HPLC-MS/MS測定川金絲猴糞便中8種激素含量

張雪　孫悅　張超　婁熙源　羅懷英　文貴東　本智仁　陳雙龍

摘要：? 野生動(dòng)物糞便中激素含量可以間接反映其營養(yǎng)狀態(tài)，激素的檢測已廣泛應(yīng)用于探究動(dòng)物的生理機(jī)能以及繁殖狀況。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）常用于類固醇激素的檢測，是近年來野生動(dòng)物激素檢測的重要手段之一，該方法樣品用量少，靈敏度高。2022 年6～7月在貴州省森林野生動(dòng)物園，運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了8只不同個(gè)體川金絲猴糞便中8種激素，比較了糞便中雌性以及雄性川金絲猴雌激素的差異。結(jié)果表明，甲狀腺素 T3、睪酮激素在8只個(gè)體中均未檢出。甲狀腺素 T4、氫化可的松均部分檢出。雌激素在8只個(gè)體中均檢測出。8只個(gè)體糞便雌二醇濃度平均值為 109.24 ng/ml，雌三醇濃度平均值為63.192 ng/ml，雌酮濃度平均值為87.77 ng/ml。 雌激素濃度在雌性和雄性個(gè)體間不存在顯著差異。研究工作可為后續(xù)川金絲猴的健康狀況及選育提供參考。

關(guān)鍵詞：? 川金絲猴；? 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；? 雌二醇

中圖分類號(hào)：? ?S 86; Q95? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：１００1 － 9499（２０23）03 － 0045 － 05

川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）屬于靈長目 （Primates）猴科 （Cercopithecidae）疣猴亞科 （Colobinae） 仰鼻猴屬（Rhinopithecus），是亞洲特有種，目前已被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN） 列入瀕危物種紅色名錄瀕危等級(jí)（EN）， 在我國被列入國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄[ 1 ]。是主產(chǎn)于我國的珍稀靈長類物種，因其稀有性以及重要的生態(tài)、科研、文化和觀賞價(jià)值，列為國家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物和公約附錄物種。川金絲猴是典型的樹棲動(dòng)物，是我國華中和西南地區(qū)亞熱帶山地森林生態(tài)系統(tǒng)中最具代表性的物種之一[ 2 ]。對于川金絲猴生理狀況的探究有助于推動(dòng)川金絲猴的生態(tài)學(xué)、行為學(xué)、保護(hù)生物學(xué)以及馴養(yǎng)、繁殖、疾病和管理等方面的研究[ 3 - 6 ]。

皮質(zhì)類激素、生殖類激素、甲狀腺激素等內(nèi)分泌激素作為評價(jià)指標(biāo)回答有機(jī)體與生存和繁殖相關(guān)的問題[ 7 ]。雌激素主要包括雌二醇、雌三醇和雌酮化合物[ 8 ， 9 ]。在雌性動(dòng)物體內(nèi)，雌激素與孕激素協(xié)同作用，共同維持著雌性動(dòng)物生殖內(nèi)分泌的平衡，在促進(jìn)卵泡成熟、維持受精卵著床等發(fā)面發(fā)揮著重要作用[ 10 ]。非損傷性取樣方法（Noninvasive Sampling）是指在不捕捉、低干擾動(dòng)物正常活動(dòng)，甚至見不到動(dòng)物個(gè)體的情況下收集動(dòng)物脫落的毛發(fā)、糞便、尿液，含口腔脫落細(xì)胞的食物殘?jiān)?、鱗片以及卵殼等樣品進(jìn)行生物學(xué)研究的方法[ 11 ， 12 ]。野生動(dòng)物數(shù)量稀少，具有隱蔽性強(qiáng)、分布區(qū)偏僻、警覺性高等特點(diǎn)[ 13 - 15 ]。再者，對動(dòng)物的麻醉、捕捉、綁定等過程對動(dòng)物本身是一種劇烈的外界刺激，會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激[ 16 ]。因此，在近年的動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)研究中，非損傷性方法得到了廣泛的使用。通過采集尿液和糞便監(jiān)測動(dòng)物類固醇激素是目前最常用的非損傷采樣方法[ 17 ， 18 ]。同時(shí)，研究表明糞便類固醇激素與血液的研究結(jié)果存在一致性和直接對應(yīng)關(guān)系[ 19 ]。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢，用于復(fù)雜樣品分析檢測，可省去分離純化代謝物樣品的繁瑣步驟[ 20 ]。圈養(yǎng)川金絲猴生活的空間和環(huán)境受限制，且常與人類近距離接觸，長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)。本研究運(yùn)用HPLC-MS/MS對雌雄川金絲猴糞便8種激素水平測定，探究雌雄川金絲猴糞便中8種激素含量及川金絲猴雌性和雄性個(gè)體雌激素含量的差異性。結(jié)合生理指標(biāo)更全面的評價(jià)川金絲猴的生存、健康以及繁殖狀況等，旨在為圈養(yǎng)川金絲猴生理健康狀況提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 研究方法

1. 1 研究地點(diǎn)與對象

研究地點(diǎn)為貴州省森林野生動(dòng)物園，位于貴州省修文縣扎佐鎮(zhèn)林場冷水溝分場內(nèi)，總占地面積約5 000余畝。野生動(dòng)物園依托園區(qū)內(nèi)緩坡、山坳、寬谷、石林等多種喀斯特地貌，按照不同動(dòng)物的生態(tài)要求，因地制宜、合理布局。本研究的觀察地點(diǎn)為靈長類展區(qū)川金絲猴籠舍。籠舍均由內(nèi)、外兩個(gè)籠舍組成，四面都是玻璃幕墻，頂部用鐵網(wǎng)固定，以便透氣通風(fēng)。研究對象為8 只成年及幼年川金絲猴，包括2只雄性（Male，n=2）和6只雌性（Female，n=6）個(gè)體。

1. 2 糞便樣品的采集與

2022 年6～7月在貴州省森林野生動(dòng)物園內(nèi)對川金絲猴進(jìn)行觀察，采集被觀察個(gè)體的新鮮糞便。觀察到其排便后立即由飼養(yǎng)員用一次性PE手套采集糞便樣本。為了最大限度地減少環(huán)境污染，只收集糞便的內(nèi)部部分作為樣本。將所有新鮮糞便樣本收集到40 ml無菌RNA管中。隨后將樣品儲(chǔ)存在-80℃冰箱里，直到測試分析。

1. 3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）測定糞便激素

1. 3. 1 試劑、耗材、標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)驗(yàn)儀器

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試劑甲狀腺素 T3、甲狀腺素 T4、黃體酮（孕酮）、氫化可的松（糖皮質(zhì)素）、睪酮、雌酮、雌二醇、雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品（購自源葉生物）、色譜級(jí)甲醇、乙腈（購自德國默克）。主要實(shí)驗(yàn)儀器為TG-16G 臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、FA1204? ?電子天平（上海衡際科學(xué)儀器有限公司）、AGLIENT1260 高效液相色譜儀串聯(lián) 6420A 質(zhì)譜儀（安捷倫公司）。

1. 3. 2 樣品提取方法

（1）取糞便樣品 0.4 g，加入色譜級(jí)甲醇 5 ml，漩渦震蕩 1 min；

（2）4 ℃，水浴超聲 5 min，4 ℃，10 000 g 離心 1 min，取上清；

（3）沉淀再加入色譜級(jí)乙酸乙酯 ml，重新提取一次；

（4）4 ℃，10 000 g 離心 1 min，取上清液，合并兩次上清；

（5）氮?dú)獯蹈杉状迹?0.2 ml PBS-BSA 重懸；

（6）過 0.22 μm 濾膜，進(jìn)液質(zhì)檢測。

1. 3. 3 液質(zhì)條件

色譜柱：Agilent ZORBAXSB-C18 反相色譜柱（2.1×150，3.5 μm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水；B：甲醇。流速：0.3 ml/min。進(jìn)樣體積：5 μl。動(dòng)物激素的離子、解簇電壓、碰撞能量等參數(shù)如表 1 所示，反應(yīng)監(jiān)測條件如表2 所示。

儀器所測得濃度為最終提取液的濃度，經(jīng)計(jì)算獲得原樣品中激素濃度，計(jì)算方法如下： 樣品中激素濃度（ng/g）=檢測濃度（ng/ml）×稀釋體積（ml）/稱取質(zhì)量（g）。其中稀釋體積為樣品最終溶解進(jìn)樣時(shí)所用的溶液體積，稱取質(zhì)量為提取時(shí)的取樣質(zhì)量。檢測濃度由待測物質(zhì)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)方程，由儀器自動(dòng)求得。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用 SPSS v.22.0（IBM corp.， Armonk， NY， USA）統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，對于雌性和雄性的川金絲猴糞便激素濃度進(jìn)行差異顯著性比較，比較之前都通過單一樣本 K-S 檢驗(yàn)（one-sample Kolmogorov-Smirnov test）進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。對不同樣品中測得的川金絲猴糞便激素濃度進(jìn)行兩個(gè)變量的Pearson 相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 線性范圍

8種川金絲猴糞便激素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示。檢測濃度由待測物質(zhì)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)方程。

2. 2 川金絲猴糞便激素水平

不同川金絲猴8個(gè)體糞便檢測出的激素結(jié)果有差異（表4）。甲狀腺素 T3、睪酮激素在8只個(gè)體中均未檢出；甲狀腺素 T4、氫化可的松均部分檢出；三種雌激素在8只個(gè)體中均檢測出。8只個(gè)體糞便雌二醇濃度平均值為 109.24（ng/ml），雌三醇濃度平均值為63.192（ng/ml），雌酮濃度平均值為87.77（ng/ml）。雌激素中以雌二醇的生物活性最高，選取雌二醇、雌三醇、雌酮濃度運(yùn)用Spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，對于雌性和雄性川金絲猴的雌酮、雌二醇、雌三醇激素濃度進(jìn)行差異顯著性比較，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。在t檢驗(yàn)之前對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，差值95%置信區(qū)間。結(jié)果顯示：雌酮、雌二醇、雌三醇激素濃度均滿足方差齊性檢驗(yàn)（P>0.05）。結(jié)果（表5）表明，雌酮濃度、雌二醇濃度、雌三醇濃度在雌性和雄性個(gè)體間不存在顯著差異（P>0.05）。

3 討 論

本研究結(jié)果與其他靈長類動(dòng)物雌激素之間相關(guān)性研究結(jié)果相似，在短尾猴（Macaca thibetana）的研究中也顯示雌性和雄性雌激素?zé)o顯著差異[ 21 ]。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素、睪酮、氫化可的松在糞便中未檢出，這可能是由于激素保存具有時(shí)效性，收集到的新鮮糞便如果不能及時(shí)提取處理或低溫保存，常溫下糞樣內(nèi)及外界的微生物會(huì)在短時(shí)間內(nèi)分解其中的各種類固醇激素，導(dǎo)致測定結(jié)果的偏差[ 22 ]。在本次研究中由于貴州省野生動(dòng)物園內(nèi)川金絲猴個(gè)體數(shù)量有限，且采樣季節(jié)較為單一，樣品的連續(xù)性不高，無法確定雌二醇濃度峰值出現(xiàn)時(shí)期，在幾個(gè)月內(nèi)川金絲猴激素水平的變化趨勢是未知的。由于川金絲猴排泄時(shí)間波動(dòng)較大，川金絲猴種群受到食物供給、游客影響以及疾病和人為干擾等方面影響，可能給本研究結(jié)果的可信性帶來一定的影響。圈養(yǎng)川金絲猴受到游客的影響導(dǎo)致其長期處于應(yīng)激狀態(tài)，在圈養(yǎng)保護(hù)時(shí)應(yīng)盡量減少人為接觸，多進(jìn)行安撫[ 23 ]。糞便在川金絲猴體內(nèi)停留時(shí)間較長[ 24 ， 25 ]，激素受腸道微生物和細(xì)菌的干擾，其濃度容易受到影響[ 26 ]。糞便中激素的濃度與動(dòng)物的行為并不完全一致[ 27 ]，因此有必要驗(yàn)證動(dòng)物糞便和尿液中激素水平的相關(guān)性[ 28 ， 29 ]。例如吼猴（Alouatta pigra）糞便通過腸道的時(shí)間一般為23～30 h，最長時(shí)間可以達(dá)到72 h[ 30 ]，所以應(yīng)用糞便類激素探討動(dòng)物行為等方面研究需要進(jìn)一步研究。雌激素與繁殖期行為的相關(guān)性以及川金絲猴在生活史不同時(shí)期，如妊娠期、哺乳期等時(shí)期的性激素水平等還有待進(jìn)一步的分析研究。

本研究及結(jié)果說明非損傷技術(shù)手段可以很好的應(yīng)用到川金絲猴的生理狀況研究中。利用非損傷的研究技術(shù)和HPLC-MS/MS測定技術(shù)應(yīng)用于生理、免疫以及能量代謝等方面的影響更加具有保護(hù)生物學(xué)意義。本研究為川金絲猴體內(nèi)激素在糞便，尿液或血液中的相互關(guān)系提供基礎(chǔ)。糞便或者尿液中激素的檢測分析，將為靈長類對環(huán)境的生理適應(yīng)機(jī)制提供平臺(tái)，對珍稀瀕危靈長類保護(hù)具有重要的意義。利用非損傷研究方法實(shí)現(xiàn)了對野生動(dòng)物生理激素水平的監(jiān)測，一定意義上加速了內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)展。

致謝：感謝貴州森林野生動(dòng)物園工作人員在采樣期間對本研究的支持和幫助。感謝貴州省特色微生物資源開發(fā)應(yīng)用平臺(tái)對本研究的支持，特此致謝。

參考文獻(xiàn)

［1］ 王偉， 程銘昊， 趙思棋， 等. 不同環(huán)境條件下川金絲猴的皮質(zhì)醇和Klotho激素水平變化［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2023， 44（1）： 179 - 184.

［2］ Cai Y S， Yu H Y， Liu H， et al. Genome-wide screening of microsatellites in golden snub-nosed monkey（Rhinopithecus roxellana）， for the development of a standardized genetic marker system［J］. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 10614.

［3］ 王曉娟， 諶利民， 鐘義， 等. 唐家河國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)川金絲猴的種間關(guān)聯(lián)和保護(hù)［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào).

［4］ 閻彩娥，? 蔣志剛，? 李春旺，? 等.? 雌性川金絲猴的邀配行為與尿液雌二醇水平的關(guān) 系［J］.? 動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，49（ 6 ）： 736 - 741.

［5］ 高云芳，? 陳超，? 李保國，? 等.? 川金絲猴尿液中睪酮水平的季節(jié)性變化［J］.? 動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2003，49（3）： 393 - 398.

［6］ 高云芳，? 高更更，? 白緒祥，? 等.? 雌性川金絲猴尿液中雌二醇與孕酮水平的季節(jié)性變化［J］.? 西北大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版，2005，35（5）： 592 - 596.

［7］ 傅文源. 虎糞便類固醇激素檢測及影響因素的評估［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2018， 39（2）： 271 - 276.

［8］ 王毅花， 陳麗霞， 馬天， 等. 籠養(yǎng)黑頸鶴糞便性激素水平的時(shí)間動(dòng)態(tài)［J］. 動(dòng)物學(xué)雜志，2020， 55（3）： 8.

［9］ Whitten PL，Broekman DK，Stavisky RC.Reeent advances in nonin-

vasive techniques to monitor hormone-behavior interactions［J］.American Journal of Physieal Anthropology， 1998， 41： 1 - 23.

［10］ 陳玉燕，? 張希賢，? 趙明杰，? 等.? 圈養(yǎng)食蟹之行為模式與繁殖生理研究［J］.? 臺(tái)北動(dòng)物園學(xué)報(bào)， 1996（8）： 1 - 16.

［11］ Taberlet P， Waits L P， Luikart G. Noninvasive genetic sampling： look before you leap［J］， Trends in Ecology & Evolution， 1999， 14 （8）： 323 - 327.

［12］ 陳璐，? 岳曦.? 非損傷性取樣研究進(jìn)展［J］.? 四川動(dòng)物， 2007， 26（1）： 224 - 226.

［13］ 張樹苗， 李夷平， 陳頎， 等. 北京南海子麋鹿苑春季麋鹿糞樣皮質(zhì)醇激素變化及其指示作用［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2021， 42（2）： 522 - 527.

［14］ 衛(wèi)澤珍， 崔媛媛. 內(nèi)分泌學(xué)分析法在圈養(yǎng)野生動(dòng)物研究中的應(yīng)用簡［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2017， 38（3）： 524 - 528.

［15］ 周璨林， 寧禮群. 野生動(dòng)物糞便研究進(jìn)展［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2015， 36（2）： 232 - 239.

［16］ SCHWARZENBERGER F. The many uses of non-invasive faecal steroid monitoring in zoo and wildlife species［J］.Int Zoo Yearb，2007，41： 52 -74

［17］ BONNEY R C， WOOD D J， KLEIMAN D G. Endocrine correlates of behavioural oestrus in the female giant panda （Ailuropoda melanoleuca） and associated hormonal changes in the male［J］. J Reprod Fertil， 1982， 64（1）：209-215.

［18］ LANE G A， FRASER K， CAO M， et al. Urinary biomarkers of forage feeding from ESI-MS/MS fingerprinting： exploratory studies ［J］. New Zealand Society of Animal Production， 2006， 66：230-235.

［19］ WASSER S K， RISLER L， STEINER R A. Exereted steroids in Primate feces over the menstrual cycle and Pregnancy［J］. Biology of ReProduction， 1988， 39（4）： 862 - 872.

［20］ ZHAO Y G， ZHOU L X， PAN S D， et al. Fast determination of 22 sulfonamides from chicken breast muscle using core-shell nanoring amino-functionalized superparamagnetic molecularly imprinted polymer followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2014，1345（1）： 17 - 28.

［21］ 李靜宇.雌性短尾猴糞便性激素測定方法評估及其在生理周期研究中的應(yīng)用［D］.? 合肥：? 安徽大學(xué)， 2020.

［22］ 林若蘭， 唐耀， 鄭騰， 等. 不同保存溫度對華南虎糞樣生殖激素檢測結(jié)果的影響［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2014， 35（3）： 5.

［23］ 王炎， 王娟娟， 楊靜， 等. 圈養(yǎng)與野生川金絲猴應(yīng)激水平的比較研究［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)，? 2023， 43（3）： 623 - 628.

［24］ 王英樹， 田秀華， 張冬冬，等. 籠養(yǎng)丹頂鶴繁殖行為和糞樣中性激素水平變化的關(guān)系［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2014， 35（1）： 69 - 74.

［25］ PALME R， RETTENBACHER S， TOUMA C， et al. Stress Hormones in Mammals and Birds： Comparative Aspects Regarding Metabolism， Excretion， and Noninvasive Measurement in Fecal Samples［J］. Annals of the New York Academy of Sciences， 2005， 1040（1）： 162 - 171.

［26］ KIYOSHI， YAMAUCHI， SHIN-ICHIRO， et al. Application of Enzyme Immunoassay to Fecal Steroid Analysis in Sika Deer （Cervus nippon）［J］. Journal of Reproduction and Development， 1999， 45（6）： 429 - 434.

［27］ 楊梅， 劉永張. 生殖激素檢測應(yīng)用于國內(nèi)動(dòng)物園繁殖監(jiān)測實(shí)踐的可行性分析［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2019， 40（1）： 8.

［28］ FUJITA S， MITSUNAGA F， SUGIURA H， et al. Measurement of urinary and fecal steroid metabolites during the ovarian cycle in captive and wild Japanese macaques， Macaca fuscata［J］. American Journal of Primatology， 2010， 53（4）： 167 - 176.

［29］ 沈潔娜， 李根新， 張強(qiáng)， 等. 秦嶺大熊貓繁殖期尿液中生殖激素變化規(guī)律的研究［J］. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2020， 41（4）： 5.

［30］ 陳浩春， 范鵬來， 姚輝， 等. 川金絲猴尿液類固醇激素的保存時(shí)效性［J］. 獸類學(xué)報(bào)， 2015， 35（3）： 7.