大白菜BrFLC及BrFRI-LIKE基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)及其與抽薹性狀的關(guān)系研究

周麟筆, 馬關(guān)鵬, 趙夏云, 劉 峰, 劉 煉, 趙大芹

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所, 貴陽(yáng) 550006; 2.貴州省園藝工程技術(shù)研究中心, 貴陽(yáng) 550006;3.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院景觀生態(tài)學(xué)院, 浙江 寧波 315100)

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)屬十字花科蕓薹屬作物,是我國(guó)最重要的葉用蔬菜之一。2月正季多數(shù)大白菜抽薹開(kāi)花,3—5月是蔬菜淡季,特別是大白菜淡季,因此種植春大白菜能取得很好的經(jīng)濟(jì)效益。然而,越冬或早春栽培大白菜時(shí),品種耐抽薹性不夠強(qiáng)就極易未熟抽薹,導(dǎo)致減產(chǎn)。因此,培育強(qiáng)耐抽薹性的春大白菜品種是一個(gè)非常重要的育種方向。 同時(shí),揭示大白菜抽薹開(kāi)花的調(diào)控機(jī)制,對(duì)鑒選耐抽薹性強(qiáng)的育種材料,創(chuàng)制特耐抽薹大白菜新品種具有十分重要的意義。植物成花過(guò)程受內(nèi)部遺傳因子和外界環(huán)境因素共同調(diào)控[1],目前大量研究總結(jié)出了6條主要的開(kāi)花調(diào)控途徑,即春化途徑、自主途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、溫度途徑和年齡途徑[2-6]。近年來(lái),又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了2條新的開(kāi)花調(diào)控途徑,即脫落酸途徑[7]和油菜素甾醇途徑[8]。這些調(diào)控途徑構(gòu)成了復(fù)雜又精密的成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。大白菜屬于低溫長(zhǎng)日照植物,需經(jīng)歷一定時(shí)間的低溫春化才能抽薹開(kāi)花。FLOWERINGLOCUSC(FLC)和FRIGIDA(FRI)是決定擬南芥開(kāi)花時(shí)間的兩個(gè)主要基因[9-10]。FLC作為春化途徑的關(guān)鍵基因,編碼了一個(gè)可以抑制開(kāi)花的MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子,這類轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子抑制一組包括FT(FLOWERINGLOCUST)和SOC1(SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1)在內(nèi)的開(kāi)花激活因子基因的轉(zhuǎn)錄抑制開(kāi)花,擬南芥春化過(guò)程主要是通過(guò)改變開(kāi)花抑制基因FLC染色質(zhì)結(jié)構(gòu),抑制FLC的表達(dá)[11-12],以解除FLC對(duì)下游FT和SOC1等開(kāi)花激活因子基因表達(dá)的抑制,從而促進(jìn)開(kāi)花[13-15]。FRI是FLC的轉(zhuǎn)錄激活因子,在FLC上游與FRIGIDA-LIKE 1 (FRL 1),FRIGIDA-ESSENTIAL 1 (FES 1), SUPPRESSOR OF FRIGIDA 4 (SUF 4)和FLC EXPRESSOR (FLX) 等相互作用形成FRI復(fù)合體,結(jié)合到FLC啟動(dòng)子特殊區(qū)域,誘導(dǎo)FLC的表達(dá)進(jìn)而抑制開(kāi)花[16-18]。Michaels等[19]研究表明,FRL 1在FRI促進(jìn)FLC表達(dá)方面起特異性作用,且FRL 1、FRL 2和FRI都是冬季生態(tài)型擬南芥的習(xí)性所必需的。迄今為止,在白菜類植物中已克隆到BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3和BrFLC5這4個(gè)擬南芥FLC的同源基因及2個(gè)擬南芥FRI的同源基因BrFRIa和BrFRIb[20-21],大白菜BrFLC與擬南芥FLC基因的功能相似,且不同抽薹性的大白菜對(duì)春化的敏感程度也不相同[22-23]。目前對(duì)大白菜BrFLC基因的研究主要集中在BrFLC堿基突變或缺失與抽薹性狀相關(guān)性方面,但多個(gè)BrFLC基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)及與抽薹性狀的關(guān)系尚不完全清楚。關(guān)于大白菜中擬南芥FRI、FRL等FRI-LIKE(FRIGIDA-LIKE)基因家族成員同源基因的研究也鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)自然低溫春化對(duì)5份大白菜材料進(jìn)行耐抽薹性鑒定及研究人工低溫春化對(duì)現(xiàn)蕾期的影響,初步探究4個(gè)大白菜BrFLC基因及4個(gè)BrFRI-LIKE基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)機(jī)制,為進(jìn)一步解析BrFLC及BrFRI-LIKE基因的功能,篩選耐抽薹性鑒定的候選基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所大白菜課題組自育的5個(gè)大白菜品系:ZQY-75,ZQB-5,ZCB-3,ZRY-2,ZLQ-1。

1.2 大白菜低溫春化試驗(yàn)

1.2.1大白菜自然低溫春化試驗(yàn)

2021年10月29日,對(duì)參試材料進(jìn)行穴盤育苗,2021年12月8日地膜覆蓋定植于田間,每個(gè)材料種植20株,在試驗(yàn)過(guò)程中記錄試驗(yàn)地的氣溫情況,分別統(tǒng)計(jì)各材料的成熟期、生育期[24]及現(xiàn)蕾期。在十字花科蔬菜耐抽薹性快速、高效鑒定的方法中,現(xiàn)蕾期是最可靠的指標(biāo)之一[25],因此本試驗(yàn)選用現(xiàn)蕾期作為耐抽薹性評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

耐抽薹性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):現(xiàn)蕾期<120 d為不耐抽薹,120 d<現(xiàn)蕾期<140 d為一般耐抽薹,140 d<現(xiàn)蕾期<150 d為耐抽薹,現(xiàn)蕾期>150 d為強(qiáng)耐抽薹。

1.2.2大白菜人工低溫春化試驗(yàn)

2022年3月24日,挑選籽粒飽滿的種子播種于花盆中,每個(gè)材料種20株,于25 ℃長(zhǎng)日照條件(16 h光照,光照為2 000 lx)下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后,將植株轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中,于4 ℃的低溫條件下培養(yǎng)50 d后,轉(zhuǎn)移至22 ℃的長(zhǎng)日照條件(14 h光照,光照為2 000 lx)下生長(zhǎng)(模擬貴陽(yáng)5—6月氣候及光照條件設(shè)定)。統(tǒng)計(jì)各材料低溫處理結(jié)束至現(xiàn)蕾天數(shù)和現(xiàn)蕾期。

1.3 RT-qPCR試驗(yàn)材料處理

將參試材料的種子消毒后,分別播種于含1%(W/V)蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上,于25 ℃長(zhǎng)日照條件(16 h光照)下培養(yǎng)。將培養(yǎng)14 d的幼苗轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行4 ℃低溫處理,分別于處理后0 h,48 h,72 h,96 h,144 h對(duì)幼苗進(jìn)行取樣,每次取樣后迅速將材料置于液氮中速凍,并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的基因的獲得

在BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.cn)中,下載擬南芥FLC、FRI、FRL1、FRL 2蛋白序列及大白菜全基因組蛋白序列文件(Brara Chiifu V 3.5 版本)和gff 3文件,構(gòu)建本地BLASTP數(shù)據(jù)庫(kù)。將上述擬南芥蛋白序列進(jìn)行本地BLASTP,剔除冗余序列后,使用SMART(https://smart.embl.de/)和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域鑒定,最終確定大白菜BrFLC、BrFRI及BrFRL1、BrFRL2基因信息。

1.5 基因表達(dá)分析

試驗(yàn)采用天根公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取植株的總RNA,使用TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time),按照說(shuō)明書操作合成cDNA。以大白菜BrTub-α為內(nèi)參基因,引物設(shè)計(jì)參照Xiao等[26]的方法,根據(jù)目的基因序列信息設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表1),并通過(guò)PCR驗(yàn)證引物的特異性。采用南京諾唯贊生物公司AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒,使用BIO-RAD CFX 96熒光定量PCR儀,進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系及程序參照RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。采用2-△△CT的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[27],采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,SPSS 20.0軟件進(jìn)行多重比較。

表1 RT-qPCR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 自然低溫春化條件下大白菜的耐抽薹性比較

根據(jù)試驗(yàn)期間試驗(yàn)地的氣溫統(tǒng)計(jì)情況(表2),在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi),月平均最低氣溫4.20 ℃,出現(xiàn)在2022年2月,日均氣溫10 ℃以下累計(jì)有100 d,4 ℃以下累計(jì)有34 d,完全能滿足大白菜對(duì)春化溫度和時(shí)間要求,利于大白菜耐抽薹性的鑒定評(píng)價(jià)。觀察記錄參試大白菜的成熟期,分別計(jì)算各材料的生育期和現(xiàn)蕾期(表3),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,ZCB-3的生育期最長(zhǎng),為139 d,在參試材料中屬于較晚熟品種, ZRY-2、ZLQ-1在2月下旬出現(xiàn)未熟抽薹,未能比較其品種熟性(表3);ZCB-3現(xiàn)蕾期最晚,為156.75 d,ZRY-2現(xiàn)蕾期最早,為113.85 d。參試材料的耐抽薹性由強(qiáng)到弱依次為ZCB-3、ZQB-5、ZQY-75、ZLQ-1、ZRY-2。耐抽薹性鑒定結(jié)果顯示,ZCB-3屬?gòu)?qiáng)耐抽薹材料,ZQB-5屬耐抽薹材料,ZQY-75屬一般耐抽薹材料,ZRY-2、ZLQ-1均為不耐抽薹材料。

表2 試驗(yàn)期間氣溫統(tǒng)計(jì)

表3 大白菜物候期及現(xiàn)蕾期調(diào)查統(tǒng)計(jì)

2.2 人工低溫春化對(duì)大白菜現(xiàn)蕾時(shí)間的影響

幼苗經(jīng)過(guò)4 ℃的低溫處理50 d后,ZCB-3需46.1 d才能全部現(xiàn)蕾,其次是ZQB-5,需要38.9 d,ZRY-2所需時(shí)間最短,在低溫處理后9.6 d完全現(xiàn)蕾(表4)。ZQY-75、ZQB-5、ZCB-3、ZRY-2、ZLQ-1現(xiàn)蕾期較自然低溫春化下分別提早43.1 d,41.75 d,46.65 d,40.25 d,41.8 d(表3,表4)。

表4 人工低溫條件下大白菜現(xiàn)蕾天數(shù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)

2.3 大白菜BrFLC和BrFRI-LIKE基因的獲得

通過(guò)本地BLASTP和蛋白保守結(jié)構(gòu)域鑒定,最終在大白菜中獲得4個(gè)擬南芥FLC同源基因,按照文獻(xiàn)[20]的研究結(jié)果,分別命名為BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3、BrFLC5(表5);獲得2個(gè)擬南芥FRI同源基因,根據(jù)與擬南芥FRI的同源性命名為BrFRIa和BrFRIb(表5);獲得擬南芥FRL1同源基因1個(gè),命名為BrFRL1,獲得FRL2同源基因1個(gè),命名為BrFRL2(表5)。4個(gè)BrFLC基因編碼蛋白長(zhǎng)度在196～220 aa之間,BrFLC1和BrFLC2分別分布在10號(hào)和2號(hào)染色體上,BrFLC3和BrFLC5分布在3染色體上;BrFRIa編碼蛋白長(zhǎng)度為367 aa,位于10號(hào)染色體上,BrFRIb編碼蛋白長(zhǎng)度為597 aa,位于3號(hào)染色體上;BrFRL1、BrFRL2編碼蛋白長(zhǎng)度分別為452 aa和352 aa,分別位于10號(hào)和9號(hào)染色體上(表5)。

表5 大白菜BrFLC和BrFRI-LIKE基因的基本信息

2.4 大白菜BrFLC基因在低溫處理下的表達(dá)分析

在4 ℃低溫處理下,4個(gè)BrFLC基因在參試材料中的相對(duì)表達(dá)量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì),且在低溫處理48 h時(shí)降幅最大,隨后在48～144 h之間,降幅逐漸變小。參試材料中,同一BrFLC基因在ZRY-2與ZLQ-1中的相對(duì)表達(dá)量之間差異不顯著,但在任何處理時(shí)期均低于在其他3份材料中的表達(dá)量且差異顯著(圖1)。

注:不同小寫字母表示在同一處理時(shí)期不同材料的基因相對(duì)表達(dá)量差異顯著(p<0.05)。下同。

BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3基因在5份材料中呈現(xiàn)較一致的表達(dá)趨勢(shì),即在各個(gè)處理時(shí)期基因相對(duì)表達(dá)量總體趨勢(shì)為ZQY-75>ZQB-5>ZCB-3>ZRY-2>ZLQ-1(圖1 A、B、C);BrFLC5基因在5份材料中的相對(duì)表達(dá)量在各處理時(shí)期均表現(xiàn)為ZQB-5>ZCB-3>ZQY-75>ZLQ-1>ZRY-2(圖1 D)。在ZQY-75中,BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3基因在低溫處理48 h時(shí),相對(duì)表達(dá)量下降幅度均大于其他4個(gè)材料(圖1 A、B、C);除BrFLC3之外,其余3個(gè)BrFLC基因在ZQB-5中的相對(duì)表達(dá)量在低溫處理各時(shí)期均高于ZCB-3,但在低溫處理開(kāi)始時(shí),4個(gè)BrFLC基因在這2份材料中的相對(duì)表達(dá)量之間差異不顯著(圖1)。

2.5 大白菜BrFRI-LIKE基因在低溫處理下的表達(dá)分析

在4 ℃低溫條件下,隨著處理時(shí)間的增加,4個(gè)BrFRI-LIKE基因在5份參試材料中的相對(duì)表達(dá)量整體呈上升趨勢(shì)(圖2);在任何處理時(shí)期,ZRY-2和ZLQ-1同一BrFRI-LIKE基因的相對(duì)表達(dá)量之間均無(wú)顯著差異,且表達(dá)量均顯著低于其他3個(gè)材料。在低溫處理144 h時(shí),不同材料的BrFRIa、BrFRL1、BrFRL2基因的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)ZQY-75>ZCB-3>ZQB-5>ZRY-2>ZLQ-1(圖2 A、C、D)。在ZCB-3中,低溫處理0 h,48 h,72 h,96 h時(shí),BrFRIa、BrFRIb、BrFRL1基因的相對(duì)表達(dá)量分別低于ZQY-75、ZQB-5;在低溫處理144 h時(shí),ZCB-3中4個(gè)BrFRI-LIKE基因的相對(duì)表達(dá)量均高于ZQB-5,而BrFRIb基因的相對(duì)表達(dá)量高于ZQY-75(圖2)。

圖2 大白菜BrFRI-LIKE基因在低溫處理下的表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)5份大白菜的耐抽薹性進(jìn)行了比較鑒定,結(jié)果顯示,ZCB-3屬?gòu)?qiáng)耐抽薹材料,ZQB-5屬耐抽薹材料,ZQY-75屬一般耐抽薹材料,ZRY-2、ZLQ-1均為不耐抽薹材料。參試材料幼苗在經(jīng)過(guò)4 ℃低溫處理50 d后,播種至抽薹時(shí)間較自然低溫春化縮短40 d以上,而自然低溫春化期間,平均氣溫4 ℃以下有34 d,說(shuō)明低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)能縮短大白菜現(xiàn)蕾時(shí)間,這與張魯剛等[28]的研究結(jié)果一致。

本研究對(duì)參試大白菜幼苗進(jìn)行4 ℃低溫處理0～144 h,研究春化相關(guān)基因BrFLC(4個(gè)基因)及BrFRI-LIKE基因(4個(gè)基因)對(duì)低溫的響應(yīng)。結(jié)果顯示,5份材料中,BrFLC基因均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì),且在處理48 h時(shí),表達(dá)量降幅最大,之后降幅逐漸平緩,而BrFRI-LIKE基因則隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)量呈上升趨勢(shì),表明BrFRI-LIKE基因與BrFLC基因未存在明顯的共表達(dá)趨勢(shì),這與段文優(yōu)[29]對(duì)甘藍(lán)型油菜的研究結(jié)果相似。對(duì)于溫度如何影響FRI對(duì)FLC基因的調(diào)控機(jī)理,最新研究揭示,在擬南芥中,春化早期低溫誘導(dǎo)大分子凝聚體(FRIGIDA凝聚體)的形成,但并不與活躍的FLC位點(diǎn)共定位,從而阻抑FRI激活FLC,以實(shí)現(xiàn)FLC轉(zhuǎn)錄下調(diào)的分子機(jī)制[30]。

此外,本研究發(fā)現(xiàn),在低溫處理不同時(shí)間下,不耐抽薹的2個(gè)材料(ZRY-2和ZLQ-1)中BrFLC及BrFRI-LIKE基因在任何處理時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量均處于較低水平,且顯著低于其他3份材料,說(shuō)明BrFLC或BrFRI-LIKE基因的表達(dá)水平與大白菜的耐抽薹性有一定的相關(guān)性。ZQY-75和ZCB-3幼苗在人工低溫處理50 d后,現(xiàn)蕾期分別較自然低溫春化提前43.1 d,46.65 d,提前天數(shù)大于其他3份材料,且在低溫處理48 h時(shí),這2份材料中4個(gè)BrFLC基因的相對(duì)表達(dá)量降幅最大,推測(cè)在短期低溫下,BrFLC基因相對(duì)表達(dá)量的降幅可能與現(xiàn)蕾期天數(shù)縮短有一定相關(guān)性。在參試材料中,BrFLC5基因在低溫下的表達(dá)水平高低與材料耐抽薹性強(qiáng)弱有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,說(shuō)明BrFLC5與抽薹開(kāi)花時(shí)間有較明顯的相關(guān)性,這與張學(xué)銘等[31]的研究結(jié)果相似。BrFLC5可作為一個(gè)用于初步篩選強(qiáng)耐抽薹性育種材料的候選基因。

本試驗(yàn)中,低溫處理144 h時(shí),4個(gè)BrFRI-LIKE基因在參試材料中相對(duì)表達(dá)量最高,但由于沒(méi)有更長(zhǎng)的低溫時(shí)間處理作比較,這4個(gè)基因是否在低溫處理144 h時(shí)達(dá)到表達(dá)最高峰值,何時(shí)是表達(dá)量降低的拐點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究。同樣,在低溫處理144 h時(shí),4個(gè)BrFLC-LIKE基因在參試材料中的相對(duì)表達(dá)量最低,但是否表達(dá)量的最低峰以及何時(shí)出現(xiàn)表達(dá)豐度回升的拐點(diǎn)還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。