丹參配方顆粒對(duì)熱毒血瘀證大鼠調(diào)節(jié)作用的代謝組學(xué)研究*

趙新新,黃雪君,2,3,甘海寧,2,3,肖觀林,2,3,趙自明,2,3

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405; 2.廣東省第二中醫(yī)院,廣東 廣州 510095; 3.廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510095

血瘀證指血液運(yùn)轉(zhuǎn)不暢,或血流瘀滯,或血溢脈外而停蓄于體內(nèi)所引起的以疼痛、腫塊、出血、面色或唇舌紫黯或發(fā)紺、脈澀或結(jié)代為主要表現(xiàn)的證候[1],是冠心病、腦卒中、腫瘤、糖尿病等疾病病理發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2]。中醫(yī)認(rèn)為,熱毒之邪可煎熬血液,灼傷脈絡(luò),血液妄行,出血留著或血溢于脈外,遂成瘀血[3]。熱毒血瘀證則伴隨著血瘀、炎性因子含量上升等臨床病理表現(xiàn)[4]。丹參味苦,性微寒,具有涼血消腫、活血化瘀、清心除煩等效用,常用于活血化瘀[5]。目前,尚未發(fā)現(xiàn)有丹參抗熱毒血瘀藥效和代謝機(jī)制研究的報(bào)道。

代謝組學(xué)通過(guò)檢測(cè)生物體在不同干預(yù)條件的特定時(shí)間段,全面、系統(tǒng)觀察和分析內(nèi)源性代謝物的整體性變化,以識(shí)別生物代謝標(biāo)志物,闡明代謝通路和代謝機(jī)制,篩選早期診斷指標(biāo),揭示疾病靶點(diǎn)、發(fā)病機(jī)制和藥物毒性及其機(jī)制[6],其研究模式與中醫(yī)藥整體觀相契合,適用于證候本質(zhì)及證候療效評(píng)價(jià)研究[7]。代謝物的選擇包括尿液、糞便、細(xì)胞、血清等,有研究發(fā)現(xiàn)熱毒血瘀大鼠出現(xiàn)便溏、二便失禁、尿液減少等病理表現(xiàn)[4],為減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣本收集不全、樣本污染等情況對(duì)結(jié)果的干擾,本文采用血清代謝組學(xué)探究血清中的差異代謝物變化,以期從代謝水平探討熱毒血瘀證的代謝本質(zhì)及丹參配方顆?？篃岫狙鲎C的藥效和代謝調(diào)控機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠36只,180～220 g,6～8周齡,購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2018-0002,動(dòng)物合格證編號(hào):No.44007200027077。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,環(huán)境設(shè)施使用許可證號(hào):SYXK(粵)2020-0059,相對(duì)濕度40%～60%,室溫20～25 ℃,大鼠自由飲食水。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審批號(hào):048921。

1.2 藥物與試劑丹參配方顆粒(批號(hào):1050933)、丹參飲片(與丹參配方顆粒采用同一批次丹參,臨用前按參考文獻(xiàn)[8]所述制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑),均由廣東一方制藥有限公司提供。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、角叉菜膠(美國(guó)Sigma-Aldrich公司,批號(hào):12181202、20230705);水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào):2016092910);凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)測(cè)定試劑盒(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,批號(hào):210705002、210900200、Y211019-2);白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)、6-酮前列腺素F1α(6-ketone-prostaglandin 1α,6-keto-PGF1α)試劑盒(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,批號(hào):370211109、569211109、277200816、544211109、107211109);HE染液(廣州優(yōu)迪生物科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào):0314A20)。

1.3 儀器JJ500型電子天平(常雙杰測(cè)試儀器廠);BS224S型電子分析天平(德國(guó)SARIORINS公司);C2000-A型全自動(dòng)高性能血凝儀(上海普利生機(jī)電科技有限公司);Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、Sorvall Legend Micro 17R型微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);TP1020型脫水機(jī)、RM2235型切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);YD-AB型攤烤片機(jī)、YD-6L型生物組織包埋機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司);BX51型光學(xué)奧林巴斯顯微鏡、DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司);ExionLC AC型液相色譜儀(日本島津公司);SCIEX X500R型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司);Milli-Q Advantage A10型純水儀(德國(guó)默克公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立與藥物干預(yù)將36只SD大鼠按體質(zhì)量均衡原則分為對(duì)照組、模型組、丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組(0.54 g·kg-1,按生藥材計(jì)算,4倍臨床等效劑量[9])和丹參配方顆粒組(0.964 g·kg-1,按生藥材計(jì)算,4倍臨床等效劑量),各給藥組以20 mL·kg-1的體積灌胃給藥,對(duì)照組和模型組灌胃等體積去離子水,每天1次,連續(xù)14 d。于給藥第13天,禁食不禁水16 h,除對(duì)照組外,其余各組均采用“角叉菜膠+LPS”法復(fù)制熱毒血瘀大鼠模型[10],并觀察大鼠的行為、精神狀況及毛發(fā)等一般狀態(tài),末次給藥后 1～2 h,連測(cè)3次肛溫,取平均肛溫為大鼠最終體溫,以大鼠肛溫顯著性升高、尾部出現(xiàn)明顯淤血視為模型復(fù)制成功。

2.2 血漿相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)采用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(3 mL·kg-1)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后,腹主動(dòng)脈采血8 mL,其中4 mL用枸櫞酸鈉抗凝后分離血漿,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)血漿TT、PT、APTT水平;ELISA法測(cè)血漿TNF-α、IL-1β、FIB、6-keto-PGF1α、TXB2的水平;其余4 mL血不添加抗凝劑,分離血清,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 HE染色觀察主動(dòng)脈血管壁病理學(xué)變化大鼠麻醉取血后,立即剖取大鼠腹主動(dòng)脈,采用體積分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林溶液固定,常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察主動(dòng)脈血管壁病理學(xué)變化。

2.4 代謝組學(xué)血清樣品處理取-80 ℃凍存血清,室溫下復(fù)融,取100 μL血清置于1.5 mL離心管中,加入400 μL預(yù)冷的體積比1：1的甲醇:乙腈混合液,渦旋30 s,-20 ℃冰箱凍存1 h,4 ℃,12 000 r·min-1離心15 min,取400 μL上清轉(zhuǎn)移至新1.5 mL離心管中,氮?dú)獯蹈?加入100 μL預(yù)冷的體積比1：1乙腈:水混合液,渦旋30 s,4 ℃,12 000 r·min-1離心15 min,精密吸取上清液 80 μL 進(jìn)行色譜分析。

2.5 代謝組學(xué)儀器條件色譜條件:Waters UPLC BEHC18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流速0.3 mL·min-1,進(jìn)樣器溫度4 ℃,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量1 μL。流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脫(0—2 min,1%A;2—8 min,1%～55% A;8—17 min,55%～98% A;17—20 min,98% A;20—20.5 min,98%～1% A;20.5—25 min,1% A)。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,正、負(fù)離子2種模式掃描,掃描范圍50m/z～1 000m/z,霧化氣壓力 55 psi,氣簾氣壓力35 psi,輔助氣壓力55 psi,霧化溫度500 ℃。正、負(fù)離子模式質(zhì)譜條件有所區(qū)別,見(jiàn)表1。

表1 正、負(fù)離子模式下質(zhì)譜條件

基于所建立的UPLC-Q/TOF-MS方法,取上述各大鼠血清樣本10 μL混合得到質(zhì)量控制樣本,按上述方法備樣,在樣品分析前,連續(xù)檢測(cè)6個(gè)質(zhì)量控制樣本;在樣本分析過(guò)程中,每進(jìn)6針樣本進(jìn)1針質(zhì)量控制樣本,以檢驗(yàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與重復(fù)性。

2.6 代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理按照上述條件,基于UPLC-Q/TOF-MS法將處理好的血清樣本進(jìn)樣分析,并對(duì)UPLC-Q/TOF-MS系統(tǒng)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰提取、去噪、峰匹配、峰對(duì)齊后導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)采用修正80%規(guī)則去除缺失值,最小值填充后進(jìn)行歸一化,最終得到代謝組學(xué)數(shù)據(jù);采用主成分分析(principal components analysis,PCA)、正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)、200次置換檢驗(yàn)等多元統(tǒng)計(jì)分析,根據(jù)對(duì)照組和模型組之間的變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)的范圍篩選代謝物,并進(jìn)行t檢驗(yàn),選取 VIP>1且P<0.05的代謝物作為潛在差異代謝物。由在線網(wǎng)站MetaboAnalyst5.0進(jìn)行PCA分析,SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA分析和VIP篩選。將篩選出的差異代謝物的保留時(shí)間、精確的質(zhì)荷比輸入公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)以及KEGG(http://www.kegg.jp/)中進(jìn)行檢索,設(shè)置 10 ppm 為代謝物質(zhì)譜質(zhì)荷比的誤差值,最終結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)與文獻(xiàn)確認(rèn)代謝物。將代謝物名稱輸入MetaboAnalyst5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行通路分析,選取代謝通路影響值(pathway impact)>0.1的通路作為靶標(biāo)路徑。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況比較對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常,反應(yīng)靈敏,二便正常。與對(duì)照組比較,模型組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少、反應(yīng)遲緩、毛發(fā)豎起、精神不振、癱軟無(wú)力、爪甲發(fā)黑,二便失禁、便溏等情況。與模型組對(duì)比,丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組大鼠便溏減輕,丹參配方顆粒組大鼠便溏情況明顯緩解,其余狀態(tài)有不同程度的改善。

3.2 丹參配方顆粒對(duì)血瘀證大鼠體溫的影響與對(duì)照組比較,模型組大鼠體溫有顯著性升高(P<0.01);與模型組比較,丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和丹參配方顆粒組大鼠體溫均有顯著性降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠體溫比較

3.3 丹參配方顆粒對(duì)血瘀證大鼠血漿TNF-α、IL-1β的影響與對(duì)照組比較,模型組大鼠血漿中TNF-α、IL-1β含量顯著性升高(P<0.01);與模型組比較,丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和丹參配方顆粒組大鼠血漿TNF-α、IL-1β含量顯著性降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠血漿TNF-α、IL-1β比較

3.4 丹參配方顆粒對(duì)血瘀證大鼠凝血四項(xiàng)的影響與對(duì)照組比較,模型組大鼠APTT、PT、TT顯著性縮短(P<0.01),而FIB顯著性升高(P<0.01);與模型組比較,丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和丹參配方顆粒組大鼠APTT顯著性延長(zhǎng)(P<0.01);丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組PT和丹參配方顆粒組TT顯著性延長(zhǎng)(P<0.05);而丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和丹參配方顆粒組大鼠FIB均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組大鼠凝血四項(xiàng)比較

3.5 丹參配方顆粒對(duì)血瘀證大鼠血漿TXB2、6-keto-PGF1α的影響與對(duì)照組比較,模型組大鼠血漿TXB2顯著性升高(P<0.01),6-keto-PGF1α顯著性降低(P<0.01);與模型組比較,丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和丹參配方顆粒組大鼠血漿TXB2顯著性降低(P<0.01),6-keto-PGF1α顯著性升高(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 4組大鼠血漿TXB2、6-keto-PGF1α比較

3.6 丹參配方顆粒對(duì)血瘀證大鼠腹主動(dòng)脈病理形態(tài)的影響光鏡下觀察發(fā)現(xiàn):對(duì)照組大鼠腹主動(dòng)脈血管內(nèi)壁血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋完整,無(wú)缺失,無(wú)黏附物,內(nèi)彈力層和中層平滑肌層次分明,無(wú)明顯間隙,無(wú)皺褶;模型組大鼠動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞有脫落而暴露血管壁中層,內(nèi)壁不光滑,黏附物增多,管壁平滑肌排列不齊、有皺褶,纖維層間隙淡染區(qū)增寬、纖維板間隙變大,較大淡染灶,管壁增厚并向管腔內(nèi)隆起、局部管壁增厚;丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組纖維板間隙較模型組縮小、纖維層間隙狹窄、管內(nèi)黏附物減少,未見(jiàn)淡染灶和血管壁增厚;丹參配方顆粒組病變明顯改善。見(jiàn)圖1。

注:A:×200;B:×400;a:對(duì)照組;b:模型組:c:丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組;d:丹參配方顆粒組。圖1 光鏡下大鼠腹主動(dòng)脈血管組織病理觀察(HE染色)

3.7 代謝組學(xué)結(jié)果

3.7.1 血清代謝輪廓分析對(duì)照組、模型組、丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組、丹參配方顆粒組大鼠血清樣本在正、負(fù)離子模式下掃描出總離子流圖,結(jié)果顯示,4組大鼠血清的總離子流圖的峰響應(yīng)值存在差異。見(jiàn)圖2。

注:A/E:對(duì)照組;B/F:模型組;C/G:丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組;D/H:丹參配方顆粒組;上圖為正離子模式;下圖為負(fù)離子模式。圖2 各組大鼠血清樣本的UPLC-MS總離子流圖

3.7.2 方法學(xué)驗(yàn)證采用SMICA軟件對(duì)代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析,與其他樣本比較,質(zhì)量控制樣本分布集中,表明本實(shí)驗(yàn)所用儀器較為穩(wěn)定,所建立的代謝組學(xué)分析方法有較好重復(fù)性。見(jiàn)圖3。

注:A:正離子模式;B:負(fù)離子模式;QC:質(zhì)量控制樣本;sample:血清樣本。圖3 血清質(zhì)量控制樣本和全部血清樣本的PCA圖

3.7.3 熱毒血瘀大鼠血清代謝產(chǎn)物的多元統(tǒng)計(jì)分析采用MetaboAnalyst5.0在線網(wǎng)站,對(duì)歸一化后的四組大鼠的血清代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行的PCA模式分析。從2D、3D角度觀察數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果,對(duì)照組、模型組和給藥組呈現(xiàn)不同的分離趨勢(shì),正離子模式下的分離度明顯優(yōu)于負(fù)離子模式。見(jiàn)圖4。

注:A、a:正離子模式;B、b:負(fù)離子模式;DSSJ:丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組;DSKL:丹參配方顆粒。圖4 大鼠血清PCA得分圖

3.7.4 熱毒血瘀大鼠血清代謝產(chǎn)物的組間分析分別對(duì)各組樣品血清代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析,正常組和模型組在正、負(fù)離子模式下完全分離,R2Y=0.996,Q2=0.849(正離子);R2Y=0.995,Q2=0.741(負(fù)離子)。模型組和丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組在正、負(fù)離子模式下呈分離趨勢(shì),R2Y=1,Q2=0.777(正離子);R2Y=0.998,Q2=0.262(負(fù)離子),模型組和丹參配方顆粒組在正、負(fù)離子模式下朝不同方向聚集,R2Y=0.994,Q2=0.845(正離子);R2Y=1,Q2=0.628(負(fù)離子)。對(duì)各組血清樣品代謝物進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,模型預(yù)測(cè)良好,未出現(xiàn)過(guò)擬合。見(jiàn)圖5、圖6。

注:DSSJ:丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組;DSKL:丹參配方顆粒。圖5 大鼠血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)OPLS-DA得分圖

注:DSSJ:丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組;DSKL:丹參配方顆粒。圖6 大鼠血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)200次置換檢驗(yàn)圖

3.7.5 差異代謝物篩選分別對(duì)四組進(jìn)行兩組間的差異物含量進(jìn)行比較,選擇VIP>1且P<0.05的代謝物作為標(biāo)志性代謝物。與空白組比較,模型組篩選出38個(gè)標(biāo)志代謝物;與模型組比較,丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和丹參配方顆粒組分別篩選出8個(gè)、23個(gè)標(biāo)志代謝物,見(jiàn)表6—表8。與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中膽堿、煙酰胺、L-異亮氨酸、D-苯丙氨酸、L-乳酸等代謝物含量顯著性上升(P<0.05),1-磷酸鞘氨醇、13-羥基十八碳二烯酸等代謝物顯著性下降(P<0.05)。與模型組比較,丹參配方顆粒給藥組血清中異亮氨酸、L-酪氨酸、L-乳酸含量有顯著性下降(P<0.05)。上述代謝標(biāo)志物分層聚類分析,得到熱圖,見(jiàn)圖7。

注:A:對(duì)照組與模型組差異代謝物;B:模型組與丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組差異代謝物;C:模型組與丹參配方顆粒組差異代謝物。圖7 代謝物層次聚類熱圖

表6 模型組大鼠血清標(biāo)志代謝物

表7 丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組血瘀證大鼠血清標(biāo)志代謝物

表8 丹參配方顆粒組血瘀證大鼠血清標(biāo)志代謝物

3.7.6 代謝通通路分析熱毒血瘀證相關(guān)代謝通路有:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝,苯丙氨酸代謝,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,煙酸和煙酰胺代謝,色氨酸代謝,戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化,酪氨酸代謝,精氨酸和脯氨酸代謝10條。丹參配方顆?？篃岫狙鱿嚓P(guān)代謝通路有:亞油酸代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,酪氨酸代謝等。見(jiàn)圖8。

注:A:對(duì)照組與模型組差異代謝通路;B:模型組與丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑組組差異代謝通路;C:模型組與丹參配方顆粒組組差異代謝通路。圖8 血清代謝物KEGG通路富集分析

4 討論

熱毒傷耗津液,增加血液黏稠度,灼傷血管,阻礙血液流動(dòng),迫使血液離開(kāi)經(jīng)絡(luò),致血液干結(jié)成瘀[11]。熱毒血瘀證是炎癥反應(yīng)繼發(fā)血液內(nèi)各種成分變化和活化凝血,導(dǎo)致血栓形成、微循環(huán)障礙和血液流變學(xué)異常[12]。LPS為外來(lái)熱毒,可促凝血,誘導(dǎo)血瘀形成,還可為熱毒血瘀證提供客觀指標(biāo)的變化,角叉菜膠則用于炎癥動(dòng)物造模,二者合用,可復(fù)制熱毒血瘀證模型[13]。機(jī)體內(nèi)注射角叉菜膠和LPS后,IL-1β、TNF-α等炎性細(xì)胞因子激活并釋放,一方面可以調(diào)節(jié)體溫中樞,升高體溫;另一方面可促進(jìn)組織因子的表達(dá),啟動(dòng)內(nèi)、外源凝血途徑[14]。本研究結(jié)果顯示,熱毒血瘀證大鼠表現(xiàn)出與文獻(xiàn)[4]類似的癥狀和體征、血漿中IL-1β、TNF-α含量顯著性升高,提示模型復(fù)制成功。丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑和丹參配方顆?？刹煌潭雀纳粕鲜鲳鲅“Y,并顯著性降低IL-1β、TNF-α含量,表明丹參配方顆粒和丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑可通過(guò)降低炎癥因子的表達(dá)抑制熱毒血瘀的發(fā)展。

凝血四項(xiàng)(APTT、PT、TT和FIB)是評(píng)價(jià)凝血途徑效率的重要指標(biāo)[15],APTT和PT分別評(píng)估內(nèi)源、外源性凝血效率,TT和FIB反映血漿凝血效率[16]。與對(duì)照組比較,模型組大鼠的APTT、PT、TT縮短,FIB含量增加,提示模型組大鼠血凝異常和瘀血生成,血液黏稠、凝聚,流動(dòng)性變差[14];丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑和丹參配方顆粒均可顯著性延長(zhǎng)APTT、降低FIB含量,且有延長(zhǎng)PT、TT的趨勢(shì),表明丹參配方顆粒和丹參標(biāo)準(zhǔn)湯劑可通過(guò)改善血液凝聚、促進(jìn)纖維蛋白的溶解發(fā)揮抗熱毒血瘀作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞具備屏障功能和抗血栓性,維持內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整對(duì)平衡體內(nèi)微循環(huán)和保證血流平穩(wěn)運(yùn)行有重要作用[17],血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌強(qiáng)擴(kuò)血管的PGI2(代謝為PGF1α)、縮血管和促血小板聚集的血栓素A2(TXA2,代謝為TXB2),調(diào)控血管舒縮與血栓形成。血瘀證血液黏稠度增高,可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,致TXB2含量升高、PGF1α降低,TXB2與6-keto-PGF1α(或TXA2與PGF1α)分泌失衡,收縮血管、激活血小板,誘導(dǎo)血栓生成[18],血小板活化促FIB釋放,增加血液黏稠度,損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,構(gòu)成惡性循環(huán),終致瘀血形成。本研究發(fā)現(xiàn),熱毒血瘀大鼠腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞缺失和FIB異常升高,其機(jī)制可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,TXB2與6-keto-PGF1α分泌失衡,繼發(fā)血管收縮、血小板活化所致瘀血有關(guān)。丹參及其有效成分丹酚酸B可顯著性降低TXA2/PGI2或TXB2/6-keto-PGF1α比值[19-20],故丹參配方顆?？赡芡ㄟ^(guò)抗血小板聚集及抗凝因子活化等活血化瘀作用,逆轉(zhuǎn)TXB2/6-keto-PGF1α失衡,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。此外,熱毒血瘀證繼發(fā)的血液流變障礙、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮不完整[18],可導(dǎo)致腹主動(dòng)脈中層粥樣病變,而丹參配方顆粒亦有一定逆轉(zhuǎn)作用。

氨基酸是蛋白質(zhì)合成、代謝或糖異生的重要前體。大量研究結(jié)果表明,血瘀的發(fā)生發(fā)展與相關(guān)氨基酸含量變化密切相關(guān)。谷氨酸升高可促血小板擴(kuò)散、黏附和活化表型的轉(zhuǎn)變[21];血瘀證L-谷氨酸功能異常,可加劇能量代謝失衡和血液循環(huán)功能障礙[22];色氨酸可代謝為L(zhǎng)-苯丙氨酸進(jìn)一步合成酪氨酸,在急性血瘀狀態(tài)下,酪氨酸增加可誘發(fā)多巴胺-β-羥化酶和酪氨酸羥化酶的過(guò)表達(dá),促進(jìn)去甲腎上腺素和腎上腺素的表達(dá)[23],致血管收縮、血黏度增加和血瘀[24];色氨酸亦參與合成5-羥色胺,作為血小板凝血因子,可強(qiáng)烈收縮血管[25],色氨酸還可代謝為色氨酸3-羥基犬尿氨酸和喹啉酸,參與炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、血栓形成[26-27]。由結(jié)果可知,血瘀證大鼠血清L-谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸增加,色氨酸和苯丙氨酸代謝途徑異常,提示氨基酸、蛋白質(zhì)代謝紊亂。

糖酵解或糖異生在機(jī)體代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用,據(jù)報(bào)道,血瘀證可致葡萄糖代謝紊亂[28]。大鼠急性血瘀時(shí),糖代謝相關(guān)代謝物異常,L-亮氨酸可參與合成亮氨酸和異亮氨酸,并異生為血糖,合成能量[29];L-異亮氨酸可參與三羧酸循環(huán),轉(zhuǎn)化為草酰乙酸進(jìn)行糖異生[30];乳酸與丙酮酸均是糖酵解的重要代謝產(chǎn)物,丙酮酸可被還原成乳酸,血栓內(nèi)紅細(xì)胞糖酵解致血乳酸增加,繼發(fā)能量代謝紊亂[31]、誘導(dǎo)炎癥[32]、刺激全血凝固并阻礙血小板聚集[33]。熱毒血瘀大鼠血清L-乳酸增加、L-異亮氨酸減少,提示大鼠體內(nèi)支鏈氨基酸糖異生等糖代謝紊亂。丹參配方顆?？赡孓D(zhuǎn)熱毒血瘀證大鼠上述糖代謝紊亂,抑制瘀血形成。

作為花生四烯酸合成的前體物質(zhì)亞油酸可降低血壓、軟化血管、降低血脂和增加血液循環(huán),進(jìn)而抑制血栓發(fā)生發(fā)展[34-35],血瘀癥大鼠亞油酸代償性升高可解瘀血[36];花生四烯酸升高,一方面增加PGE2和TXA2含量[37],誘發(fā)TXA2和PGE2的病理失衡;另一方面增加腎上腺素酸可活化COX代謝,在血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝為二羥基-PGI2抑制血小板聚集,在血小板中代謝為二羥基血栓素誘發(fā)和加重凝血[38]。血瘀證大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,腎上腺素?zé)o法正常代謝,血小板內(nèi)過(guò)度堆積可加重凝血。丹參配方顆?？赏ㄟ^(guò)降低血清內(nèi)亞油酸含量,發(fā)揮抗凝血作用。

熱毒血瘀模型大鼠膽堿、1-磷酸鞘氨醇等小分子代謝異常,膽堿可參與乙酰輔酶A的合成,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞受損血管的收縮[39];1-磷酸鞘氨醇可抑制微小血管生成、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和調(diào)節(jié)血管通透性來(lái)維持血管完整,發(fā)揮改善內(nèi)皮功能和抗血栓的作用[40-41]。本文模型組大鼠血清小分子減少,參與血瘀證大鼠瘀血與動(dòng)脈病變,丹參配方顆粒對(duì)血瘀癥大鼠膽堿、1-磷酸鞘氨醇無(wú)明顯影響,其抗血瘀機(jī)制可能與膽堿、1-磷酸鞘氨醇代謝調(diào)控?zé)o關(guān)。

總之,熱毒血瘀大鼠存在明顯氨基酸、糖、亞油酸、膽堿、1-磷酸鞘氨醇等代謝異常,丹參配方顆粒可通過(guò)調(diào)控亞油酸、氨基酸(酪氨酸、色氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸等)和乳酸的代謝,抑制凝血過(guò)程,發(fā)揮抗熱毒血瘀作用,但其具體的代謝調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研討。