(qū)g.1555 A>G為12S rRNA基因最常見突變，檢出15例，基因頻率為0.22%，其中8例均質(zhì)突變，5例為壯族，3 例為漢族，對于確診的病人，終身禁止使用氨基糖苷類抗生素。壯漢兩民族在g.1555 A>G 和g.1494 C>T 位點(diǎn)突變的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)G.7445 A>G 突變2例，檢出率為0.03%，漢族與壯族各檢出1例，壯族為均質(zhì)突變，漢族為異質(zhì)突變，壯漢兩民族G.7445 A>G 檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Zheng 等［21］研究闡明了線粒體tRNA 突變是中國人群聽力損失的一個重要原因，Cao等［6］在佛山地區(qū)新生兒耳聾基因突變研究中發(fā)現(xiàn)G.7445 A>G 突變位點(diǎn)的檢出率為0.006%。Yan 等［22］在一個漢族家系中鑒定G.12201 T>C 突變導(dǎo)致母系遺傳遲發(fā)性非綜合征耳聾，但是，本研究未檢出G.12201 T>C突變。

GJB3 基因位于1 號染色體，該基因的突變可導(dǎo)致高頻感音神經(jīng)性耳聾，在本研究中，GJB3 基因突變頻率0.03%，是4 個耳聾基因中檢出率最低的基因，漢族與壯族均有檢出，檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，漢族為0.03%，壯族為0.04% 。

本研究尚有不足之處，樣本量少、檢測位點(diǎn)少，除了壯族外，其他的少數(shù)民族樣本較少，沒有對廣西的其他少數(shù)民族進(jìn)行研究。