復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組密碼子偏好性分析

肖明昆聶愷宏沈紹斌劉 倩段春芳李月仙張林輝

（1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南 保山 678000；2. 四川省廣元市昭化區(qū)林業(yè)局，四川 廣元 628000）

葉綠體是具有完整母系遺傳信息的細(xì)胞器，其基因組序列信息可以探究物種起源進(jìn)化，判定物種間親緣關(guān)系[1-2]，對(duì)植物基因組學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展也起著重要作用[3]。根據(jù)最優(yōu)密碼子設(shè)計(jì)的葉綠體基因表達(dá)載體，有助于選擇與目的基因契合度高的葉綠體基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而提高葉綠體基因組中基因表達(dá)量[4-5]。因此，開(kāi)展葉綠體基因組密碼子使用模式研究，有助于了解物種進(jìn)化歷程，提高葉綠體外源基因的表達(dá)量[6]。

密碼子是信使核糖核酸上編碼氨基酸的三聯(lián)體核苷酸序列。通常編碼同一個(gè)氨基酸的幾個(gè)同義密碼子在無(wú)選擇壓力和中性突變的情況下，使用頻率應(yīng)該相同。但實(shí)際上它們是非隨機(jī)使用的，往往傾向于使用某一種密碼子，這種現(xiàn)象稱(chēng)為密碼子偏好性[7-9]。密碼子偏好性是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化演變中逐漸形成的，借助密碼子偏性分析可以更好地理解分子進(jìn)化、基因調(diào)控等生命過(guò)程，對(duì)探究物種進(jìn)化和提高外源基因的表達(dá)具有重要意義[10]。

復(fù)羽葉欒樹(shù)（Koelreuteria bipinnata）為無(wú)患子科欒樹(shù)屬喬木，野生種群分布于云南、四川、貴州、湖南、湖北等省區(qū)[11]，該植物具有樹(shù)干通直、枝葉茂密、花果艷麗、季相色彩變化明顯的特征，是園林綠化中觀花和觀果的優(yōu)良樹(shù)種[12]。此外該物種還對(duì)石灰?guī)r山地具有很好的適應(yīng)性，是石漠化地區(qū)植被恢復(fù)和重建的優(yōu)選物種，有極高的生態(tài)價(jià)值[13]。還有研究表明，復(fù)羽葉欒樹(shù)種仁含有多種脂肪酸及氨基酸，具有開(kāi)發(fā)成營(yíng)養(yǎng)品、保健品或者飼料添加劑的廣闊前景，是一種具有很高開(kāi)發(fā)價(jià)值的植物資源[14]。目前，有關(guān)復(fù)羽葉欒樹(shù)的研究多集中于種苗培育[15]、逆境脅迫[13]、種子生理生化[14,16]等方面。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，雖已完成對(duì)復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組的測(cè)序、拼裝和注釋[17]，但是關(guān)于復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體密碼子使用偏好性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組全序列為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)葉綠體基因組密碼子的使用偏性的影響因素分析，確定復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組密碼子的使用偏好性，并篩選出最優(yōu)密碼子，可為復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組在基因工程的應(yīng)用和研究提供理論依據(jù)。此外有助于從基因水平分析物種間的親緣關(guān)系及物種的進(jìn)化發(fā)展，為揭示葉綠體的起源與進(jìn)化提供參考依據(jù)[18]。

1 材料與方法

1.1 材料

在云南省保山市隆陽(yáng)區(qū)采集新鮮幼嫩、完整的復(fù)羽葉欒樹(shù)葉片，樣品保存于干冰中。葉綠體基因組測(cè)序由浙江安諾優(yōu)達(dá)生物科技有限公司完成，后將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心（NCBI）（登錄號(hào)：MW387267）。對(duì)復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組進(jìn)行分析時(shí)，從87 條CDS（coding DNA sequence）中剔除序列長(zhǎng)度不足300 bp、存在終止密碼子的序列及重復(fù)基因，篩選出52 條基因序列用于最終數(shù)據(jù)分析。

1.2 方法

1.2.1 相對(duì)同義密碼子使用度分析

運(yùn)用Codon W 1.4.2 軟件分析復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組中篩選到的52 條CDS，獲取各CDS 的有效密碼子數(shù)（ENC）、同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）。通過(guò)在線(xiàn)軟件CUSP 分析獲得不同基因的GC 總含量（GC）及各個(gè)密碼子第1 位（GC1）、第2 位（GC2）、第3 位堿基的GC（GC3）含量，并根據(jù)獲得的參數(shù)繪制相關(guān)性熱圖[19-20]。

1.2.2 中性繪圖分析

以GC3為橫坐標(biāo)、GC12（GC1和GC2的平均值）為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，對(duì)兩者相關(guān)性進(jìn)行分析。若GC12與GC3之間的相關(guān)關(guān)系不顯著，說(shuō)明第 1、2 位與第3 位的密碼子堿基組成具有差異，選擇為偏好性的主要影響因素。反之，則突變是密碼子偏好性的主要影響因素[21-22]。

1.2.3 ENC-plot 繪圖分析

以ENC 值為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)進(jìn)行二維散點(diǎn)圖的繪制。若散點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)附近，則突變是該基因密碼子偏性的主要影響因素。若散點(diǎn)距離標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)較遠(yuǎn)，則選擇是該基因密碼子偏性的主要影響因素[23]。ENC 的理論取值為20～61，其值越接近20 偏性越強(qiáng)，其值越接近61 偏性越弱[24-25]。一般當(dāng) ENC 值＞ 35 時(shí)，表明密碼子的偏性較弱，反之，則強(qiáng)[21]。

顧名思義，人生價(jià)值觀是指關(guān)于人生價(jià)值的根本觀點(diǎn)和看法，說(shuō)到底就是對(duì)人生目的和人生意義的認(rèn)識(shí)。人生價(jià)值觀決定人生態(tài)度。而人生價(jià)值觀又是由人生的理想和信念所決定。有了偉大的理想和信念才能樹(shù)立正確的人生價(jià)值觀。因此，我們論及方志敏的人生價(jià)值觀，首先必須了解方志敏的人生理想和信念。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式：

1.2.4 PR2-plot 分析

PR2-plot 繪圖分析時(shí)將A3/(A3+ T3)作為縱坐標(biāo)，G3/(G3+ C3)作為橫坐標(biāo)。圖的中心點(diǎn)值為A=T 且C=G，其余點(diǎn)與中心點(diǎn)的矢量距離表示偏性程度和方向[26-28]。

1.2.5 最優(yōu)密碼子的確定

以復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因52 條CDS 的ENC值為偏好性標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其52 條CDS 的ENC 值進(jìn)行排序，由低到高對(duì)其進(jìn)行排序，分別選出兩端10%的基因，構(gòu)建高低偏性基因庫(kù)[29]，ENC 值小的為高表達(dá)庫(kù)，ENC 值大的為低表達(dá)庫(kù)[30]。將同時(shí)滿(mǎn)足高頻密碼子（ RSCU＞1）和高表達(dá)密碼子（ΔRSCU≥0.08）的密碼子定為復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子[31-32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)羽葉欒樹(shù)密碼子堿基組成

利用Codon W 1.4.2 和在線(xiàn)軟件CUSP 對(duì)符合要求的CDS 的堿基組成及ENC 值進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果顯示，所有CDS 序列的GC1、GC2、GC3分別為47.27%、39.49%、29.84%，平均GC含量為38.87%。3 個(gè)密碼子位置的GC 含量由高到低表現(xiàn)為GC1＞GC2＞GC3，說(shuō)明復(fù)羽葉欒樹(shù)密碼子3 個(gè)位置的堿基組成不均衡，葉綠體基因密碼子偏好AU 堿基。對(duì)復(fù)羽葉欒樹(shù)的ENC 值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)羽葉欒樹(shù)各 CDS 的ENC 值在36～61 之間，52 條CDS 序列的ENC 值均大于35，說(shuō)明復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組密碼子偏好性弱。

圖 1 復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組不同位置的GC 含量Fig. 1 GC content of different positions in the chloroplast genome of K. bipinnata

圖 2 葉綠體基因組密碼子各參數(shù)的相關(guān)性分析Fig. 2 Correlation analysis of each codon parameters ofchloroplast genome

表 1 復(fù)羽葉欒樹(shù)各氨基酸的RSCU 分析Table 1 RSCU analysis of each amino acid in K. bipinnata

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析表明（圖3），GC12在0.220～0.379 之間，GC3在0.187～0.568 之間，相關(guān)分析顯示，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.198，相關(guān)性不顯著，回歸系數(shù)為0.265 2。說(shuō)明GC1、GC2、GC3的堿基組成存在差異，因此，推論復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基密碼子的使用偏性主要受到選擇的影響。

圖 3 復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組中性繪圖分析Fig. 3 Neutrality plot analysis in the chloroplast genome of K. bipinnata

2.3 ENC-plot 分析

ENC-plot 分析顯示（圖4），復(fù)羽葉欒樹(shù)的部分基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)周?chē)植?，而大部分基因落在?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)下方，離標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)較遠(yuǎn)。進(jìn)一步確定基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的距離，對(duì)ENC 比值進(jìn)行計(jì)算（表2），發(fā)現(xiàn)ENC 比值在-0.05～0.05 區(qū)間的有18 個(gè)，與預(yù)期ENC 值較為接近，而約65.4%的基因與預(yù)期ENC 值差距較大。因此，選擇是復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組密碼子使用偏好性關(guān)鍵影響因素，其他因素的影響較弱。

圖 4 復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組ENC-plot繪圖分析Fig. 4 ENC-plot analysis in the chloroplast genome ofK. bipinnata

表 2 復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組有效密碼子數(shù)比值頻數(shù)分布Table 2 Distribution of ENC ratio in the chloroplast genome of K. bipinnata

2.4 PR2-plot 分析

通過(guò) PR2-plot 繪圖分析（圖5），發(fā)現(xiàn)圖中4 個(gè)區(qū)域中的基因位點(diǎn)呈現(xiàn)不均勻分布，多數(shù)處在中心點(diǎn)稍右下位置，說(shuō)明在第3 位堿基的選擇上密碼子具有偏好性，且堿基的使用頻率表現(xiàn)為T(mén)＞A、G＞C。因此，復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組密碼子偏好性主要受到選擇的影響，還可能受到突變等其他因素的影響。

圖 5 復(fù)羽葉欒樹(shù)密碼子奇偶偏好性分析Fig. 5 Analysis of PR2-plot of codon bias ofK. bipinnata

2.5 最優(yōu)密碼子的確定

根據(jù)表3，將同時(shí)滿(mǎn)足RSCU＞1、ΔRSCU≥0.08 兩個(gè)條件的密碼子確定為最優(yōu)密碼子，最終篩選出了12 個(gè)最優(yōu)密碼子（CUU、GUU、AGU、GCA、CAA、CAU、AAA、GAU、CGU、CGA、GGU、GGA），其中7 個(gè)以U 結(jié)尾，5 個(gè)以A結(jié)尾。

表 3 復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組最優(yōu)密碼子的確定Table 3 Determination of optimal codons in the chloroplast genome of K. bipinnata

3 結(jié)論與討論

自然界常見(jiàn)的20 種氨基酸，除蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）由 1 個(gè)密碼子編碼外，其余18 種均由2～6 個(gè)密碼子編碼。編碼同一種氨基酸的密碼子稱(chēng)為同義密碼子。理論上在沒(méi)有突變和進(jìn)化壓力等因素下，mRNA 翻譯時(shí)同義密碼子的使用頻率應(yīng)相等[33]，但在實(shí)際情況中，同義密碼子的使用頻率表現(xiàn)出很大差異，由此造成了同義密碼子使用偏性。本研究依托復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組數(shù)據(jù)，以篩選出的52 條完整CDS 序列為研究對(duì)象，對(duì)其密碼子的堿基構(gòu)成及偏好性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組的密碼子使用頻率AU＞CG，總體上偏好使用堿基為A/U的密碼子。在燈盞花（Erigeron breviscapus）[5]、秋茄（Kandelia obovata）[34]、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[35]等物種的研究中也得出類(lèi)似結(jié)論，這些研究均指出葉綠體基因組密碼子使用模式中偏好使用A/U 堿基。而對(duì)芒果（Mangifera indica）[31]等的研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體基因組偏好使用G/C 堿基，這與本研究結(jié)果不一致。

研究表明，影響氨基酸密碼子偏好性的原因除了突變和自然選擇外，還與堿基的組成差異、基因編碼結(jié)構(gòu)和 tRNA 豐度、GC 含量、基因長(zhǎng)度等因素有關(guān)[8]。綜合分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組密碼子偏好性關(guān)鍵受到自然選擇的影響，在對(duì)藿香（Agastache rugosa）[36]、紫苜蓿（Medicago sativa）[37]、灰毛漿果楝（Cipadessa baccifera）[32]、抽筒竹（Gelidocalamus tessellatus）[22]等植物的研究中也得到了相似結(jié)果。但在對(duì)蒺藜苜蓿[35]、薔薇科果樹(shù)[38]、乳油木（Vitellaria paradoxa）[39]、籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus）[40]等植物的研究中指出，突變是影響葉綠體基因組密碼子偏好性的因素。由此可見(jiàn)，影響不同植物葉綠體密碼子偏好性的主要因素不同，植物葉綠體密碼子偏好性受到多種因素影響。從進(jìn)化學(xué)角度上看這種差異很可能與不同物種對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)相關(guān)。本研究中GC3、ENC 與基因長(zhǎng)度無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明基因長(zhǎng)度對(duì)密碼子偏好影響并不大，這與梁曉靜等[41]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明密碼子偏好性影響因素具有一定的相似性。但也有研究表明基因長(zhǎng)度對(duì)密碼子偏性有影響，可見(jiàn)密碼子偏性的影響因素不僅因物種而異還受多種未知因素影響。

本研究將RSCU＞1 且ΔRSCU≥0.08 的密碼子確定為高表達(dá)密碼子，最終篩選出了復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組的12 個(gè)最優(yōu)密碼子（CUU、GUU、AGU、GCA、CAA、CAU、AAA、GAU、CGU、CGA、GGU、GGA），其中7 個(gè)以U 結(jié)尾，5 個(gè)以A 結(jié)尾，這與上述復(fù)羽葉欒樹(shù)葉綠體基因組密碼子偏好使用A 或U 結(jié)尾密碼子的結(jié)論相一致。