金黃色葡萄球菌對萬古霉素的耐藥性及耐藥基因檢測分析

李倫，張麗娜，王兵，劉彩林

金黃色葡萄球菌（SA）是臨床常見的致病菌，隨著1961 年英國首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）至今，MRSA 檢出率急劇上升，已成為臨床抗感染治療的一大難題［1］。萬古霉素是治療MRSA 感染最常用的藥物和最后防線［2］，然而隨著MRSA 感染率上升和萬古霉素的大量廣泛使用，萬古霉素敏感性降低的MRSA及萬古霉素治療失敗不斷被報道［3］。盡管按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會的判讀折點(diǎn)，MRSA 對萬古霉素仍處于敏感范圍，但國內(nèi)外均有大量研究報道萬古霉素異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌（hVISA）和萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌（VISA），且近年來其檢出率呈上升趨勢，需引起臨床高度重視［4-5］。目前關(guān)于SA 對萬古霉素的具體耐藥機(jī)制尚不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)菌種會通過基因調(diào)控方式來獲得適應(yīng)力［6］，也有研究發(fā)現(xiàn)hVISA 和VISA 細(xì)胞壁相關(guān)代謝基因表達(dá)存在改變［7］。故本研究針對臨床送檢標(biāo)本分離的SA 進(jìn)行萬古霉素耐藥性檢測及基因檢測分析，以期為臨床合理治療控制感染提供參考依據(jù)，詳情如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源選取平頂山市第一人民醫(yī)院2020年4月至2022年3月臨床送檢樣本1 592例，分離出288株SA菌株（均為首次分離），檢出率18.09%。SA樣本來源：膿液173 份（60.07%）、血液34 份（11.80%）、胸腹水32 份（11.11%）、引流液26 份（9.03%）、痰液23份（7.99%），去除重復(fù)菌株。

1.2 抗菌藥物及培養(yǎng)基萬古霉素抗菌藥物、Etest 實(shí)驗(yàn)條、血平板均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，腦心浸液瓊脂基礎(chǔ)和MH 瓊脂基礎(chǔ)由英國Oxoid 公司提供，脫纖維羊血購自鄭州農(nóng)達(dá)生物制品有限公司。

1.3 SA 鑒定及抗菌藥物敏感性檢測試驗(yàn)SA 菌株經(jīng)MH 瓊脂培養(yǎng)后挑選單個菌落，經(jīng)革蘭染色和觸酶試驗(yàn)證實(shí)后用傳統(tǒng)劃線法接種于瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，用法國生物梅里埃公司Vitek 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定和藥敏儀器及紙片擴(kuò)散法進(jìn)行菌株鑒定與藥物敏感性試驗(yàn)，SA 質(zhì)控菌株為ATCC29213 和ATCC25923。采用E-test 法檢測萬古霉素最小抑菌濃度（MIC），按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（2021 年CLSI M100-S31）推薦的方法進(jìn)行操作，按CLSI規(guī)定的臨界值對藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.4 hVISA 的檢測方法用0.85%氯化鈉溶液將SA 菌株制備成濁度為0.5 麥?zhǔn)系木鷳乙?，?jīng)胰蛋白胨大豆肉湯過夜培養(yǎng)后用無菌L棒將原液、1×10-3稀釋懸液、1×10-6稀釋懸液涂于萬古霉素濃度為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L 的腦心浸液瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)48 h，選取生長最好菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算實(shí)際菌落數(shù)，實(shí)際菌落數(shù)=菌落計(jì)數(shù)×相應(yīng)稀釋倍數(shù)。將Mu3 作為陽性對照，采用Graphpad Prism8.0 軟件繪制菌落數(shù)對數(shù)值對萬古霉素濃度的曲線，并計(jì)算曲線下面積，并與Mu3 比較，結(jié)果判讀：比值<0.9 判定為萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌（VSSA），比值≥0.9 且<1.3判定為hVISA，比值≥1.3判讀為VISA［8］。

1.5 基因檢測將SA 菌株接種在血平板上，采用德國QIAGEN 公司生產(chǎn)的Puregene Yeast/Bact 試劑盒提取RNA，采用QuantiTect Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；采用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測pbp4、mgrA、agr、vraS、vraR、icaA、icaR 基因的表達(dá)，以16S RNA 作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)量，其中引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)工具處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s形式描述，不同菌株耐藥基因相對表達(dá)量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)、百分比形式描述，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRSA 檢測結(jié)果及其對常用抗菌藥物敏感性檢測結(jié)果288 株SA 篩選出MRSA 菌株116 株（40.28%），甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）菌株172 株（59.72%）。MRSA 菌株和MSSA 菌株對利奈唑胺、替加環(huán)素、萬古霉素均敏感，見表2。

表2 MRSA和MSSA對常用抗菌藥物敏感性檢測結(jié)果/例（%）

2.2 hVISA 檢測結(jié)果288 株SA 共篩選出25 株hVISA菌株，hVISA陽性率為8.68%，其余263株SA均對萬古霉素敏感，未檢測到VISA菌株和萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（VRSA）菌株。E-test法檢測萬古霉素MIC，結(jié)果顯示VSSA菌株萬古霉素MIC主要分布在0.50 mg/L 和0.75 mg/L，占比為41.83% 和28.90%；hVISA 菌株萬古霉素MIC 主要分布在1.50 mg/L和2.00 mg/L，占比為56.00%和28.00%，見表3。

表3 VSSA菌株與hVISA菌株萬古霉素MIC分布/例（%）

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果VSSA菌株pbp4、agr、icaR基因相對表達(dá)量均明顯高于hVISA（均P<0.05）；VS?SA 菌株mgrA、vraS、vraR、icaA 基因相對表達(dá)量均明顯低于hVISA（均P<0.05），見表4。

表4 VSSA菌株與hVISA菌株耐藥基因相對表達(dá)量/± s

表4 VSSA菌株與hVISA菌株耐藥基因相對表達(dá)量/± s

注：VSSA 為萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌，hVISA 為萬古霉素異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌。

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3 討論

自20 世紀(jì)80 年代起，萬古霉素逐漸成為治療MRSA 引起的重度感染的一線藥物，成為治療重癥SA 感染的重要保障。但隨著耐萬古霉素的腸球菌的出現(xiàn)，有學(xué)者認(rèn)為SA很有可能從耐萬古霉素腸球菌中獲得vanA 耐藥基因進(jìn)而對萬古霉素產(chǎn)生耐藥［9］，雖然至今尚未在SA 中檢測到vanA 耐藥基因，但隨著hVISA 和VISA 的出現(xiàn)，國內(nèi)外陸續(xù)有關(guān)于萬古霉素治療SA的敏感性下降問題的相關(guān)報道出現(xiàn)。因此，檢測分析SA 對萬古霉素的耐藥基因的意義重大。

本研究對近兩年來臨床送檢樣本分離的288株SA 菌株進(jìn)行耐藥性檢測，其中MRSA 菌株占40.28%，由此可見SA 對甲氧西林抗菌藥物的耐藥情況較為嚴(yán)重，分析其原因：MRSA 具有廣譜耐藥性，臨床檢出率較高可能與治療時不規(guī)范使用抗生素有關(guān)，且MRSA以定植或接觸傳播，消毒隔離不到位及免疫力低下、不注重手衛(wèi)生病人均易引起MRSA 感染傳播，需引起臨床高度重視。hVISA 被認(rèn)為是VISA 的前體，可能會進(jìn)化為VISA，本研究通過藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)：288 株SA 菌株檢出25 株hVISA 菌株，hVISA 陽性率為8.68%，表明SA 對萬古霉素存在一定的耐藥趨向。另外，本研究發(fā)現(xiàn)VS?SA 菌株萬古霉素MIC 主要分布在0.50 mg/L 和0.75 mg/L，而hVISA 菌株萬古霉素MIC 主要分布在1.50 mg/L 和2.00 mg/L，提示在萬古霉素高M(jìn)IC 可能是發(fā)生SA 耐萬古霉素的征兆。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)MRSA 分離株中萬古霉素MIC升高，均值從1.3 mg/L增加1.5 mg/L，并與治療失敗可能相關(guān)［10］，故臨床需高度重視。

目前，有學(xué)者認(rèn)為SA對萬古霉素的耐藥性主要是由細(xì)菌的細(xì)胞壁增厚引起的［11］。既往研究在VI?SA 菌株中發(fā)現(xiàn)，walk 等基因發(fā)生部分突變會導(dǎo)致細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因發(fā)生改變，使細(xì)菌的細(xì)胞壁增厚，藥物的敏感度被削弱［12］。劉明濤等［13］發(fā)現(xiàn)在大部分的hVISA 菌株中出現(xiàn)了walk 基因突變，且均為點(diǎn)突變，而walk 屬于walkR 二元信號系統(tǒng)，該系統(tǒng)可調(diào)控細(xì)胞壁代謝的上游基因atlA、ssaA、isaA、lytM，使其表達(dá)下調(diào)，從而減緩細(xì)胞壁的代謝，使細(xì)胞壁的厚度明顯增加，從而使細(xì)菌對萬古霉素的敏感度削弱，耐藥性上升。此外，SA 對萬古霉素的耐藥性增強(qiáng)還與ropB（編碼DNA 依賴的RNA 聚合酶亞單位）、graSR（編碼雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)）等多處基因位點(diǎn)突變相關(guān)［5，14-15］。本研究據(jù)此通過篩選可能參與SA 發(fā)生萬古霉素耐藥的基因，并對比其在VSSA菌株和hVISA 菌株中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)VSSA 菌株pbp4、agr、icaR 的相對表達(dá)量均明顯高于hVISA 菌株，而mgrA、vraS、vraR、icaA 的相對表達(dá)量均明顯低于hVISA 菌株，提示上述基因可能介導(dǎo)hVISA 的轉(zhuǎn)化，并可能參與SA 耐萬古霉素的機(jī)制。pbp4 具有羧肽酶活性，參與了SA 細(xì)胞壁肽聚糖的二級交聯(lián)，pbp4 水平下降使肽聚糖交聯(lián)減少，致使萬古霉素易被D-丙胺酰-D-丙氨酸側(cè)鏈結(jié)合而被阻于細(xì)胞膜外，難以發(fā)揮抗菌活性，因而表現(xiàn)出對萬古霉素耐藥性［16］。agr 是存在于SA 的數(shù)量感應(yīng)基因簇，其水平下調(diào)可促進(jìn)菌體表面膜蛋白的表達(dá)，促進(jìn)生物膜形成，有利于提升耐藥性。Chen 等［17］研究發(fā)現(xiàn)VSSA 向hVISA 轉(zhuǎn)換過程中，菌株會出現(xiàn)agr 基因C位點(diǎn)丟失，agr 水平下調(diào)，且既往也有研究報道hVI?SA 菌株中agr 功能缺失株的比例顯著高于VS?SA［18］，本研究與上述結(jié)果一致，均證實(shí)了hVISA 菌株中agr 的低表達(dá)，可能與萬古霉素耐藥有關(guān)。icaR 與生物膜的形成相關(guān)，且其水平與生物膜形成呈負(fù)相關(guān)［19］，在hVISA 中低表達(dá)利于SA 菌的細(xì)胞壁的形成，導(dǎo)致耐藥性強(qiáng)。劉彩林等［18］發(fā)現(xiàn)mgrA是一個與生物膜的形成呈正相關(guān)多效調(diào)節(jié)器，可激動8 型莢膜多糖，抑制蛋白a-毒素、凝固酶和蛋白酶等的活性，在hVISA菌株中的表達(dá)水平明顯升高，本研究與其結(jié)果均證實(shí)高表達(dá)的mgrA 對hVISA 菌株的耐藥性發(fā)揮促進(jìn)作用。vraS 與vraR 共同組成vraSR磷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其可感應(yīng)各種因素引起的細(xì)胞壁破壞，并快速應(yīng)答，正向調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的生物合成，增加細(xì)胞壁厚度保證細(xì)胞壁完整，兩者的表達(dá)水平上調(diào)均與hVISA菌株的細(xì)胞壁增厚密切相關(guān)［20］。icaA 是ica 操縱子第1 個基因，具有編碼N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，促生物膜生成的作用，icaA 高表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞壁厚度增加［21］，故猜測hVI?SA菌株中icaA表達(dá)量高會增厚菌株細(xì)胞壁，導(dǎo)致其對萬古霉素的耐藥性增強(qiáng)。

綜上所述，SA中hVISA陽性率為8.68%，SA對萬古霉素已存在異質(zhì)性中介耐藥性，pbp4、agr、icaR 低表達(dá)與mgrA、vraS、vraR、icaA高表達(dá)均可能與hVISA株流行和萬古霉素耐藥性增強(qiáng)有關(guān)。本研究探討了SA 對萬古霉素的耐藥性及可能參與耐藥的基因作用，為進(jìn)一步深入探討SA對萬古霉素耐藥的機(jī)制提供了重要的參考依據(jù)，具有重要的臨床意義。