基于分子印跡技術的細菌傳感檢測*

何勇飛 龐義全 葛 闖 徐 溢1，3）

（1）重慶大學新型微納器件與系統(tǒng)技術重點學科實驗室&光電技術與系統(tǒng)教育部重點實驗室，重慶 400044；2）重慶大學化學化工學院，重慶 400044；3）重慶大學光電工程學院，重慶 400044；4）重慶大學腫瘤醫(yī)院腫瘤轉移轉化與個體化治療重點實驗室，重慶 400030）

自然界中種類繁多的細菌會引發(fā)各種疾病，因此細菌檢測備受關注。但細菌在環(huán)境或生理樣本中通常濃度極低且基底背景復雜，導致對細菌進行準確快速檢測面臨著極大的挑戰(zhàn)［1-3］。傳統(tǒng)的致病菌檢測主要依靠常規(guī)培養(yǎng)方法［4］、聚合酶鏈反應［5］（PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗［6］（ELISA）等，存在操作條件苛刻、靈敏度不高，以及在發(fā)生緊急事件時無法轉移到現(xiàn)場檢測的缺點。光電傳感檢測技術和方法以其所具有的高靈敏度、方便快捷和易于集成等優(yōu)勢，成為細菌細胞等微生物高效檢測的新途徑。針對細菌等微生物分析，本課題組將傳感檢測技術與微流控芯片分析技術結合［7-11］，研究發(fā)現(xiàn)芯片集成傳感監(jiān)測是極具潛力的檢測模式，該檢測方法的核心依然是敏感膜識別元件和傳感檢測方式。 就敏感膜而言， 通過分子印跡技術（molecular imprinted technology，MIT）制備的分子印跡聚合物（molecular imprinted polymers，MIPs）與抗體或酶等天然受體相比具有高度的物理和化學穩(wěn)定性，可以長期重復使用。目前，基于MIPs 的傳感器已被用于檢測生化樣本中的各種化學和生物組分，從小分子［12-14］（霉菌毒素和非法食品添加劑）到大分子［15-16］（致敏蛋白和細菌外毒素），甚至是致病菌和病毒的檢測［17-19］。利用MIPs 對靶標物高效捕獲的優(yōu)勢，將MIT 與傳感器檢測技術結合，實現(xiàn)生化樣本中細菌高靈敏、特異性和高穩(wěn)定性的檢測，正逐漸成為生化傳感檢測技術發(fā)展的新亮點和新途徑之一。

本文針對建立特異性強、快速、靈敏的細菌等微生物檢測和鑒定方法及相關研究需求，在簡要介紹MIT 原理基礎之上，分析討論印跡材料與細菌的相互作用模式，總結細菌印跡的方法和途徑，重點關注基于MIT 的細菌傳感分析技術及其在細菌檢測中的應用，并對相關領域面臨的挑戰(zhàn)和研發(fā)前景進行展望。

1 分子印跡與細菌印跡

1972 年，Wulff 和Sarhan［20］首 次 報 道 了 以D-甘油酸為模板的分子印跡的理念及相關研究。MIT 即利用MIPs 模擬酶-底物或抗體-抗原之間的相互作用，對模板分子進行專一識別的技術。MIPs 的制備是利用單體和交聯(lián)劑在模板分子的存在下，通過相互作用，形成預聚合復合物，該復合物由分子相互作用穩(wěn)定，然后通過聚合作用“凍結”，使模板的“印跡”被保留在形成的聚合物上，從而產(chǎn)生能夠識別模板及其類似物的特定結合位點［21-22］（圖1）。該技術的特異性、高靈敏性和穩(wěn)定性，使其在色譜分離［23］、固相萃?。?4］、生物成像［25］、組織工程［26］、藥物遞送［22］等領域得到廣泛應用。

Fig. 1 Schematic diagram of the molecular imprinting process［22］圖1 分子印跡過程示意圖［22］

2001年，Dickert等［21］以酵母為模板制備了聚氨酯（polyurethane，PU）印跡膜，由此提出了微生物印跡法并進行了相關的研究。其中，細菌印跡技術即以細菌作為模板制備細菌印跡聚合物（bacteria imprinted polymers，BIP），通過BIP 三維空腔的物理結構與聚合物和細菌表面的化學結構共同作用下，特異性識別細菌的技術（圖2）。近年來，細菌印跡在病毒［27-28］、細菌［29-31］和哺乳動物細胞［32］等的分析檢測中也已有研究及應用。

2 細菌印跡的材料和制備方法

2.1 細菌印跡材料

以BIP特異性捕獲目標細菌，功能單體的合理選擇是印跡成功的關鍵步驟，其選擇通常依據(jù)模板的結構以及與模板作用力大小。細菌印跡材料主要包括有機聚合物、導電聚合物、溶膠-凝膠和復合型印跡材料等。表1歸納了幾種典型的細菌印跡材料及其應用情況。

Table 1 Classification of materials in bacteria imprinting and their applications表1 細菌印跡的材料分類及其應用

有機聚合物是一種常用于制備BIP 的材料。Mosbach［34］提出，模板和功能性單體之間存在非共價相互作用，在適當?shù)娜軇┲?，模板與單體配合物通過各種相互作用聚合，如氫鍵、靜電作用、范德華力、π-π 鍵等，在去除模板之后，官能化的聚合物基質可以通過相同的非共價作用重新和靶標物結合。主要單體包括丙烯酰胺（acrylamide，AAm）、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、乙 烯 吡 咯 烷 酮 （N-vinyl-2-pyrrolidinone，NVP）等［35］。

導電聚合物（conductive polymers，CP）中每個重復單元之間的電子共軛提供了適合于傳感應用的結構和性質［36］。對原始CP 進行結構修改或在CP 中加入功能性改性組件來開發(fā)功能化CP［37-38］，既可以加入產(chǎn)生非共價作用的功能單體，也可以引入能夠產(chǎn)生共價作用的特定官能團或單體；其中共價作用制備的BIP中能夠獲得更均勻的結合位點分布，但是在去除模板的處理上比較復雜。

溶膠-凝膠（sol-gel）是用于制備BIP的一種高效材料［39-40］，主要以共價作用的方式制備BIP。通過溶膠-凝膠法獲得的硅基材料顯示出良好的生物相容性、親水性和易于表面改性，這使它們易于生物醫(yī)學應用。

復合型印跡材料［41］是根據(jù)各種材料的不同功能性，合成制備得到的多組分材料，可獲得更多獨特性質，這種獨特性質包括新的化學性質或在原有成分的某一性質上進行改進。其制備常采用半共價法，在溫和條件下通過共價結合有效地摻入模板單體，通過非共價作用重結合［42-43］。

2.2 表面印跡的制備方法

根據(jù)模板的大小，可以選擇不同的印跡策略。對于整體印跡方法包含沉淀聚合、乳液聚合等，其所具備的識別位點遍布聚合物基質［54-55］，有利于小分子的吸收和釋放，但這種方法不適合細菌印跡，細菌的尺寸為微米級別，在高度交聯(lián)的基質中洗脫會受到阻礙或破壞［56］，模板的去除毫無疑問是印跡膜制備的關鍵環(huán)節(jié)?；诖?，印跡細菌主要是基于表面印跡的全細胞印跡法［19］，其能將更多的印跡位點保留在印跡膜的表面，表面印跡又可以分為直接壓印、間接印跡和電聚合等多種印跡方式。表2歸納了不同表面印跡方法的比較。

Table 2 Comparison of bacteria surface imprinting methods表2 細菌表面印跡法的比較

2.2.1 直接壓印法

在細菌表面印跡中最簡單方法是直接印跡［57］，其可分為3種主要類型：郵票壓印、薄膜壓印和犧牲層印跡。郵票壓?。?1］方法簡單方便，采用整個細胞作為模板，當細菌壓印在預聚物的表面上時，預聚物必須足夠柔軟，以形成壓印空腔。薄膜壓印是隨著細菌印跡的發(fā)展出現(xiàn)的，可用于印跡細胞［50］。犧牲層印跡法結合了表面壓印去除模板容易和全細胞印跡能產(chǎn)生更多結合位點的優(yōu)勢，在樣品和預聚物之間加入了可與形成聚合物共價結合的犧牲層，阻止樣品和聚合物單體之間的反應，并引入新的官能團，該方法主要通過溶膠-凝膠工藝實現(xiàn)。

2.2.2 間接印跡法

對于細菌、細胞、病毒等表面結構較為復雜的靶標物，直接壓印法效果往往并不理想。因此，更多采用包括子結構印跡法、人工模板印跡法和人工抗體法等間接印跡法［57］對這些復雜的靶標物進行處理。如針對細菌細胞表面的糖類［58］、蛋白質［59-61］等具有特異性的結構部分進行印跡，通過表面特異性結構片段的識別來檢測細菌和細胞，或者通過印跡細菌細胞分泌的內毒素等特殊物質，間接確定細菌細胞的存在。

2.2.3 電聚合法

電聚合是指在模板存在的情況下，在電極/支撐襯底材料上形成印跡聚合物層的沉積過程［62］。電聚合可以通過伏安法［63］、恒電位法［64］和恒電流法［65］等多種電化學技術實現(xiàn)。其允許通過控制單體在電極表面反應的速度/掃描速率，調節(jié)電聚合周期、電位和電流等參數(shù)，制備得到不同厚度的聚合物印跡膜層。

3 基于BIP的細菌傳感檢測研究進展

3.1 電化學傳感檢測

以具有特異性捕獲效能的BIP修飾的電極作為電化學傳感界面，是一種新型的基于印跡技術對細菌進行高效檢測方式。Idil 等［72］以N-甲基丙烯?；?L- 組氨酸甲酯（N-methacryloyl-L-histidine methylester， MAH）、 甲 基 丙 烯 酸2- 羥 乙 酯（2-hydroxyethyl methacrylate，HEMA）為單體，乙二 醇 二 甲 基 丙 烯 酸 酯 （ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA）為交聯(lián)劑，采用微接觸印跡技術制備了大腸桿菌印跡膜修飾的金電極，這兩種技術的獨特組合使其能夠選擇性檢測目標菌，當與已知具有相似形狀的競爭細菌菌株共存時，能夠區(qū)分大腸桿菌，檢測限為70 CFU/ml。Jafari等［39］使用四乙氧基硅烷和（3-巰基丙基）三甲氧基硅烷制備的大腸桿菌UTI89印跡有機硅溶膠-凝膠膜，采用阻抗法檢測，檢測限低至1 CFU/ml。Wu等［46，73］研 制 的BIP 印 跡 膜，具 有 位 于 聚 吡 咯（polypyrrole，PPy）表面的非屈光性印跡位點，其更易于且可以預期增強傳質和結合動力學，對大腸桿菌O157∶H7（E.coliO157∶H7）有高選擇性，檢測限為103CFU/ml，檢測水平與常規(guī)基于BIP 的傳感器相比更好，特別是能夠具體鑒定細菌血清型，能夠用于實際樣品中E.coliO157∶H7的檢測。

電聚合法近些年來逐漸成為了細菌印跡膜制備的熱點，單體濃度、掃描次數(shù)等多種參數(shù)對其制備的影響是不可忽略的。Lahcen等［74］通過循環(huán)伏安法電聚合PPy制備炭疽芽孢桿菌孢子印跡聚合物功能化的碳糊電極，研究了超聲波處理和帶電荷的表面活性劑對模板去除的影響，優(yōu)化了單體濃度、掃描次數(shù)、去除劑種類和濃度、孵育時間等參數(shù)對印跡膜制備的影響。為了克服印跡空洞明顯受損和細菌細胞壁部分滯留的問題，Golabi 等［52］以表皮葡萄球菌為BIP 的模板菌， 3-氨基苯硼酸（aminobenzeneboronic acid，3-APBA）作為功能單體，制備了全細胞印跡膜（圖3a），選擇性研究表明，BIP 可以區(qū)分目標菌和形狀相似的非目標細菌，與其他非靶細菌如蛋白水解鏈球菌、大腸桿菌和肺炎鏈球菌相比，該研究的阻抗傳感器對表皮葡萄球菌具有高度特異性。

Fig. 3 Schematic diagram of the bacterial imprinting process for doping 3-APBA（a）［52］ and scheme of the Escherichia colisensor（b）［68］圖3 摻雜3-APBA的細菌印跡過程示意圖（a）［52］和E.coli印跡傳感器示意圖（b）［68］

結合電化學傳感檢測技術，通過對電極表面的印跡膜材料進行摻雜和改性修飾，實現(xiàn)對電信號的放大，進一步提高細菌檢測的靈敏度。Mugo等［68］使用聚苯胺（polyaniline，PANI）摻雜苯硼酸、多壁碳納米管、納米纖維素薄膜對電極表面多層修飾（圖3b），采用電容和阻抗傳感檢測模式，對E.coli的 檢 測 限 低 至（8.7±0.5） CFU/ml，響 應 時 間≤5 min。

研究顯示，將BIP作為敏感界面，對其修飾改性，結合電聚合等制備方法在電極表面制備印跡膜，其可與安培法、電容法、阻抗法［75-76］等電化學傳感檢測方法結合，將BIP對細菌的吸附轉化為電信號輸出，實現(xiàn)快速、高選擇、原位細菌檢測。

3.2 石英晶體微天平傳感檢測

已有的研究表明，以具有特異性捕獲效能的BIP 修飾石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）的電極，電極表面印跡膜吸附或捕獲細菌后質量變化而導致的諧振頻率變化，可為細菌細胞的檢測提供新的技術途徑。檢測時間的長短是細菌檢測中急需解決的一個問題。Tokonami 等［44］在QCM 電極上制備了銅綠假單胞菌的PPy印跡膜，經(jīng)過氧化處理，在PPy印跡膜中形狀互補的空腔，形成過氧化PPy印跡膜（oPPy），采用雙向電泳技術，在3 min 內檢測到濃度為103CFU/ml的銅綠假單胞菌，在一定程度上解決了檢測時間過長的缺點。Schnettelker等［66］通過沉降和郵票壓印技術，直接在QCM表面上生成的大腸桿菌印跡層，也在3 min 內獲得了細菌的響應信號，能夠達到快速檢測的目的。

基于BIP 的QCM 傳感檢測中，表面印跡的方法被廣泛應用于制備細菌印跡膜，不僅能夠獲得很好的印跡位點，相對于全細胞印跡技術能夠更好地清洗印跡膜表面的細菌，保留完整的印跡空腔。Seifner 等［50］采用表面印跡技術在QCM 電極上制備了對紅細胞具有選擇性識別位點的BIP，其顯示出血液亞組之間的選擇性，當暴露于模板血型時，A1紅細胞印跡層產(chǎn)生40 kHz的效果，而A2紅細胞在同一印跡層上僅產(chǎn)生該值的11%，細胞密度低至0.5×1011/L 時，仍可觀察到千赫范圍內的質量敏感效應。Yilmaz 等［77］利用微接觸印跡技術，以MAH、HEMA 為單體，EGDMA 為交聯(lián)劑，使大腸桿菌表面與修飾后的金表面形成三明治結構，制備E.coli的BIP 獲得與天然抗體相似的識別能力（圖4）。對于表面印跡材料的研究，Spieker 等［67］采用沉降法和郵票壓印法，獲得蠟樣芽孢桿菌的BIP，實驗篩選了聚苯乙烯（polystyrene，PS）、聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone， PVP）、 聚 丙 烯 酰 胺（polyacrylamide，PAA）和PU 五種聚合物，發(fā)現(xiàn)PU和PAA對蠟樣芽胞桿菌的親和力最高。

Fig. 4 Schematic diagram of microcontact imprinted SPR and QCM sensor surfaces［77］圖4 微接觸印跡法制備SPR和QCM傳感表面的示意圖［77］

可以看到，基于BIP和抗體相近的特異性識別性能，表面印跡法的應用，將諸如雙向電泳等電場技術應用于表面帶電的細菌的檢測，結合QCM 傳感監(jiān)測能實現(xiàn)極低的質量變化監(jiān)測優(yōu)勢［78-79］，對細菌細胞的快速、特異性和高靈敏檢測具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.3 熒光傳感檢測

在熒光傳感檢測中，量子點（quantum dots，QDs）作為一種吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄且可調諧的半導體納米晶體，具有良好的光致發(fā)光性能［80］。其既可以作為熒光信號源，又可以作為與生物分子結合的多功能支持物。量子點獨特的光學性能和BIP 的特異性識別結合，為細菌檢測提供了一種新型熒光檢測方式。Chen 等［53］在電極表面直接電聚合制備E.coliO157∶H7 的聚多巴胺（polydopamine，PDA）印跡膜，構建了電化學發(fā)光（ECL）傳感器（圖5）。將E.coliO157∶H7 多克隆抗體（pAb） 用氮摻雜石墨烯量子點（N-GQDs）標記，BIP-E.coliO157∶H7 和pAb-NGQDs的生物結合在K2S2O8的作用下，可以產(chǎn)生強烈的ECL，檢測限為8 CFU/ml，測試的線性響應范圍為101~107CFU/ml。這種基于N-GQDs 的ECL分析方法，對E.coliO157∶H7 具有高選擇性（記錄了添加沙門氏菌的ECL信號作為比較），成功應用于水樣檢測。

Fig. 5 Schematic diagram of the fabrication procedure of the BIP and the detection process［53］圖5 BIP制作和檢測過程示意圖［53］

將熒光的方法應用于實際樣品的檢測是一種更加簡便的方法，能夠簡化檢測的預處理過程。Zhao 等［81］以 整 個 單 核 細 胞 增 生 李 斯 特 菌（L. monocytogenes）為模板，采用水包油Pickering乳液聚合法，合成了包含水溶性CdTe QDs 的BIP微球，在嵌入CdTe QDs的微球表面產(chǎn)生識別位點。在靶標菌存在下，可直接通過熒光猝滅進行視覺熒光檢測，對牛奶和豬肉樣品中的L. monocytogenes進行定性檢測。Bezdekova 等［82］采用金黃色葡萄球菌磁性BIP對患有乳腺炎的奶牛的原料奶、健康奶牛的牛奶、熟米飯和非液體食品樣品進行熒光檢測，檢測限為1×103CFU/ml，這對應于歐盟立法中對食品微生物控制設定的限制。

將BIP和量子點耦合到一個系統(tǒng)中產(chǎn)生了一種新型的熒光傳感器，不僅使細菌印跡成為可能，簡化細菌檢測的前處理過程，而且還提高了細菌識別的特異性和細菌檢測的靈敏度。

上述不同的傳感檢測方式其檢測原理各有不同，在應用中需要依據(jù)實際測試的需求進行選擇，表3給出了不同傳感檢測方法的簡單比較。

Table 3 Comparison of three sensing detection methods表3 三種傳感檢測方法的優(yōu)缺點

3.4 集成BIP傳感監(jiān)測模式的微流控芯片分析技術

微流控芯片分析技術已經(jīng)在化學［83］、細胞分析［84］和臨床診斷［85］、生物醫(yī)學及即時檢測［86］（point-of-care testing，POCT）等領域中獲得廣泛應用。本課題組長期開展基于微流控芯片的細菌傳感檢測研究，研制了多種不同類型的集成微流控細菌傳感芯片［10，87-88］，針對肉類、牛奶、自來水等樣本中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等的檢測開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)選擇性捕獲和采集樣本中細菌并通過光電信號予以展示是實現(xiàn)高效檢測的關鍵環(huán)節(jié)。將BIP與微流控芯片有機結合，構建設計細菌檢測的傳感芯片，對于檢測過程中的多個環(huán)節(jié)以及功能化具有重大的意義，可實現(xiàn)更寬范圍和更高靈敏度的細菌檢測，必將為細菌的高效檢測提供新的技術途徑。

Birnbaumer 等［27］以煙草花葉病毒（TMV）和人鼻病毒2 血清型（HRV2）為模板，在微流控芯片檢測區(qū)通過NVP和MAA共聚物表面壓印獲得了印跡膜，采用4 個非接觸式叉指電容器（μIDC）與集成到2個微流控通道網(wǎng)絡中印跡聚合物的新穎組合構建了具有高靈敏度和高選擇性的非接觸微傳感芯片，可創(chuàng)建無噪音檢測環(huán)境，實現(xiàn)了病毒污染情況的連續(xù)監(jiān)測。在5~500 kHz 的應用頻率范圍內，獲得最佳傳感器的表現(xiàn)在203 kHz。在流體流速增加50 倍后，能夠完全清除BIP 上的病毒并證明了設備的可重用性。Bao 等［89］利用表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌作為模板，通過細菌模板表面引發(fā)的原子轉移自由基聚合（SI-ATRP）來印記細菌表面電荷的異質性，選擇了兩個單體作為構筑基團，一種是甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨，這是一種永久性陽離子單體，能夠在帶負電荷的細菌外表面自組裝，另一種是兩性離子單體3-二甲基（甲基丙烯酰氧乙基）丙磺酸銨，用兩性離子單體填充識別位點之間的空隙可以抑制非特異性細菌在所生成BIP膜上的附著，從而提高細菌的選擇性；使用單細胞力譜量化了單個細菌細胞和BIP之間的黏附力。將細菌識別與EIS 的耦合，兩電極體系（BIP接枝金電極和對電極）連接到電化學工作站（圖6a），這種基于微流控芯片BIP 膜的檢測限低于一些基于生物受體的傳感器，競爭性細菌識別和EIS測試的結果表明，BIP 膜仍表現(xiàn)出良好的細菌選擇性。

Fig. 6 Schematic diagram of EIS-BIP coupling system and microfluidic chip（a）［89］；schematic representation of the TWTA setup（b）［51］圖6 EIS-BIP耦合系統(tǒng)和微流控芯片（a）［89］以及TWTA設計示意圖（b）［51］

通過調節(jié)傳感檢測、流體控制等方式，可以在更大的范圍內、更高靈敏度的條件下檢測細菌細胞，達到實際應用的目標。Redeker 等［51］采用表面印跡的方法在鋁片表面制得基于PU材料的BIP，作為合成的“細菌受體”，與熱波轉運分析（thermal wave transport analysis，TWTA）結合（圖6b），可分析通過功能界面的熱波傳播，較之前使用的傳熱法（heat-transfer method，HTM）靈敏度至少提高了2倍。實驗將3 ml細菌懸浮液以2.5 ml/min的流速通過傳感界面進行測試，對9種細菌進行了分析。最后還提供了首次應用的證據(jù)，能夠檢測加標尿液樣本中臨床相關濃度低至3×104CFU/ml 的細菌，證明了該傳感器在尿樣中的性能。

4 總結與展望

基于BIP細菌傳感檢測方法的研究和應用對細菌的高效檢測具有重要意義。其中敏感膜材料的設計和效能，很大程度上決定了細菌傳感檢測的優(yōu)劣，研制高靈敏度和高選擇性的敏感膜是細菌傳感檢測的一個重要研究方向。近年來MIT 在細菌檢測方面顯示出良好的發(fā)展?jié)摿蛻们熬埃砻嬗≯E的方法毫無疑問已經(jīng)成為印跡制備的主流方向，但如何解釋細菌與印跡腔的特異性結合是有效應用的必要條件，如何去除模板獲得完整有效的印跡空腔是重中之重，如何選擇印跡材料以及印跡材料的修飾改性是優(yōu)化印跡膜效能的重要環(huán)節(jié)，如何將印跡膜、傳感檢測手段和微流控芯片有機地結合起來是實現(xiàn)其應用的關鍵。這些挑戰(zhàn)也為基于BIP的細菌檢測帶來了更好的前景。隨著發(fā)展不斷提高BIP的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度，這不僅有助于細菌細胞分析、病毒疾病治療和POCT等方面的應用，也極大地豐富了MIT的研究內涵。