宏基因組二代測序在原發(fā)性脊柱感染保守治療中的價值

劉曉偉，殷楚強，叢亞男，王德春，王海龍，楊希重，汪學松，陳龍偉，王月磊，王亭

宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing,mNGS）技術(shù)是近幾年蓬勃發(fā)展的一門新興診斷技術(shù)[4-5]，它基于核酸水平，可無偏向地一次性覆蓋送檢樣本中涉及的所有病原體，包括細菌、真菌、病毒甚至寄生蟲等病原微生物。該技術(shù)具有快速、準確率高、病原微生物覆蓋廣等特點，目前，已經(jīng)廣泛用于多系統(tǒng)感染的病原學診斷[4-7]?；谄渥陨淼膬?yōu)勢，未來可能會成為病原學診斷的標準方法。本文回顧性分析原發(fā)性脊柱感染患者的臨床資料，探討mNGS 檢測指導下原發(fā)性脊柱感染保守治療的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年12 月至2022 年2 月就診于青島大學附屬醫(yī)院脊柱外科疑似脊柱感染的358 例患者的臨床資料。納入標準：①根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征、實驗室檢驗及影像學表現(xiàn)等初步診斷為原發(fā)性脊柱感染；②患者入院時無嚴重神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)；③C 型臂X 線機輔助下穿刺病灶獲取標本；④進行常規(guī)實驗室檢驗及mNGS 檢測。排除標準：①未按要求完成全部常規(guī)檢查和mNGS 檢測的患者；②標本送檢過程出現(xiàn)明顯外源性污染的患者；③資料不完整或失訪的患者；④病灶位于頸椎或上胸椎部位的患者。根據(jù)以上納入及排除標準，共47 例患者納入本研究，其中男33 例，女14 例；年齡17～91 歲，平均（63.2±14.4）歲。

本研究已獲得青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：QYFY WZLL27811），并豁免患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測內(nèi)容

患者入院時完善特異性實驗室檢測，如布魯氏菌抗體及血清凝集試驗、結(jié)核感染T 細胞斑點試驗、半乳甘露聚糖抗原檢測、1,3-β-D-葡聚糖檢測，定期監(jiān)測血常規(guī)、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、超敏C 反應蛋白（highsensitivity C reactive protein,hs-CRP）、降鈣素原（procalcitonin,PCT）等感染指標，入院后和發(fā)熱時抽取血培養(yǎng)。采取保守治療方案的患者由脊柱外科醫(yī)師在C 型臂X 線機引導下行病灶穿刺活檢[8]。所有穿刺活檢及開放手術(shù)獲取的標本均進行細菌培養(yǎng)、病理檢查和mNGS檢測。

1.2.2 抗感染治療方案

換算截面法：源于鋼筋混凝土構(gòu)件計算，根據(jù)剛度等效原則，將鋼材換算成相當截面的混凝土，或反之，通常其計算結(jié)果較雙單元法偏大。

未取得明確致病微生物前采用經(jīng)驗性抗感染治療，抗生素使用萬古霉素聯(lián)合三代或四代頭孢，或者利福平聯(lián)合左氧氟沙星。待病原微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測結(jié)果回報后，調(diào)整抗生素種類及用藥療程：化膿性脊柱炎患者常規(guī)抗感染治療12 周，前4 周靜脈給藥，后續(xù)改用同類抗生素口服；布魯氏菌感染患者常規(guī)三聯(lián)用藥（多西環(huán)素、利福平、頭孢曲松鈉）9個月左右[9-11]；脊柱結(jié)核患者常規(guī)四聯(lián)用藥（異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇）9～12 個月[12]；如果患者存在高齡、合并免疫缺陷等疾病、并發(fā)膿腫等，抗生素應用時間需適當延長。每2 周復查血常規(guī)、ESR、hs-CRP、PCT 及各項生化指標；每4 周復查病灶部位MRI。當患者出現(xiàn)保守治療無效或加重、嚴重神經(jīng)功能障礙、病灶部位脊柱穩(wěn)定性喪失時行手術(shù)治療[13-14]。

1.3 原發(fā)性脊柱感染性疾病的診斷標準

1.3.1 臨床診斷標準[12,15]

脊柱感染初發(fā)癥狀常不明顯，缺乏特異性。需結(jié)合患者病史：①病灶部位疼痛，可伴有發(fā)熱等其他癥狀；②病灶節(jié)段MRI 檢查提示椎體或椎間盤信號改變，可伴有椎間隙改變或膿腫形成；③入院血常規(guī)、hs-CRP、ESR、PCT 等感染指標異常，或抗感染治療有效。

1.3.2 病原微生物診斷標準

①化膿性細菌：病灶標本微生物培養(yǎng)或血培養(yǎng)陽性；②布魯氏菌：布魯氏菌抗體陽性且血清凝集試驗結(jié)果＞1∶160 或微生物培養(yǎng)陽性[16]；③結(jié)核分枝桿菌：微生物培養(yǎng)、病理檢查或PCR 任一陽性；④真菌：病原微生物培養(yǎng)或病理檢查陽性。

1.3.3 mNGS檢測陽性標準

檢測出列最低層級的微生物，在同類微生物中所占百分比，稱為相對豐度。查閱同類文獻，對mNGS檢測結(jié)果進行標準擬定：①化膿性細菌或布魯氏菌：定義為屬相對豐度＞15%，同時序列數(shù)＞40 作為診斷的閾值；②結(jié)核分枝桿菌：實際所測得序列數(shù)≥1時，確診為陽性；③真菌：屬相對豐度＞15%，同時序列數(shù)＞50；④臨床罕見的細菌或其他病原體：當屬相對豐度＞10%，同時序列數(shù)＞10作為診斷標準[15]。

實際檢測過程中，背景微生物也會影響結(jié)果。常見的背景微生物一般來源于樣本采集工具、實驗耗材及文庫構(gòu)建所用試劑等，如伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、鞘氨醇單細胞菌屬（Sphingomonas）、脫硫化煤菌屬（Desulfocarbo）及莫拉菌屬（Moraxella）等細菌，以及細環(huán)病毒、人類皰疹病毒等。判讀mNGS 檢測結(jié)果時，背景菌多不被納入致病微生物范疇。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，使用卡方檢驗比較mNGS 檢測和微生物培養(yǎng)兩種檢測方式的陽性率，檢驗水準α取雙側(cè)0.05，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納入病例情況

47 例患者的主要臨床表現(xiàn)為病灶疼痛伴發(fā)熱、病灶局限性疼痛和病灶處及下肢疼痛（表1）。結(jié)合患者病史、體征、實驗室檢查、影像學檢查及穿刺或手術(shù)所見等，47 例均被確診為脊柱感染。感染灶位于胸椎、腰椎及胸腰段合并感染（表1）；mNGS 檢測結(jié)果均在48 h 內(nèi)完成，病原微生物培養(yǎng)完成時間在5～7 d不等。所有患者最終均治愈出院并隨訪1年。

表1 47例脊柱感染病例結(jié)果分布

2.2 病原微生物診斷結(jié)果

2.2.1 病理及病原微生物培養(yǎng)結(jié)果

47例患者臨床診斷及病理結(jié)果分為4類：①化膿性細菌感染：30例，鏡下見中性粒細胞浸潤，慢性化膿性炎，或有死骨存在，偶有膿腫形成；②布魯氏菌感染：10 例，鏡下見炎性細胞浸潤，增殖性結(jié)節(jié)和肉芽腫形成；③結(jié)核分枝桿菌感染：6 例，鏡下見慢性肉芽腫性炎伴凝固性壞死；④真菌感染：1 例，鏡下見較多炎性細胞浸潤，壞死物內(nèi)可見多量真菌菌絲。

47例患者微生物培養(yǎng)陽性23例，陰性24例；陽性結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3 類微生物，其中化膿性細菌感染19 例，占比34.0%（19/47），最常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌分別為金黃色葡萄球菌（7例）、大腸埃希菌（5例）；布魯氏菌3 例，占比6.4%（3/47）；煙曲霉菌1 例，占比2.1%（1/47）。見表2。

表2 病原微生物培養(yǎng)和mNGS檢測結(jié)果分布

2.2.2 mNGS檢測結(jié)果

mNGS 檢測頻次為48 例次（47 例患者中，其中1例術(shù)前行mNGS 檢測結(jié)果陰性，最終該患者進行手術(shù)治療，術(shù)后再次進行mNGS 檢測，結(jié)果陽性），陽性結(jié)果45 例次，發(fā)現(xiàn)4 類致病微生物，其中化膿性細菌30 例次，占比為66.7%（30/45），最常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌分別為金黃色葡萄球菌（8 例次）、大腸埃希菌（5 例次）；布魯氏菌8 例次，占比為17.8%（8/45）；結(jié)核分枝桿菌6 例次，占比為13.3%（6/45）；煙曲霉菌1例次，占比為2.2%（1/45）。見表2。

6 例結(jié)核感染病例均通過病理檢出，其中2 例結(jié)核桿菌PCR 陽性，涂片、培養(yǎng)均為陰性，mNGS 檢測結(jié)果均對應檢出。1 例煙曲霉感染患者，病理結(jié)果提示纖維組織增生及炎細胞浸潤，壞死物內(nèi)可見多量真菌菌絲，微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測均提示陽性。

3 例次mNGS 檢測陰性病例臨床均表現(xiàn)為患處疼痛，伴感染指標升高，細菌培養(yǎng)陰性。2 例次病理提示慢性化膿性炎伴肉芽組織形成，布魯氏菌抗體結(jié)果陽性，抗布魯氏菌感染治療有效，確診為布魯氏菌感染；1 例穿刺后微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測均為陰性，抗生素經(jīng)驗性治療效果不佳，轉(zhuǎn)行手術(shù)清創(chuàng)內(nèi)固定治療，再次行mNGS檢測提示貝納特柯克斯體。

47例脊柱感染患者中，微生物培養(yǎng)陽性23例，陽性率為48.9%（23/47）；mNGS 檢測陽性結(jié)果45 例次，陽性率為93.8%（45/48）。病原微生物培養(yǎng)陽性結(jié)果均與mNGS 檢測有對應。mNGS 檢測陽性率遠高于病原微生物培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。微生物培養(yǎng)陰性病例中，23 例可通過mNGS 檢測獲得對應陽性結(jié)果。其中檢出陽性較多的致病微生物分別為結(jié)核分枝桿菌（6/24）、布魯氏菌（5/24）、鏈球菌（4/24）及葡萄球菌（3/24），因此mNGS 檢測可對確診致病微生物起到有效的補充作用。

2.3 轉(zhuǎn)歸與預后

47例脊柱感染患者中，46例行保守治療并治愈。1 例患者腰痛伴間斷發(fā)熱半年，結(jié)合影像學檢查，臨床診斷腰椎間盤感染。首次穿刺微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測結(jié)果均為陰性，經(jīng)驗性抗感染治療2 周效果不佳，轉(zhuǎn)行病灶清創(chuàng)內(nèi)固定術(shù)。術(shù)后再次送病理檢查、病原微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測，mNGS 檢出貝納柯克斯體陽性，應用多西環(huán)素、羥氯喹抗感染治療后治愈出院。47 例患者均治療康復出院。所有患者隨訪1年無復發(fā)，最終臨床治愈。

3 討論

臨床脊柱感染致病微生物的分類主要有化膿性細菌、布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌及真菌。脊柱感染的臨床表現(xiàn)、體征、影像學表現(xiàn)及常規(guī)感染指標較為相似，臨床對獲取明確致病菌比較困難。微生物培養(yǎng)仍是診斷的“金標準”，但對低毒力菌群及罕見菌陽性率低，且結(jié)果獲取時間長。以往研究顯示，mNGS檢測陽性率高于常規(guī)培養(yǎng)，對于培養(yǎng)陽性率低或培養(yǎng)時間長的病原體，mNGS 檢測具有優(yōu)勢[15]，目前根據(jù)專家共識，高度疑似感染性疾病，調(diào)整抗感染治療方案同時應開展mNGS檢測[17]。

本研究中，病原微生物培養(yǎng)陽性率48.9%，難以達到臨床對于脊柱感染保守治療的精準用藥指導的要求。本研究中，mNGS檢測病原菌的陽性率顯著高于微生物培養(yǎng)，且微生物培養(yǎng)陽性病例均可通過mNGS 檢測獲得對應致病微生物，這表明，mNGS 檢測診斷脊柱感染具有更高的檢出率和準確性，結(jié)合其快速性的優(yōu)勢，可將其作為確診病原微生物的補充手段[5]。這對脊柱感染早期抗感染藥物保守治療有顯著意義。本研究中，mNGS 檢測出現(xiàn)3 例次陰性病例，結(jié)合病例特點分析其原因，不能排除取材過小、獲取病灶為罕見菌或提取菌群濃度偏低的情況；建議對標本獲取精準化，增加檢驗的操作嚴謹性。且與微生物培養(yǎng)相比，本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS 檢測技術(shù)難以有效分辨致病菌和背景菌，在病原菌鑒定及相對豐度方面也缺乏統(tǒng)一標準。此外，mNGS檢測也缺乏針對性的藥敏結(jié)果，藥物多根據(jù)陽性結(jié)果給予常用的抗生素治療，因此mNGS 檢測技術(shù)還需繼續(xù)驗證其效能，以提高準確度。

本研究中患者保守治療獲得高治愈率的另一原因與精準獲取感染標本相關(guān)。本研究中，因通過C型臂X 線機引導對頸椎及上胸椎等復雜部位完成穿刺難度大，故排除此類患者，所有納入患者病灶均位于下胸椎或腰椎部位，根據(jù)李寶田等[18]建議，穿刺首選C 型臂X 線機引導，取樣過程由脊柱外科臨床醫(yī)師嚴格無菌操作，取樣部位為病灶核心，所有樣本穿刺結(jié)果均滿足取樣要求。臨床醫(yī)師是脊柱感染診療的執(zhí)行者，其參與取樣過程，能夠提高對穿刺部位的分析準度；與CT 引導相比，對于下胸椎或腰骶椎部位，C型臂X 線機引導穿刺可獲得同樣良好的穿刺結(jié)果。但對于頸椎及上胸椎等復雜部位的穿刺，建議優(yōu)先選取CT引導[18-19]。

目前脊柱感染仍需規(guī)范診療標準，楊波等[20]認為治療目的在于消除感染、重建和維持脊柱結(jié)構(gòu)和功能及緩解癥狀。牛寧奎等[21]建議先行經(jīng)驗性抗感染保守治療，根據(jù)微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測結(jié)果進行合理的藥物調(diào)整。Guo 等[22]及Tsai 等[23]則分別建議在抗感染治療前，先行早期病灶清創(chuàng)內(nèi)固定術(shù)等手術(shù)治療。目前兩種觀點并無明確定論，本研究中入組的脊柱感染病例在經(jīng)使用抗生素、鎮(zhèn)痛、營養(yǎng)治療、康復鍛煉及預防并發(fā)癥等保守措施治療后，獲得了極高的保守治愈率。如患者無脊柱失穩(wěn)或嚴重神經(jīng)壓迫癥狀，在排除感染性休克等病重情況后，應優(yōu)先選取抗感染藥物治療，并設(shè)計個體化保守治療方案[24]。

本研究存在一定的局限性。本研究屬于單中心研究，且病例數(shù)較少，結(jié)果分析中存在一定的偏倚；本研究納入病例為輕型病例，對結(jié)果分析存在一定偏倚。

4 結(jié)論

原發(fā)性脊柱感染，應用抗生素之前即行感染病灶核心部位活檢，并結(jié)合微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測明確致病微生物后，選取敏感抗生素及合理抗感染療程治療，可獲得顯著的治療效果，并能極大降低患者行手術(shù)治療的概率。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突