米格列奈-精氨酸復(fù)合物的制備與評(píng)價(jià)

王苗苗,李航航,賈麗麗,吳麗欣,楊文智

(1.保定市第一中心醫(yī)院 藥劑科,河北 保定 071000;2.河北大學(xué) 藥學(xué)院,河北 保定 071002)

米格列奈鈣(MTG,圖1a)是治療Ⅱ型糖尿病藥物,其通過抑制胰腺β細(xì)胞的KATP通道來(lái)刺激胰島素分泌,可有效降低糖尿病病人的血糖水平,其促胰島素作用比那格列奈強(qiáng)[1]．但MTG是疏水性藥物,市售MTG多為片劑,其溶液劑開發(fā)因其水中溶解度低而受限．助溶技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、易行的改善難溶藥物溶解度的方法,良好的助溶劑可與難溶藥物生成可溶性絡(luò)合物、復(fù)鹽和締合物,從而改善藥物的溶解度和生物利用度．課題組曾將瑞格列奈-精氨酸復(fù)合物分散于聚乙二醇基質(zhì),采用助溶和固體分散技術(shù),制備瑞格列奈滴丸,實(shí)現(xiàn)難溶瑞格列奈藥物溶解度提高和藥物體內(nèi)生物利用度的改善[2]．精氨酸(Arg,圖1b)是一種人體非必需氨基酸,可與難溶藥物相互作用,起到增加藥物溶解度的功能[3-4]．Rami等[5]制備無(wú)定形布洛芬-精氨酸和吲哚美辛-精氨酸復(fù)合物,與純藥物相比,溶解度得到改善．疏水性藥物辛伐他汀和咖啡酸用精氨酸作為助溶劑,溶解度和生物利用度均得到提高且增強(qiáng)了藥物的穩(wěn)定性[6-7]．精氨酸助溶難溶藥物,制備方法簡(jiǎn)單易行,可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)．因此,難溶藥物分子含有羰基或羧基且pKa偏酸或中性,采用精氨酸助溶易成功．此外,助溶或固體分散技術(shù),均可實(shí)現(xiàn)難溶藥物高度分散在載體分子中,獲得改善藥物溶解度和生物利用度的結(jié)果．但二者根本區(qū)別在于,助溶強(qiáng)調(diào)助溶劑與藥物分子間形成復(fù)鹽、分子締合物或絡(luò)合物;而固體分散強(qiáng)調(diào)在熔融驟冷下,制備所得分散體中藥物分子均勻分散在易溶的載體中且分子由穩(wěn)定晶態(tài)變?yōu)闊o(wú)定型態(tài)．本研究采用堿性的精氨酸小分子與酸性米格列奈藥物形成復(fù)鹽或絡(luò)合物,采用助溶技術(shù)來(lái)探索制備酸性的米格列奈-精氨酸(MTG-Arg)復(fù)合物最佳條件,獲得MTG-Arg復(fù)合物并制備其溶液劑,對(duì)MTG-Arg復(fù)合物的穩(wěn)定性、藥物體外溶出、大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和糖尿病小鼠降糖作用進(jìn)行考察,探討采用精氨酸助溶劑制備MTG-Arg復(fù)合物溶液劑的可行性．

圖1 米格列奈鈣(a)和精氨酸(b)分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecule structure of MTG (a) and Arg (b)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LGJ-18冷凍干燥機(jī)(北京松源華興發(fā)展有限公司);T6型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);D8 ADVACE型X線粉末衍射儀(Bruker,德國(guó));差式掃描量熱儀(DSC-60Plus, Shimadzu, 日本);LC3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司);三諾安淮血糖測(cè)試儀．

米格列奈鈣(武漢遠(yuǎn)程科技發(fā)展有限公司);精氨酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其余試劑均為分析純．

Wistar大鼠(150～200 g)和BALB/c小鼠(18～20 g)由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):1807012)．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米格列奈鈣-精氨酸復(fù)合物的制備

采用紫外-可見分光光度法測(cè)定藥物含量,在190 ～ 400 nm波長(zhǎng)處掃描,確定米格列奈鈣的最大檢測(cè)波長(zhǎng)．精密稱取米格列奈鈣原料藥10 mg,配制成0.5 mg/mL貯備液,并將其稀釋至0.1、0.5、1、2、5、10、15和20 μg/mL溶液,在最大檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定各質(zhì)量濃度的吸光度,以質(zhì)量濃度(μg/mL)-吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線．

采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化MTG-Arg制備工藝,分別考察質(zhì)量比m(MTG)∶m(Arg) = 4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6、溫度(30、40、50、60、70和80 ℃)和pH(5、6、7、8、9和10)對(duì)藥物含量的影響．精密稱取米格列奈鈣5 mg,加蒸餾水5 mL,隨后加入不同質(zhì)量的精氨酸,調(diào)節(jié)不同的pH值,在一定溫度下水浴1 h.離心吸取上清液,采用紫外分光光度法測(cè)定藥物含量．

采用Job’s plot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定米格列奈鈣與精氨酸的結(jié)合比．固定MTG與Arg的濃度之和為10-5mol/L,配制兩者物質(zhì)的量比為0.1至0.9依次增大的溶液,混合后置于37 ℃避光的氣浴恒溫振蕩器1 h．3 500 r/min離心10 min,取上清液,在210 nm處測(cè)定樣品吸光度A,以ΔA和藥物含量對(duì)比系數(shù)r作圖,其中ΔA為加入精氨酸與不加精氨酸時(shí)吸收度之差,r=c(MTG)/[c(MTG)+c(Arg)][8]．

在獲得最佳制備條件下,將MTG-Arg澄清溶液凍干后得到MTG-Arg復(fù)合物粉末．

1.2.2 MTG-Arg復(fù)合物的表征

測(cè)定MTG、Arg、MTG-Arg復(fù)合物和m(MTG)∶m(Arg)=2∶3的物理混合物樣品X線衍射,Cu-Ka靶,掃描2θ為5～80°,λ=1.54 nm;稱取各樣品3～5 mg置于坩堝中進(jìn)行DSC分析,在20 mL/min的氮?dú)饬飨?以10 ℃/min的升溫速率,在50 ～ 300 ℃,測(cè)得DSC圖譜．

1.2.3 MTG-Arg復(fù)合物的穩(wěn)定性考察

按照中國(guó)藥典方法,對(duì)MTG-Arg復(fù)合物進(jìn)行穩(wěn)定性考察．稱取MTG-Arg復(fù)合物粉末適量,置于稱量瓶中,將樣品平鋪,厚度≤5 mm,分別置于濕度75%,溫度60 ℃或光照強(qiáng)度(4 500 ± 500) lx條件下的藥品穩(wěn)定性儀中,于0、5和10 d,采用高效液相色譜法(HPLC),Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),室溫210 nm,波長(zhǎng)20 μL進(jìn)樣,乙腈-水(V(乙腈)∶V(水)=55∶45,pH 2.4)為流動(dòng)相,1 mL/min流速,測(cè)定樣品藥物含量．

1.2.4 MTG-Arg復(fù)合物的體外釋放

稱取MTG原藥和MTG-Arg復(fù)合物,分別置于3 000 u透析袋中,采用透析法測(cè)定體外累積釋放．將透析袋置于20 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中,調(diào)節(jié)pH值為1.2或7.4,在37 ℃、100 r/min的氣浴恒溫振蕩器中震蕩．在0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36和48 h取出全部釋放液,加入同體積相同的PBS溶液,紫外-可見分光光度法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)藥物含量,依公式(1)計(jì)算藥物累積釋放率(Q)．

(1)

其中,ρn:在Tn時(shí)間點(diǎn)時(shí)樣品的質(zhì)量濃度,μg/mL;V:釋放介質(zhì)總體積,mL;Vi:在Ti時(shí)間點(diǎn)時(shí)釋放介質(zhì)的體積,mL;ρi:在Ti時(shí)間點(diǎn)時(shí)樣品的質(zhì)量濃度,μg/mL;W0:復(fù)合物中藥物的質(zhì)量．

1.2.5 大鼠藥代動(dòng)力學(xué)考察

取9只健康雌性Wistar大鼠,實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水,隨機(jī)分為3組,分別灌胃給予MTG混懸液、灌胃MTG-Arg復(fù)合物溶液和尾靜脈注射MTG-Arg復(fù)合物溶液,劑量均為20 mg/kg的米格列奈鈣．在0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h眼眶取血0.5 mL,置于裝有肝素的EP管中,12 000 r/min離心10 min,取上清液200 μL置于EP管中,加入0.6 mL萃取劑V(甲醇)∶V(三氯甲烷)=1∶4,渦旋震蕩5 min,12 000 r/min離心10 min,0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液氮?dú)獯蹈?流動(dòng)相復(fù)溶,離心后取20 μL進(jìn)樣,HPLC法測(cè)定米格列奈鈣的血藥濃度．

建立血樣中米格列奈鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線．精密稱取米格列奈鈣10 mg,配制成1 mg/mL的貯備液,并將其稀釋成質(zhì)量濃度為500、250、100、50、10、1、0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液．精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL,加入大鼠血漿樣品180 μL,按照上述方法處理樣品,HPLC法測(cè)定藥物質(zhì)量濃度．以質(zhì)量濃度-峰面積做圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線,并考察方法的加樣回收率、日間及日內(nèi)精密度．

1.2.6 糖尿病小鼠模型的建立及MTG-Arg復(fù)合物降糖作用考察

雌雄各半的BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)1周,建模前禁食12 h,腹腔注射180 mg/kg的四氧嘧啶生理鹽水溶液[9],于第3天和7天測(cè)定禁食12 h的小鼠血糖,血糖值大于14.5 mmol/L,出現(xiàn)典型的多食和體重減輕癥狀,視為糖尿病小鼠建模成功[10]．造模成功的糖尿病小鼠隨機(jī)分成3組,每組4只,采用灌胃給藥方式考察MTG-Arg溶液劑的降糖作用,設(shè)定1、2和4 mg/kg MTG-Arg復(fù)合物溶液的低、中和高劑量組.灌胃給藥后,在0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12和24 h小鼠尾端取血,血糖儀測(cè)量小鼠血糖值．

2 結(jié)果與討論

2.1 MTG-Arg復(fù)合物的制備

在190 ～ 400 nm對(duì)米格列奈鈣與精氨酸溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,確定米格列奈鈣最大檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm,且精氨酸在此無(wú)干擾．米格列奈鈣溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.041 16x+0.006 69,在0.1～20 μg/mL線性關(guān)系良好(R2= 0.999 5)．

精氨酸用量對(duì)米格列奈鈣溶解度的影響,見圖2a,隨助溶劑精氨酸增多,米格列奈鈣的溶解度先增后降,當(dāng)米格列奈鈣與精氨酸的質(zhì)量比為2∶3時(shí),米格列奈鈣的溶解度達(dá)到最大值．米格列奈鈣是弱酸性藥物,分子結(jié)構(gòu)中的酮羰基可作氫鍵受體,精氨酸屬于堿性氨基酸,它具有多電子中心,隨精氨酸增加,米格列奈鈣溶解度增大,推測(cè)米格列奈鈣與精氨酸間可形成分子間氫鍵,但米格列奈鈣與精氨酸的質(zhì)量比超過2∶3,精氨酸助溶米格列奈鈣達(dá)飽和,再增加精氨酸,過量精氨酸發(fā)生自聚集,反而阻礙米格列奈鈣的溶解[11-13]．采用Job’s plot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定米格列奈鈣與精氨酸結(jié)合比,如圖2b所示,當(dāng)γ= 0.12,即米格列奈鈣與精氨酸的物質(zhì)的量比為1∶6時(shí),米格列奈鈣的溶解度達(dá)到最大,此結(jié)果與米格列奈鈣和精氨酸2∶3質(zhì)量比一致．圖2c為溫度對(duì)米格列奈鈣溶解度影響,溫度升高,利于精氨酸助溶米格列奈鈣,在70 ℃達(dá)到最佳效果．圖2d為pH對(duì)米格列奈鈣溶解度影響,偏堿性pH利于提升米格列奈鈣溶解度,考慮到人體適宜pH,選擇pH 7為其制備條件．因此,經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)獲得制備MTG-Arg復(fù)合物最佳條件:MTG與Arg的質(zhì)量比為2∶3,溶液pH值為7,反應(yīng)溫度為70 ℃．制備澄清溶液后凍干,獲得MTG-Arg復(fù)合物粉末．

a.質(zhì)量比;b.Job’s plot物質(zhì)的量比;c.溫度;d.pH圖2 制備MTG-Arg復(fù)合物的單因素考察Fig.2 Preparation of MTG-Arg complex using single factor experiment

2.2 MTG-Arg復(fù)合物的XRD和DSC表征

圖3A是XRD檢測(cè)圖譜,米格列奈鈣(圖3Aa)的特征晶體衍射峰出現(xiàn)在5.1、5.9、14.7、17.4、21.1°,精氨酸(圖3Ab)的特征晶體衍射峰出現(xiàn)在10.9、16.9、18.4、19.3、23.1、27.4°[14]．其物理混合圖譜(圖3Ac),兩者各自的特征衍射峰存在,而MTG-Arg復(fù)合物(圖3Ad)中兩者的晶體峰消失,說(shuō)明生成的MTG-Arg復(fù)合物使MTG和Arg均由結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定形態(tài)．圖3B是DSC檢測(cè)圖譜,米格列奈鈣(圖3Ba)結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)結(jié)晶水,102 ℃出現(xiàn)水分蒸發(fā)吸熱峰,224 ℃是MTG的吸熱熔融峰,表明藥物呈結(jié)晶態(tài)[15]．精氨酸(圖3Bb)分別在218.8 ℃和242.6 ℃出現(xiàn)2個(gè)吸熱峰,219 ℃處為熔融峰,243 ℃為精氨酸完全分解[14]．在兩者的物理混合物(圖3Bc)中,吸熱熔融峰偏移至217 ℃和239 ℃,混合物以晶態(tài)存在.而MTG-Arg復(fù)合物(圖3Bd)未見明顯吸熱峰,證明復(fù)合物以無(wú)定態(tài)存在．

a.米格列奈鈣;b.精氨酸;c.a和b的物理混合物(2∶3);d.MTG-Arg復(fù)合物圖3 X線粉末衍射(A)與差示掃描量熱圖譜(B)Fig.3 X-ray powder diffractions (A) and DSC therograms (B)

2.3 MTG-Arg復(fù)合物的穩(wěn)定性

藥物穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量的一項(xiàng)重要標(biāo)準(zhǔn)．分別測(cè)定MTG-Arg復(fù)合物在RH 75%高濕、60 ℃高溫和(4 500±500)lx強(qiáng)光照射下,米格列奈鈣含量變化,結(jié)果如表1所示．5 d內(nèi)藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于98%,10 d的藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于95%,表明MTG-Arg復(fù)合物具備良好穩(wěn)定性．此外,采用HPLC測(cè)定MTG-Arg復(fù)合物雜質(zhì),圖譜中除米格列奈鈣峰外,未見其他雜質(zhì)峰．

表1 MTG-Arg復(fù)合物穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.4 MTG-Arg復(fù)合物的體外釋放

圖4為MTG-Arg復(fù)合物和MTG原料藥在模擬胃液和正常體液pH中的藥物累積釋放曲線．米格列奈鈣原藥在pH為1.2和7.4下的藥物累積釋放量均小于MTG-Arg復(fù)合物,證明MTG與Arg形成藥物的無(wú)定態(tài),可加速藥物溶出．如圖4所示,在pH 7.4釋放液中,MTG-Arg復(fù)合物12 h的藥物累積釋放率接近100%,而MTG在48 h累積釋放率32%;在pH為1.2釋放介質(zhì)中,MTG-Arg復(fù)合物的藥物累積釋放同樣優(yōu)于MTG．釋放介質(zhì)的pH增高,利于MTG-Arg復(fù)合物中藥物溶出,這與單因素實(shí)驗(yàn)考察pH對(duì)MTG-Arg復(fù)合物的溶解度影響結(jié)果相符．

a.pH 1.2;b.pH 7.4圖4 MTG-Arg復(fù)合物和MTG在37 ℃下的累積釋放曲線Fig.4 Cumulative drug release curve of MTG-Arg complex and MTG at 37 ℃

2.5 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)與糖尿病小鼠治療評(píng)價(jià)

采用HPLC法測(cè)定血樣,血樣中米格列奈鈣不受空白血漿的干擾,方法專屬性良好,日內(nèi)和日間精密度RSD值分別為2.57%和6.74%,加樣回收率為96.4%～104.8%．米格列奈鈣出峰時(shí)間在7.9 min,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=254 543x+3.33×106,藥物質(zhì)量濃度在0.01～50 μg/mL線性關(guān)系良好(R2=0.997)．如圖5a和表2所示,與MTG混懸劑相比(8.23 ± 0.95) mg/L,灌胃MTG-Arg溶液劑(14.76 ± 1.10) mg/L的最大血藥質(zhì)量濃度提高約1.8倍,尾靜脈注射MTG-Arg溶液劑(18.72 ± 1.39) mg/L提高2.3倍．灌胃MTG-Arg復(fù)合物溶液的藥時(shí)曲線下面積(AUC)相比MTG混懸劑增大3.2倍,表明MTG-Arg復(fù)合物制備可促進(jìn)藥物體內(nèi)吸收.灌胃MTG-Arg復(fù)合物溶液的AUCi.g.值為(91.11 ± 9.23) (mg·h)/L,但尾靜脈注射MTG-Arg溶液的大鼠AUCi.v.值為(116.80±9.11) (mg·h)/L,根據(jù)公式2可得,MTG混懸劑和MTG-Arg復(fù)合物溶液劑相比大鼠尾靜脈注射MTG-Arg溶液劑的絕對(duì)生物利用度(F)分別為25%和78%．式(2)中,Dosei.v.表示尾靜脈給藥劑量;Dosei.g.表示灌喂給藥劑量.

表2 米格列奈鈣混懸液和MTG-Arg復(fù)合物溶液的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=3)

圖5 大鼠藥代動(dòng)力學(xué)曲線(a)及糖尿病小鼠灌胃MTG-Arg溶液劑的降糖效果(b)Fig.5 Pharmacokinetic curve of Wistar rats (a) and treatment of diabetic mice by MTG-Arg complex solution (b)

(2)

為了評(píng)價(jià)MTG-Arg復(fù)合物溶液劑的降血糖效果,選取糖尿病造模組小鼠,灌胃給予4、2、1 mg/kg高、中、低不同劑量,降糖結(jié)果如圖5b所示．灌胃MTG-Arg復(fù)合物溶液3種不同劑量,均有降血糖作用．中、低劑量組小鼠在1～1.5 h血糖略有上升,隨后下降;而高劑量組給藥小鼠,血糖呈下降趨勢(shì),6 h后血糖低于14.5 mmol/L且維持至24 h．

3 結(jié)論

選擇精氨酸作為難溶米格列奈鈣藥物助溶劑,成功自制MTG-Arg復(fù)合物．XRD和DSC結(jié)果顯示,MTG-Arg復(fù)合物中藥物以無(wú)定形態(tài)分散．MTG-Arg復(fù)合物穩(wěn)定性良好,體外釋放顯示復(fù)合物更利于藥物溶出．大鼠灌胃MTG-Arg復(fù)合物溶液的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示,體內(nèi)吸收優(yōu)于原藥．而糖尿病小鼠灌胃MTG-Arg復(fù)合物溶液,可有效降血糖．因此,采用助溶技術(shù)制備MTG-Arg復(fù)合物,可充分保證MTG無(wú)定形態(tài)存在,能促進(jìn)藥物溶出,改善難溶藥物體內(nèi)生物利用度．此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為米格列奈溶液劑的開發(fā)提供必要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持．