外源脯氨酸對大葉樟幼苗堿脅迫的緩解效應(yīng)研究

張麗華 韓浩章 李素華 趙 榮 王 芳 王曉立

（宿遷學(xué)院建筑工程學(xué)院，江蘇 宿遷 223800）

大葉樟(Cinnamomum septentrionale)又稱銀木，為樟科（Lauraceae）、樟屬（Cinnamomum）常綠喬木，主產(chǎn)于我國南方地區(qū)，是我國重要的造林綠化樹種和經(jīng)濟(jì)樹種，生長迅速，樹形美觀，適應(yīng)性強(qiáng)[1]。前人的研究主要集中于引種栽培[2]、繁殖技術(shù)[3]、光合生理[4]和遺傳多樣性[5]等方面，金晶等[6]、李曉儲等[2]、趙昌恒等[4]的研究認(rèn)為，大葉樟比香樟（C. camphora）有更強(qiáng)的抗低溫和耐鹽堿能力，可在華東地區(qū)進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。王夢軍等[7]于2018 年將大葉樟作為綠化樹種引種到西安地區(qū)進(jìn)行栽培，認(rèn)為大葉樟在-10 ℃條件下可以正常生長，大葉樟在我國北方地區(qū)引種栽培成為可能，而我國北方部分地區(qū)城區(qū)綠地土壤的pH 值為8.4～9.0，堿化程度高于南方地區(qū)，營養(yǎng)元素缺乏，有機(jī)質(zhì)含量普遍較低[8]，影響大葉樟的生產(chǎn)栽培，經(jīng)常會出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象。相對于鹽脅迫，堿脅迫對植物的傷害程度更高，往往會導(dǎo)致植物光合能力明顯下降，植物抗氧化酶系統(tǒng)明顯受損，植物體內(nèi)礦質(zhì)元素的平衡被打破，根系生長受抑制，養(yǎng)分吸收困難[9]。植物對堿脅迫響應(yīng)機(jī)制亦十分復(fù)雜，通常包括滲透調(diào)節(jié)、抗氧化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、代謝途徑改變、細(xì)胞膜穩(wěn)定性等方面，最近有報(bào)道氨基酸和有機(jī)酸等次生代謝物質(zhì)參與植物適應(yīng)逆境脅迫[10-11]。相同堿處理下，耐堿性強(qiáng)的蕓豆（Peppermint extract）品種根系分泌物中含有更多的總氨基酸和有機(jī)酸[12]，脯氨酸和甜菜堿含量在高濃度堿脅迫下的增幅大于鹽脅迫[13]。前期研究表明，堿脅迫下猴樟（C. bodinieri）體內(nèi)的脯氨酸明顯高于普通香樟，脯氨酸與樟屬植物耐堿脅迫過程有關(guān)[14]。對櫸樹（Zelkova schneideriana）[15]、銀杏（Ginkgo biloba）[16]、白花泡桐（Paulownia fortunei）[17]的研究結(jié)果也表明，堿脅迫條件下植物體內(nèi)的脯氨酸含量會顯著提高，抗性強(qiáng)的樹種中含有更高的脯氨酸。外源施用脯氨酸能夠促進(jìn)植物光合能力和水分利用能力[18-19]，還能通過誘導(dǎo)華北紫丁香（Syringa oblata）抗氧化酶活性提高抗逆境脅迫能力[20]。目前關(guān)于外源脯氨酸對樟屬植物耐堿脅迫的緩解作用及其調(diào)控機(jī)理研究較少，基于此，本研究以大葉樟幼苗為材料，初步研究外源脯氨酸離子對大葉樟幼苗堿脅迫的緩解效應(yīng)，以期為大葉樟耐堿脅迫機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為樟屬植物資源圃1 年生盆栽大葉樟幼苗，共90 盆，每盆3 株，共分6 個(gè)處理，每處理15 盆，苗高 (25 ± 2) cm。于2019 年10 月2 日選擇生長健康的大葉樟母樹采種，經(jīng)低溫沙藏處理后，2020 年2 月6 日播種，120 d 后移栽于盆中，栽培基質(zhì)為基地田園土，土壤pH 7.51，土壤電導(dǎo)率810 μs/cm，土壤有機(jī)質(zhì)含量12.55 g/kg。盆栽苗在玻璃溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，正常管理。

1.2 處理方法

在前期研究基礎(chǔ)上[9]，選擇150 mmol/L 的Na2CO3溶液作為堿脅迫處理濃度（超過150 mmol/L 的Na2CO3溶液處理時(shí)，種苗表現(xiàn)生長不良現(xiàn)象），于2021 年3 月12 日 上 午9：00，按800 mL/盆標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行澆灌處理，當(dāng)日下午3：00 外源噴施濃度分別為0（CK）、50、100、150、200 mmol/L的脯氨酸溶液200 mL，至葉面滴水為止，剩余溶液澆施于盆內(nèi)土壤中，之后正常管理。培養(yǎng)14 d后，各處理的土壤pH分別為8.51、8.62、8.47、8.40、8.65，同時(shí)檢測大葉樟幼苗葉片葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、相對電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蘋果酸含量、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和總抗氧化能力，3 次重復(fù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葉片葉綠素含量及其熒光參數(shù)測定

葉綠素含量測定采用乙醇法[21]；葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用Yaxin-1161G 葉綠素?zé)晒鈨x（北京雅欣理儀科技有限公司，北京）選擇種苗中部成熟葉片進(jìn)行測定，整株植物暗適應(yīng)30 min 后，測定初始熒光（Fo）和最大熒光（Fm）；光適應(yīng)下測定最大熒光（Fm'），穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）穩(wěn)定后，打開遠(yuǎn)紅光測定光適應(yīng)下的最小熒光（Fo'）；參照尹勇剛等[22]的方法，分別計(jì)算PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）和非光化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）。

1.3.2 葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化能力測定

葉片可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[21]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[21]；脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸法[21]；有機(jī)酸含量采用酸堿滴定法，其中蘋果酸的換算系數(shù)為0.067[21]；相對電導(dǎo)率采用抽氣法[21]，MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[21]，POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘減少0.01 個(gè)OD 值為1 個(gè)活力單位[21]；SOD 活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）法，以NBT 光化還原抑制率為50%時(shí)所用的酶量為1 個(gè)活力單位[21]；CAT 活性采用高錳酸鉀滴定法，以每克鮮質(zhì)量樣品1 min 內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)為酶活力[21]；PAL 活性采用紫外分光光度法，以每小時(shí)在290 nm 處OD 值增加0.01 所需酶量為1 個(gè)活力單位[21]；總抗氧化能力采用FRAP 法，以達(dá)到同樣吸光度值所需的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫摩爾數(shù)定義為FRAP 值[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將 所 測 定 的 數(shù) 據(jù) 輸 入Microsoft Excel 2010，采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，不同處理間的顯著差異分析采用最小顯著差數(shù)法（LSD）。采用隸屬函數(shù)法對外源脯氨酸緩解大葉樟幼苗堿脅迫的效果進(jìn)行綜合評價(jià)，計(jì)算各處理的抗堿綜合評價(jià)值（Dj），Dj表示j處理的抗堿性綜合評價(jià)值[14]。其中與大葉樟盆栽幼苗耐堿性成正相關(guān)的葉綠素含量、Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蘋果酸含量、SOD活性、POD 活性、CAT 活性和總抗氧化能力采用公式（1）計(jì)算隸屬函數(shù)值（U）；對與盆栽幼苗抗堿性成負(fù)相關(guān)的MDA 含量、相對電導(dǎo)率和PAL 活性采用公式（2）計(jì)算隸屬函數(shù)值（U）。

式中：i表示某個(gè)指標(biāo)，j表示某個(gè)處理，Uij表示i指標(biāo)j處理的抗堿性綜合評價(jià)隸屬函數(shù)值，Xij表示i指標(biāo)j處理的實(shí)際測定值，Xjmin表示該指標(biāo)所有測定值中的最小值，Xjmax表示該指標(biāo)所有測定值中的最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源脯氨酸處理對堿脅迫下大葉樟幼苗葉綠素含量及其熒光參數(shù)的影響

由表1 可知，外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫下大葉樟幼苗的葉綠素含量。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗的葉綠素含量呈先上升后下降趨勢，在100 mmol/L 的脯氨酸處理?xiàng)l件下，葉綠素含量達(dá)最高點(diǎn)，高于CK 26.53%，200 mmol/L脯氨酸處理時(shí)，葉綠素含量與CK 差異不顯著；外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫下大葉樟幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗的Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP呈先上升后下降趨勢，在100 mmol/L 的脯氨酸處理?xiàng)l件下，qN、qP達(dá)最高點(diǎn)，分別高于CK 1 057.14%和60%，在150 mmol/L 的脯氨酸處理?xiàng)l件下，F(xiàn)o、Fm、Fv/Fm達(dá)最高點(diǎn)，分別高于CK 103.65%、184.21%和77.78%，200 mmol/L 脯氨酸處理時(shí)，qP與CK 差異不顯著，F(xiàn)o、Fm、qN顯著高于CK（P＜0.05），而Fv/Fm顯著低于CK（P＜0.05）。

表 1 脯氨酸和Na2CO3混合處理?xiàng)l件下大葉樟幼苗的葉綠素含量及其熒光參數(shù)Table 1 Chlorophyll content and fluorescence parameters of C. septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.2 外源脯氨酸處理對堿脅迫下大葉樟幼苗滲透調(diào)節(jié)能力的影響

由表2 可知，外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫條件下大葉樟幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗的MDA 含量和相對電導(dǎo)率基本呈下降趨勢，在超過150 mmol/L 脯氨酸處理后達(dá)最低值，分別低于CK 30.52%和33.70%，200 mmol/L 脯氨酸處理時(shí)仍明顯低于CK（P＜0.05）；外源脯氨酸處理下大葉樟幼苗的可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和蘋果酸含量均呈先上升后下降的趨勢，可溶性糖含量呈逐步上升趨勢；150 mmol/L 的脯氨酸處理時(shí)大葉樟幼苗的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量達(dá)最高值，分別高于CK 7.17%和49.85%，在100 mmol/L 的脯氨酸處理時(shí)蘋果酸含量達(dá)最高值，高于CK 187.88%；200 mmol/L 脯氨酸處理時(shí)可溶性糖含量達(dá)最高值，高于CK 16.16%，而此時(shí)葉片中的脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、蘋果酸含量與CK 差異不顯著。

表 2 脯氨酸和Na2CO3混合處理?xiàng)l件下大葉樟幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力Table 2 Osmotic regulation ability of C.septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.3 外源脯氨酸處理對堿脅迫下大葉樟幼苗抗氧化能力的影響

由表3 可知，外源脯氨酸處理明顯提高大葉樟幼苗在堿脅迫下的抗氧化能力。隨脯氨酸處理濃度的提高，大葉樟幼苗SOD、POD、CAT 活力和總抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，其中POD、CAT 活力的最高值出現(xiàn)在100 mmol/L 的脯氨酸處理時(shí)，分別高于CK 64.49%和228.76%，SOD 活力和總抗氧化能力的最高值出現(xiàn)在150 mmol/L 的脯氨酸處理時(shí)，分別高于CK 59.66%和84.10%；PAL 活力呈先下降后上升趨勢，在150 mmol/L 的脯氨酸處理時(shí)達(dá)最低點(diǎn)，顯著低于CK 22.08%；200 mmol/L 的脯氨酸處理時(shí)，SOD 和POD 活力顯著高于CK（P＜0.05），而總抗氧化能力、CAT 和PAL 活力與CK 差異不顯著。

表 3 脯氨酸和Na2CO3混合處理?xiàng)l件下大葉樟幼苗的抗氧化能力Table 3 Antioxidant capacity of C.septentrionaleseedlings treated with proline and Na2CO3

2.4 外源脯氨酸處理緩解大葉樟幼苗堿脅迫綜合能力評價(jià)

綜合評價(jià)值（D）能量化反映植物對堿脅迫環(huán)境的綜合抵抗能力，D值在0 ~ 1 之間，D值越大則表示植物抗堿脅迫能力越強(qiáng)。由圖1 可知，隨著外源脯氨酸處理濃度的增加，大葉樟盆栽幼苗的耐堿脅迫能力綜合評價(jià)值呈先上升后下降的趨勢，在150 mmol/L 脯氨酸處理?xiàng)l件下達(dá)最大值0.917，在200 mmol/L 脯氨酸處理時(shí)D值迅速下降至0.386，但仍高于CK，外源脯氨酸處理明顯提高了大葉樟的耐堿脅迫能力。

圖 1 外源脯氨酸處理后大葉樟幼苗耐堿脅迫能力綜合評價(jià)值Fig. 1 Comprehensive evaluation value of alkali stress tolerance ofC.septentrionaleseedlings treated with exogenous proline

3 結(jié)論與討論

植物適應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制非常復(fù)雜，氨基酸和有機(jī)酸等次生代謝物質(zhì)的含量增加是植物適應(yīng)逆境脅迫過程的主要措施之一，除了滲透調(diào)節(jié)外，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)離子平衡，穩(wěn)定膜的結(jié)構(gòu)與功能[10-11]，外源施用脯氨酸能誘導(dǎo)鹽脅迫下脯氨酸合成相關(guān)酶P5CS 基因表達(dá)量下降和脯氨酸脫氫酶PDH 基因表達(dá)量的提高，促進(jìn)植物對脯氨酸的利用能力[23-24]，保障植物莖和根系的正常生長[25]。在本研究中，適宜濃度（100 ~ 150 mmol/L）的外源脯氨酸處理明顯提高堿脅迫下大葉樟幼苗的葉綠素含量、Fo、Fm、Fv/Fm、qN、qP，降低電導(dǎo)率和MDA 含量，提高可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、蘋果酸含量和脯氨酸含量，明顯提高SOD、POD、CAT 活性和總抗氧化能力，降低PAL 活性，提高了植物抗堿脅迫能力，與Wani 等[26]關(guān)于油菜（Brassica napus）、Hossain 等[27]關(guān)于綠豆（Vigna radiata）、Zheng 等[28]關(guān)于凹葉柃木（Eurya emarginata）的研究結(jié)果一致；逆境脅迫下，游離脯氨酸除了參與滲透調(diào)節(jié)外，還能穩(wěn)定膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，清除活性氧，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)[20]。葉綠素是植物主要的光合色素，以蛋白復(fù)合體的形式存在于葉綠體內(nèi)的類囊體膜上，通過吸收和傳遞光能參與光合作用中的能量分配，其含量變化與植物光合功能相關(guān)[29]。逆境脅迫會導(dǎo)致植物的葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，光系統(tǒng)功能受損，葉綠素降解，活性氧含量增加[30]。Fo是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應(yīng)中心處于關(guān)閉時(shí)的初始熒光產(chǎn)量[31]，光系統(tǒng)功能受損與葉綠素含量增加均會導(dǎo)致Fo升高[22]。外源脯氨酸處理提高大葉樟內(nèi)源脯氨酸含量，提高對葉綠體結(jié)構(gòu)和葉綠素復(fù)合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高葉綠素含量，從而一定程度提高了Fo，與尹勇剛等[22]對葡萄（Vitisvinifera）的研究結(jié)果一致。葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，人們通常用Fm反映通過PSⅡ的電子傳遞情況，用Fv/Fm值體現(xiàn)PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)原初光能的轉(zhuǎn)換效率（最大轉(zhuǎn)換效率），用光化學(xué)反應(yīng)猝滅系數(shù)（qP）反映光化學(xué)活性的高低。逆境脅迫下，植物葉片F(xiàn)m、Fv/Fm、qP值通常會下降[30-31]，而外源脯氨酸處理能提高Fm、Fv/Fm、qP，提高了堿脅迫下大葉樟的光能利用能力。非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）通常代表PSⅡ吸收的光能中以熱的形式耗散掉的部分，反映了光能耗散為熱的能力[31]，不同植物qN在逆境條件下的變化規(guī)律不盡相同，金星宇等[31]、包穎等[32]的研究認(rèn)為qN隨鹽濃度提高和脅迫時(shí)間的延長而提高，光合結(jié)構(gòu)受損，而賀立紅等[33]對銀杏（Ginkgo biloba）、王舒甜等[34]對香樟的研究結(jié)論認(rèn)為，逆境脅迫下植物通過非光化學(xué)淬滅提高熱耗散來消耗更多的激發(fā)能以適應(yīng)脅迫環(huán)境[34-35]。通常樟屬植物的光合速率較低，而qN和葉綠素含量較高的芳樟無性系在提高光能利用能力的同時(shí)，能將剩余的光能以熱的形式耗散，從而保護(hù)其光合機(jī)構(gòu)[29]，與本研究結(jié)果一致，外源脯氨酸處理使大葉樟幼苗的qN遠(yuǎn)高于對照，明顯提高植物抗堿脅迫環(huán)境的能力?？扇苄蕴恰⒖扇苄缘鞍?、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)和抗氧化酶系統(tǒng)是植物適應(yīng)逆境脅迫的重要措施[14-16]，適宜濃度外源脯氨酸可能作為信號激活了可溶性糖、可溶性蛋白、蘋果酸等物質(zhì)的代謝途徑和SOD、POD 等抗氧化酶基因的表達(dá)[20]，提高植物在堿脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力和活性氧清除能力，其中蘋果酸含量在100 mmol/L 脯氨酸處理時(shí)顯著高于對照187.88%，說明以蘋果酸為代表的有機(jī)酸參與了外源脯氨酸對大葉樟堿脅迫的緩解作用，參與方式可能與呼吸代謝和緩解根際周圍的高pH 環(huán)境有關(guān)，與郭立泉等[10]關(guān)于星星草（Puccinellia tenuiflora）、柯梅等[36]關(guān)于冰草（Agropyron cristatum）、麻瑩等[11]關(guān)于鹽地堿蓬（Suaeda liaotungensis）的研究結(jié)果一致；PAL 活性隨脯氨酸處理濃度提高呈先下降后上升趨勢，在150 mmol/L 的脯氨酸處理時(shí)達(dá)最低點(diǎn)，PAL 活性與大葉樟耐堿性呈負(fù)相關(guān)，植物體內(nèi)的PAL 是苯丙烷類生物合成途徑的關(guān)鍵酶，主要參與黃酮類和酚類物質(zhì)代謝，與植物抗氧化能力相關(guān)[37-38]，PAL活性與大葉樟耐堿性的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。外源脯氨酸處理具有濃度效應(yīng)，低濃度（50 mmol/L）脯氨酸處理對大葉樟耐堿脅迫的緩解效果不顯著，100 ~ 150 mmol/L 的外源脯氨酸處理明顯提高大葉樟耐堿脅迫能力，高濃度（200 mmol/L）脯氨酸處理后，大葉樟幼苗相對電導(dǎo)率、MDA 含量和Fv/Fm明顯降低，F(xiàn)o、Fm、qN、SOD 活性、POD活性和可溶性糖含量提高，而葉綠素含量、qP、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蘋果酸含量、CAT活性、總抗氧化能力、PAL 活性與對照差異不顯著，對大葉樟耐堿脅迫的緩解效果不明顯。隸屬函數(shù)法綜合評價(jià)值D的結(jié)果也表明，隨著脯氨酸處理濃度的增加，D值在150 mmol/L 脯氨酸處理?xiàng)l件下達(dá)最大值0.917，在200 mmol/L 脯氨酸處理時(shí)明顯下降，高濃度脯氨酸處理提高大葉樟耐堿脅迫的效果不理想的原因可能是部分施入土壤中的高濃度脯氨酸對大葉樟幼苗產(chǎn)生了滲透脅迫，影響了植物根系的生長和功能。

綜上所述，適宜濃度的外源脯氨酸處理提高堿脅迫下大葉樟幼苗的葉綠素含量、熒光參數(shù)、滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，對大葉樟幼苗堿脅迫有明顯緩解作用，而高濃度的外源脯氨酸處理效果較差，有機(jī)酸參與外源脯氨酸緩解大葉樟堿脅迫的過程。結(jié)合隸屬函數(shù)法綜合評價(jià)值結(jié)果，150 mmol/L 的外源脯氨酸處理效果最好。