高通量測序技術(shù)聯(lián)合瞬態(tài)誘發(fā)性耳聲發(fā)射技術(shù)在新生兒遺傳性聾篩查中的應(yīng)用價值研究

劉詠梅，馮會穎，殷美樂，李文，桑艷峰

耳聾是常見的單基因遺傳病，也是常見的出生缺陷之一，我國新生兒耳聾的發(fā)生率約為1‰～3‰，高危新生兒聽力障礙發(fā)生率則高達2%～4%，且高危新生兒發(fā)生遲發(fā)性聽力損失的風(fēng)險更高，每年約有3萬重度聽障新生兒出生［1-2］。因此盡早對新生兒開展聽力篩查非常有必要。高通量測序（NGS）技術(shù)是近些年發(fā)展起來的新型DNA 測序技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于新生兒遺傳性疾病的篩查中，但部分新生兒雖存在耳聾基因異常，但現(xiàn)階段對聲音反應(yīng)較好，與篩查結(jié)果不符［3］。瞬態(tài)誘發(fā)性耳聲發(fā)射（TEO?AE）技術(shù)是目前國內(nèi)外篩查新生兒耳聾的常用方法之一，具有測試簡便、靈敏度高等優(yōu)勢，但單獨采用TEOAE 對高危新生兒進行聽力篩查時，仍然會丟失部分病兒有聽力障礙的檢查信息，造成漏診［4-5］。基于此，本研究嘗試探討NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE技術(shù)在新生兒遺傳性聾篩查中的應(yīng)用價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用整群隨機抽樣方法，根據(jù)納入排除標準選取2018年1月至2020年10月承德市中心醫(yī)院625例新生兒作為研究對象，男419例，女206例；分娩孕周（38.26±1.62）周，范圍為35～42周；出生體質(zhì)量（3.86±0.65）kg，范圍為2.3～5.2 kg；剖宮產(chǎn)218例，順產(chǎn)407例；新生兒輕度窒息52例，新生兒重度窒息18例，無新生兒窒息555例；有家族耳聾史20例。本研究獲承德市中心醫(yī)院倫理委員會批準［批號院科倫審（2017）倫審第（1162）號］，所有新生兒近親屬均知曉本研究，已簽署知情同意書。排除不愿參與篩查者。

1.2 方法所有新生兒均于出生后3～7 d 內(nèi)采用NGS技術(shù)和TEOAE技術(shù)行新生兒耳聾篩查，并于出生后1個月、2個月采用TEOAE技術(shù)進行第1、2次復(fù)篩。

NGS 技術(shù)篩查方法：采集新生兒足跟血制成≥8 mm 的干血斑，于4 ℃保存，采用Mag Pure Blood DNA LQ Kit 提取干血斑中的模板基因組DNA，并利用Qubit 熒光計（賽默飛世爾科技）進行定量分析。采用引物-特異性標簽序列進行多重PCR 技術(shù)構(gòu)建DNA 文庫并定量，利用OneTouch2 自動化乳液PCR儀擴增測序模板并使用ES磁珠純化儀進行富集，采用BioelectronSeq 4000高通量測序儀（北京博奧生物有限公司）測序，共檢測18個常見耳聾基因的共100個位點。采用Ion PI Hi-Q Sequencing 200Kit 試劑盒，檢測操作嚴格按照說明書進行。

TEOAE技術(shù)篩查方法：先行外耳道檢查，將新生兒外耳道分泌物、胎脂等清除，待新生兒睡著后進行檢查，要求檢查環(huán)境噪聲<40 dB（A），采用Accu-Screen便攜式耳聲發(fā)射儀（丹麥MADSEN公司生產(chǎn)），參數(shù)設(shè)置：疏波短聲刺激，脈寬80 μs，非線性給聲測試頻率1.5～4.5 KHZ，刺激強度70～84 dB最小聲壓級。將大小合適的耳塞置入外耳道，并與篩查儀探頭連接，耳塞尖端小孔正對鼓膜，必要時放置于外耳道外1/3處，開始測試，篩查儀自動顯示結(jié)果（PASS為通過，REFER為未通過），并分別于出生后1、2個月進行復(fù)篩。

聽力診斷：NGS技術(shù)篩查和TEOAE技術(shù)復(fù)篩中有一種未通過者，需要在出生后3～6個月轉(zhuǎn)診至省級衛(wèi)生行政部門指定的聽力障礙診治機構(gòu)接受進一步診斷，新生兒重癥監(jiān)護病房嬰兒出院前行自動聽性腦干反應(yīng)（AABR）篩查，未通過者直接轉(zhuǎn)診至聽力障礙診治機構(gòu)。診斷流程：（1）病史采集；（2）耳鼻喉科檢查；（3）聽力測試，包括電生理、行為聽力測試，主要為聲導(dǎo)抗（含1 000 Hz探測音）、耳聲發(fā)射（OAE）、聽性腦干反應(yīng)（ABR）及行為測聽等疾病測試；（4）輔助檢查，必要時進行相關(guān)影像學(xué)和實驗室輔助檢查。儀器分別為：診斷型聽覺誘發(fā)電位儀（美國智聽聽覺誘發(fā)電位儀SmartEP M010000），診斷型耳聲發(fā)射儀（美國智聽耳聲發(fā)射儀SmartOAE），診斷型聲導(dǎo)抗儀（日本理音聲導(dǎo)抗儀RS-H1），診斷型聽力計（麥力聲聽力計AD104）。AABR 恒定強度35 dB 小樣本聽力級，測聽標準：測聽方法按照GB/T16403-1996 國家標準；測聽設(shè)備校準按照JJG388-2001 國家標準；校準聽力計標準零級按照GB4854-84 國家標準；測聽環(huán)境按照GB/T16403、GB/T16296國家標準。明確診斷為永久性聽力損失的病兒，須在6個月內(nèi)開展科學(xué)干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練。

1.3 觀察指標（1）統(tǒng)計NGS技術(shù)篩查結(jié)果。（2）新生兒≥2 個耳聾基因位點異常結(jié)果。（3）TEOAE 技術(shù)篩查、復(fù)篩結(jié)果。（4）聽力診斷及NGS技術(shù)聯(lián)合TEO?AE技術(shù)篩查結(jié)果，兩種篩查結(jié)果均為陽性判定為聯(lián)合篩查陽性。（5）分析NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 軟件，計數(shù)資料以例數(shù)描述，篩查價值分析采用受試者操作特征（ROC）曲線，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGS 技術(shù)篩查結(jié)果本組共納入625 例新生兒，NGS 技術(shù)篩查檢出38 例耳聾基因異常（未通過），耳聾基因異常率為6.08%（38/625），其中GJB2基因異常15 例（2.40%），SLC26A4 基因異常17 例（2.72%），GJB3 基因異常3 例（0.48%），MT-RNR1 基因異常1 例（0.16%），MT-CO1 基因異常1 例（0.16%），MT-TL1基因異常1例（0.16%）；587例新生兒NGS技術(shù)篩查通過。見表1。

表1 新生兒NGS技術(shù)篩查結(jié)果（n=625）

2.2 新生兒≥2 個耳聾基因位點異常結(jié)果NGS技術(shù)篩查檢出的38 例耳聾基因異常新生兒中，共有5 例存在≥2 個耳聾基因位點異常，占比0.80%（5/625）。見表2。

表2 新生兒≥2個耳聾基因位點異常結(jié)果（n=625）

2.3 TEOAE 技術(shù)篩查結(jié)果本組共納入625 例新生兒，TEOAE 技術(shù)初篩有53 例未通過，占比8.48%（53/625），第1 次復(fù)篩有40 例未通過，占比6.40%（40/625），第2 次復(fù)篩有32 例未通過，占比5.12%（32/625）；TEOAE 技術(shù)第2 次復(fù)篩未通過的32 例新生兒中，18例未通過雙耳檢測，8例未通過單側(cè)左耳檢測，6例未通過單側(cè)右耳檢測。見表3。

2.4 聽力診斷及NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)篩查結(jié)果NGS 技術(shù)篩查38 例未通過，587 例通過；TEOAE 技術(shù)復(fù)篩32 例未通過，593 例通過；聯(lián)合篩查25 例未通過，600 例通過；最終經(jīng)聽力診斷有23例確診為遺傳性聾，602例聽力診斷。見表4。

表4 聽力診斷及NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE技術(shù)篩查結(jié)果/例

2.5 NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的價值以聽力診斷確診的23 例遺傳性聾新生兒為陽性樣本，602 例聽力正常的新生兒為陰性樣本，繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，NGS 技術(shù)、TEOAE技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的曲線下面積（AUC）分別為0.92、0.88，二者聯(lián)合篩查的AUC為0.98。見表5。

表5 NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的價值

3 討論

新生兒耳聾是導(dǎo)致兒童殘障的重要原因之一，不僅嚴重影響新生兒的生長和發(fā)育，還會給家庭和社會帶來沉重負擔［6-7］。早期發(fā)現(xiàn)新生兒耳聾，盡早開展相關(guān)治療和干預(yù)，對促進病兒健康成長發(fā)育具有重要作用［8］。

新生兒耳聾的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，包括遺傳因素和環(huán)境因素，其中約60%的耳聾是由遺傳因素造成［9］。國際上已鑒定出97 個非綜合征型耳聾基因，共152 個相關(guān)位點，而臨床研究常見耳聾基因以GJB2、SLC26A4、GJB3 等為主［10-11］。近年來，隨著NGS 技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，其能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，因此越來越多的研究者開始利用NGS 技術(shù)增加基因檢測種類，以期盡早發(fā)現(xiàn)耳聾基因異常［12-13］。本研究通過NGS 技術(shù)對新生兒開展遺傳性聾篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)625 例新生兒中6.08%存在耳聾基因異常，與王雪超等［14］報道的6.67%相近，略高于陽彥等［15］報道的4.05%，造成此差異的原因可能與各地遺傳背景、檢測基因位點多等存在差異有關(guān)。耳聾基因異常新生兒中，2.40%為GJB2 基因異常，2.72%為SLC26A4 基因異常，GJB3 基因、MT-RNR1 基因等異常率相對較低，且少部分新生兒存在≥2 個耳聾基因位點異常，與國內(nèi)多項研究［16-17］結(jié)果相近，提示國內(nèi)新生兒耳聾基因異常情況存在一定相似性。而本研究中SLC26A4 基因（2.72%）異常率最高，這種差別可能與地域性差異、二代測序技術(shù)有關(guān)。但部分經(jīng)NGS 技術(shù)篩查未通過的新生兒經(jīng)聽力診斷發(fā)現(xiàn)無明顯聽力損傷，后期隨訪對聲音反應(yīng)較好，這可能與隨訪時間較短有關(guān)，部分病兒哭可能發(fā)生了遲發(fā)性聽力損失，短期隨訪并不能發(fā)現(xiàn)聽力損傷，仍需延長隨訪進一步驗證。也可能與NGS 技術(shù)篩查也存在一定假陽性率有關(guān)，如在新生兒重癥監(jiān)護室中，部分早產(chǎn)兒會因為器官系統(tǒng)不成熟，導(dǎo)致NGS 出現(xiàn)假陽性結(jié)果，隨著早產(chǎn)兒器官系統(tǒng)逐漸成熟，隨訪復(fù)查時聽力系統(tǒng)可表現(xiàn)為正常。由此可見，因此單獨采用NGS 技術(shù)篩查仍存在一定誤診率。

TEOAE 技術(shù)也是耳聾篩查中廣泛應(yīng)用的方法，該技術(shù)以機械振動的形式起源于耳蝸，耳蝸受到外界短暫脈沖聲（一般為短聲或短音，時程在數(shù)毫秒以內(nèi)）刺激后經(jīng)聽骨鏈及鼓膜傳導(dǎo)釋放入外耳道的音頻能量，通過對其進行定量分析以發(fā)現(xiàn)聽力損傷情況［18］。本研究中，TEOAE 技術(shù)初篩8.48%的新生兒未通過，而第1、2 次復(fù)篩未通過率分別為6.40%、5.12%，均有不同程度降低，表明僅采用TEOAE技術(shù)進行初篩并不能滿足篩查需求，其原因可能在于TEOAE 技術(shù)初篩易受多種因素的影響，如新生兒哭鬧、耳道內(nèi)殘留羊水、外耳道中殘留胎脂或存在環(huán)境噪聲，均會影響篩查結(jié)果，因此單次使用TEOAE篩選容易出現(xiàn)錯誤信息，進行復(fù)篩非常有必要［19］。此外，TEOAE 技術(shù)篩查法僅對耳蝸外毛細胞功能狀態(tài)進行測定，若新生兒的聽力損傷源于耳蝸后，其篩查結(jié)果則顯示正常，導(dǎo)致漏診［20］。表明單獨采用TEOAE 技術(shù)對新生兒遺傳性聾進行篩查也存在一定局限性。

本研究通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)在新生兒遺傳性聾篩查方面具有一定價值，兩種技術(shù)聯(lián)合篩查的AUC 達到0.976，靈敏度、特異度分別為95.65%、99.50%，由此可見，NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)能有效提高新生兒遺傳性聾篩查效能，有助于減少誤診漏診，其原因在于聯(lián)合篩查能夠?qū)我缓Y查法進行有效補充，利于提高聽力篩查結(jié)果的可靠性及準確性。

綜上可知，新生兒遺傳性聾篩查采用NGS 技術(shù)、TEOAE 技術(shù)，均能獲得良好篩查結(jié)果，而二者聯(lián)合能有效提高篩查效能，減少誤診漏診，具有較高推廣應(yīng)用價值。但需要注意的是，對NGS 技術(shù)、TEOAE 技術(shù)篩查有一項未通過的新生兒仍有可能發(fā)展為耳聾，仍需定期隨訪和復(fù)查，兩項均通過的新生兒仍有可能發(fā)生遲發(fā)性聽力損失，仍需每3 年至少隨訪1次，但本研究隨訪時間較短，這是本研究的不足，未來工作中仍需進一步完善。