基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究芒果苷鈉鹽對動脈粥樣硬化的作用機(jī)制

蒲澤江,趙川平,閆子涵,王乾,周程艷

(1.河北大學(xué) 藥學(xué)院,河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071002;2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,河北 保定 071000)

調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,由動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)引起的心血管疾病死亡率占居民總死亡率的40%以上[1].AS是由于動脈血管管腔狹窄或堵塞而引起的一種心腦血管病,多見于中老年時期,由于其極大的致殘率和致死率,嚴(yán)重危害人體健康和生活質(zhì)量[2].經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),AS的發(fā)生是多方面作用的結(jié)果,涉及炎癥、細(xì)胞凋亡、代謝異常等,故AS的發(fā)生是一個多部位、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用[3].中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多種調(diào)節(jié)方式的特點(diǎn),在治療臨床疾病上蘊(yùn)藏巨大的開發(fā)價值,因此從傳統(tǒng)中醫(yī)藥里開發(fā)多靶點(diǎn)的化合物治療AS成了日益關(guān)注的新焦點(diǎn).

芒果苷(mangiferin,MF)又名莞知母寧,是一種雙苯吡酮類化合物,具有止咳、平喘、化痰、抗炎、抗腫瘤、降血糖、抑菌等作用[4].本課題組研究的芒果苷鈉鹽(MF-Na)是芒果苷的鈉鹽形式,MF-Na比芒果苷具有更高的水溶性和更高的生物利用度.筆者之前的研究表明芒果苷鈉鹽(MF-Na)具有抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝異常等作用[5],而AS的發(fā)展涉及炎癥、代謝異常等情況,因此MF-Na在治療AS的研究上具有很大的前景,但是MF-Na治療AS的作用機(jī)制尚不明確.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是把方藥與疾病間相關(guān)聯(lián)的分子放在一個背景網(wǎng)絡(luò)里,以“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”為核心,進(jìn)行多角度分析,從而探究藥物治療疾病的機(jī)制[6].本文以MF-Na為研究對象,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法,對MF-Na治療AS的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討.巨噬細(xì)胞是調(diào)控炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫的重要角色,為許多炎癥性疾病的病理標(biāo)志,如肥胖、AS等,并與腫瘤預(yù)測、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有重要關(guān)系[7].巨噬細(xì)胞又是人體重要的固有免疫細(xì)胞之一,因此本文選擇巨噬細(xì)胞進(jìn)行了深入的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究,大大減少了后期實(shí)驗(yàn)的盲目性,為研究MF-Na對AS的治療作用提供了有益的參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7細(xì)胞)為實(shí)驗(yàn)室凍存庫凍存細(xì)胞;芒果苷鈉鹽[8]、ox-LDL(批號:2021-04-15);DMEM培養(yǎng)基(批號:AF29449021);胎牛血清(批號:21110702);CCK-8(批號:006Z0102);大鼠酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA): TNF-α、NF-κB、IL-6、CCL2、CXCL1(批號:202108);NF-κB p65抗體(批號:A107086414);NF-κB p50抗體(批號:A108261659);即用型SP免疫組化試劑盒(批號:20220519);質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液(批號:22105339);載玻片(批號:19048);RIPA裂解液(批號:01408/28421);Triton X-100(批號:1109F055).

1.2 MF-Na治療AS的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1 MF-Na化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測及靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

選擇MF作為MF-Na靶點(diǎn)篩選的化合物,登錄Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),通過搜索“Mangiferin”獲得MF的化學(xué)結(jié)構(gòu)、Smile號、InChikey號等相關(guān)信息.進(jìn)一步通過四大數(shù)據(jù)庫“TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、STITCH數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de/)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/)、SEA數(shù)據(jù)庫(http://sea.bkslab.org)”預(yù)測MF-Na的作用靶點(diǎn).為了統(tǒng)一靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)名稱,則把預(yù)測出來的靶點(diǎn)信息利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將所有靶點(diǎn)統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為官方基因名,即Official Symbol.

STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫是一個在線搜索已知蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫,可以對輸入蛋白間的相互作用進(jìn)行打分評價,連接度越大,則可信度越高.為了讓MF-Na中篩選出來的蛋白相互作用關(guān)系可視化,將上述篩選出來的MF-Na潛在靶點(diǎn)信息上傳到STRING數(shù)據(jù)庫,在該網(wǎng)站通過設(shè)置研究物種為“Homo sapiens”,得到蛋白間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(PPI網(wǎng)絡(luò)圖)以及相關(guān)的拓?fù)鋵W(xué)分析.

1.2.2 AS疾病靶點(diǎn)預(yù)測

OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)、Genecards 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、GAD數(shù)據(jù)庫(https://geneticassociationdb.nih.gov/)里面提供了基因組、蛋白組、轉(zhuǎn)錄組和遺傳上所知的全部人類基因信息.分別登錄OMIM、Genecards、GAD數(shù)據(jù)庫,輸入關(guān)鍵詞“Atherosclerosis”獲得與AS相關(guān)的疾病靶點(diǎn).登錄STRING數(shù)據(jù)庫,將篩選到的AS相關(guān)靶點(diǎn)上傳,在該網(wǎng)站通過設(shè)置研究物種為“Homo sapiens”,得到蛋白間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(PPI網(wǎng)絡(luò)圖)以及相關(guān)的拓?fù)鋵W(xué)分析.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建能夠用于深入了解不同蛋白在復(fù)雜疾病中的作用,因此本研究構(gòu)建“MF-Na的成分靶點(diǎn)PPI”及“AS相關(guān)靶點(diǎn)PPI”.

1.2.3 MF-Na作用于AS的潛在關(guān)鍵作用靶點(diǎn)

首先登陸Webtools.venn網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),分別錄入“1.2.1”、“1.2.2”中篩選得到的靶標(biāo),點(diǎn)擊“Submit”得到2個靶標(biāo)的交集,即藥靶和疾病基因的交集,這個交集中的靶標(biāo)即MF-Na治療AS的關(guān)鍵作用靶點(diǎn).為了進(jìn)一步了解這些靶標(biāo)在疾病治療中的作用,將上述篩選出來的靶點(diǎn)信息上傳到STRING數(shù)據(jù)庫,在該網(wǎng)站通過設(shè)置研究物種為“Homo sapiens”,得到蛋白間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(PPI網(wǎng)絡(luò)圖)以及相關(guān)的拓?fù)鋵W(xué)分析.

1.2.4 相關(guān)靶點(diǎn)功能及通路分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)是一個開放的多功能生物信息在線數(shù)據(jù)庫,為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息.DAVID數(shù)據(jù)庫通常用于靶基因的描述和注釋,以此來探究靶基因的信號通路.登錄DAVID數(shù)據(jù)庫,把篩選出來的關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)入,限定物種為“Homo sapiens”,P≤0.05為篩選閾值,勾選生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞學(xué)組分(celluar components,CC)和生物學(xué)功能(molecular function,MF)3個方面進(jìn)行GO分析,預(yù)測關(guān)鍵靶點(diǎn)的相關(guān)功能.再利用DAVID對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,設(shè)置物種為“Homo sapiens”,最終得到氣泡圖.

1.2.5 “化合物-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

Cytoscape是一個生物信息學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)繪圖軟件,具有強(qiáng)大的功能,可用于信號通路與靶點(diǎn)分子間相互作用關(guān)系的可視化研究.以MF-Na靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果、MF-Na治療AS關(guān)鍵靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果、作用的通路富集結(jié)果這幾個方面的數(shù)據(jù)為節(jié)點(diǎn)(node),先在Excle表中建立彼此對應(yīng)的關(guān)系,再導(dǎo)入Cytoscape軟件,然后構(gòu)建并分析“化合物-靶標(biāo)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖.網(wǎng)絡(luò)圖中若其中某個靶標(biāo)是該化合物的潛在靶標(biāo),則用線把它們連接起來.通過構(gòu)建這樣一個多邊的、多層次的、全面的網(wǎng)絡(luò)圖來了解靶標(biāo)所處的通路.

1.3 MF-Na對AS的分子對接研究

采用AutoDock Vina軟件,進(jìn)行分子對接.首先登陸Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫,下載芒果苷的sdf化學(xué)結(jié)構(gòu),再使用Chemdraw畫出芒果苷鈉鹽(MF-Na)化學(xué)結(jié)構(gòu),把MF-Na作為分子對接的配體,其次登陸RCSB PDB(https://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫下載MF-Na與AS對應(yīng)的共同靶標(biāo)蛋白質(zhì)的pdb分子結(jié)構(gòu),作為分子對接的受體.打開AutoDock Vina軟件,分別導(dǎo)入 Degree值靠前的靶標(biāo)蛋白質(zhì)受體與MF-Na進(jìn)行分子對接.對接完成后分別得到MF-Na與每個蛋白受體的對接得分值,得分值越低,表示配體與蛋白受體的結(jié)合越穩(wěn)定.

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素與鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中,然后放置于37 ℃、CO2孵育箱中培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài).采用氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型.

1.4.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

用胰酶消化細(xì)胞,再取密度為1×104/mL的RAW264.7細(xì)胞懸液,接種到96孔板中,設(shè)好細(xì)胞分組后培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞貼壁后按分組加入含不同濃度(0、10、20、40、80、160、320 μmol/L)MF-Na的DMEM培養(yǎng)基100 μL,置于孵育箱中培養(yǎng)24 h后向每個孔中加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h,用酶標(biāo)儀測定450 nm處每個孔的吸光度(OD)值,通過計算后獲得細(xì)胞活力,以對照組細(xì)胞活力為基準(zhǔn).計算其余各組的相對細(xì)胞活力.

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中炎癥因子水平

將細(xì)胞以1×105/mL接種于6孔板中,然后分為空白組、模型組和治療組,治療組中給藥濃度依據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選得到.過夜貼壁后,棄去原培養(yǎng)基,正常組中加入DMEM完全培養(yǎng)基、模型組中加入含ox-LDL(50 μg/mL)的培養(yǎng)基、治療組中分別加入不同濃度的MF-Na(20、40 μmol/L)和ox-LDL(50 μg/mL)的培養(yǎng)基,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.隨后吸出細(xì)胞培養(yǎng)液用2 500 r/min離心20 min后收集上清液.同時,用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次,加入RIPA裂解細(xì)胞,12 000g/min離心10 min,收集細(xì)胞裂解液.采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法,通過加樣、加酶、溫育、洗滌和顯色等過程進(jìn)行檢測,然后于450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(OD值),并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中的TNF-α、NF-κB、IL-6、CCL2和CXCL1的水平的計算.

1.4.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NF-κB p65和NF-κB p50蛋白的表達(dá)

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MF-Na對AS的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 MF-Na化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測及靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

TCMSP、STITCH、Swiss Target Prediction、SEA幾大數(shù)據(jù)庫對MF-Na靶點(diǎn)進(jìn)行篩選之后,分別預(yù)測得到2、30、72、24個靶點(diǎn),整合來自各個數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn),去除重復(fù)的靶點(diǎn)后共得到119個靶點(diǎn).119個靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中,限定物種為“Homo sapiens”,得到各蛋白基因之間的相互作用關(guān)系,通過Cytoscape繪制PPI網(wǎng)絡(luò),于是得到MF-Na活性成分所作用的蛋白之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果如圖1所示.圖1中的每1個靶點(diǎn)都代表1個節(jié)點(diǎn),連線表示靶點(diǎn)的連接度,即靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的程度.靶點(diǎn)在圖中的連線越密集就說明該靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的占比權(quán)重越大,越說明此靶點(diǎn)就是MF-Na的重要靶點(diǎn).另外對這些排名前15的靶點(diǎn)進(jìn)行了拓?fù)鋵W(xué)分析,由拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果可知AKT1,TP53,EGFR,HRAS,IL-6,TNF等是MF-Na作用的重要靶點(diǎn),如表1所示.

表1 MF-Na蛋白互作拓?fù)鋵W(xué)分析(度值排序前15個靶點(diǎn))

圖1 MF-Na活性靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.1 PPI network of MF-Na active target

2.1.2 AS疾病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建

進(jìn)入OMIM、GAD和Genecards 數(shù)據(jù)庫,檢索AS相關(guān)的靶點(diǎn),輸入“Atherosclerosis”獲得與AS相關(guān)靶點(diǎn)分別為200、150、257個靶點(diǎn),并刪除重復(fù)后共有433個,得到在3個數(shù)據(jù)庫中AS疾病重要的一些靶標(biāo)基因.把得到的433個靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中,限定物種為“Homo sapiens”,得到各蛋白基因之間的相互作用關(guān)系,然后導(dǎo)入Cytoscape軟件,繪制PPI網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中邊最多、連接最密集的節(jié)點(diǎn)就是與疾病相關(guān)的最重要的基因,如圖2所示.由拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果可知,IL-6、TNF、INS、ALB、AKT1、VEGFA等是治療AS的重要靶點(diǎn),結(jié)果如表2所示.

表2 AS蛋白互作拓?fù)鋵W(xué)分析(度值排序前15個靶點(diǎn))

圖2 AS相關(guān)疾病靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of AS related disease targets

2.1.3 MF-Na-AS共同靶點(diǎn)的篩選

通過對MF-Na作用靶點(diǎn)和AS疾病作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選后,得到了MF-Na作用的119個靶點(diǎn)和AS疾病作用的433個靶點(diǎn).登錄http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/網(wǎng)站,分別輸入MF-Na作用的靶點(diǎn)和AS的靶點(diǎn),兩者取交集后就得到了“藥物-疾病”共同靶點(diǎn)23個.將交集中的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中,限定物種為“Homo sapiens”,得到各蛋白基因之間的相互作用關(guān)系,然后導(dǎo)入Cytoscape軟件,得到23個主要靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò),如圖3所示.23個主要靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中直觀地展示了重點(diǎn)靶標(biāo)與其他靶標(biāo)之間的聯(lián)系.由拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果(表3)可知,TNF、IL-6、AKT1、PTGS2、TP53、ESR1等靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中的占比權(quán)重較大,可能是MF-Na治療AS的關(guān)鍵靶點(diǎn).

這一目標(biāo)給他帶來巨大的“壓力”，他努力把壓力化作“趕路”的動力。在這本書的前言“寫在前面”中寫到：“是因?yàn)閹资陙?，我?guī)缀跆焯於荚跇O為緊張地‘趕路’，追求專業(yè)鉆研上的進(jìn)展，……總之一句話，如果說我這一生有這樣那樣的壓力，那么，‘趕路’便是主流壓力。我給父親的信，主要述說的便是在這一主流壓力下我之所思所寫所為?！?/p>

表3 MF-Na對AS作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)分析

圖3 MF-Na治療AS的潛在直接作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of potential direct targets of MF-Na in the treatment of AS

2.1.4 MF-Na治療AS的靶蛋白功能和通路富集分析結(jié)果

將篩選得到的MF-Na治療AS的23個關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo sapiens”,進(jìn)行GO分析,共得到33個富集結(jié)果(P≤0.05).其中生物學(xué)過程(BP)21個,涉及一氧化氮生物合成過程、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的正向調(diào)控、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、蛋白激酶活性的負(fù)調(diào)控等;生物學(xué)功能(MF)9個,包括類固醇激素受體、細(xì)胞因子活性、酶的結(jié)合等;細(xì)胞學(xué)組分(CC)3個,包括蛋白質(zhì)絡(luò)合物、細(xì)胞外空隙、胞外區(qū)等.

KEGG通路富集分析,得到46個相關(guān)通路(P≤0.05),按照顯著性P值由高到低進(jìn)行排序,圖4列出了排序前30條的富集結(jié)果.橫軸表示靶點(diǎn)的得分值,縱軸是通路名稱,點(diǎn)大小表示路徑中目標(biāo)的數(shù)量,點(diǎn)顏色反映顯著性,P值越小顏色越偏紅色,P值越大越呈藍(lán)色.Rich factor越大,表示富集的程度越大,P值越接近于零,表示富集越顯著.排除與本疾病關(guān)聯(lián)性不大的通路,再從前30條通路中選擇得分高的通路,于是得到estrogen signaling pathway(脂質(zhì)代謝相關(guān))、TNF signaling pathway(炎癥相關(guān))、hypertrophic cardiomyopathy (HCM)(炎癥通路)、HIF-1 signaling pathway(缺氧誘導(dǎo)因子)、HTLV-I infection(炎癥相關(guān))、PI3K-Akt signaling pathway(細(xì)胞代謝)、platelet activation(血小板活化)、insulin resistance(代謝調(diào)節(jié))等通路.

圖4 前30條KEGG通路Fig.4 Top 30 KEGG pathways

2.1.5 “化合物-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape軟件,繪制了MF-Na的“化合物-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,直觀地呈現(xiàn)了MF-Na、AS所對應(yīng)的靶標(biāo)與30條作用通路之間的關(guān)系,如圖5所示.圖5中藍(lán)色圓形代表MF-Na或疾病的作用靶標(biāo)、紅色圓形代表兩者的交集靶標(biāo)、紫色倒三角形代表作用通路、藍(lán)色三角形代表MF-Na、綠色菱形代表AS這種疾病,連線表示它們之間的相互作用.從網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出,AKT1、TNF、IL-6是連接度較高的靶點(diǎn),TNF signaling pathway、platelet activation是主要的通路途徑.圖5結(jié)果顯示了化合物-靶標(biāo)-通路-疾病之間的復(fù)雜的過程,體現(xiàn)了藥物在體內(nèi)發(fā)揮作用時復(fù)雜的生物過程,這表明MF-Na在體內(nèi)主要是通過調(diào)節(jié)炎癥通路、脂質(zhì)代謝和血小板活化通路來發(fā)揮治療作用的.

圖5 MF-Na “化合物-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Network “compound-target-pathway-disease” of MF-Na

2.2 MF-Na對AS的分子對接分析結(jié)果

對23個共同靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排前10的靶標(biāo)(IL-6、TNF、AKT1、PTGS2、TP53、ESR1、NOS3、MMP9、CDKN2A、ALOX5)與MF-Na進(jìn)行分子對接,并且選用辛伐他汀作為對照藥物與MF-Na進(jìn)行對接作為參考.結(jié)果顯示與MF-Na結(jié)合較好的靶點(diǎn)有TNF,與Glu、Ser、Met等氨基酸殘基形成氫鍵,結(jié)合能為-38.07 kJ/mol,小于對照藥物(-32.22 kJ/mol);IL-6與Gln、Asn、Lys、Thr、Tyr等氨基酸殘基形成氫鍵,結(jié)合能為-30.12 kJ/mol,小于對照藥物(-28.45 kJ/mol),結(jié)果如圖6.

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 MF-Na對RAW264.7活性影響

細(xì)胞活力檢測結(jié)果如圖7所示,適量的MF-Na對Raw264.7細(xì)胞活力具有促進(jìn)作用.在MF-Na濃度從10～320 μmol/L時,細(xì)胞活力呈先上升再下降趨勢,當(dāng)MF-Na濃度為40 μmol/L時細(xì)胞活力最大.從10～20 μmol/L時,細(xì)胞活力逐漸降低;20～40 μmol/L時,細(xì)胞活力上升;在40 μmol/L之后,隨著MF-Na給藥濃度增大,細(xì)胞活力逐漸下降.因此選擇MF-Na 20、40 μmol/L作為低濃度和高濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

不同字母表示具有顯著差異P<0.05;相同字母表示無顯著差異圖7 CCK-8法檢測細(xì)胞活性Fig.7 Cell viability detected through CCK-8 method

2.3.2 MF-Na降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液和裂解液中炎癥因子的表達(dá)水平

在培養(yǎng)上清液中,MF-Na顯著降低了TNF-α、NF-κB和IL-6炎性因子的表達(dá)水平,并且降低了CCL2、CXCL1趨化因子的水平,結(jié)果如表4所示.在裂解液中,模型組的上述炎癥因子顯著增加,當(dāng)給予MF-Na治療后,上述炎癥因子水平明顯下降,這與培養(yǎng)上清液的檢測結(jié)果相一致.這表明MF-Na是作用于TNF-α、IL-6等靶點(diǎn)來減少炎癥反應(yīng)和CCL2等靶點(diǎn)來降低趨化因子,從而達(dá)到治療效果,較好地驗(yàn)證了上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的靶點(diǎn).

表4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中炎癥因子的含量

2.3.3 MF-Na降低細(xì)胞中NF-κB p65和NF-κB p50蛋白的表達(dá)

NF-κB p65和NF-κB p50蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖8所示.NF-κB p65的表達(dá)水平,模型組較正常組高,并有顯著性差異;MF-Na高劑量組,NF-κB p65表達(dá)明顯降低.NF-κB p50的表達(dá)水平,正常組表達(dá)較低,而模型組中表達(dá)則顯著升高;MF-Na高劑量組,p50表達(dá)明顯降低.總體而言,MF-Na顯著降低了細(xì)胞中NF-κB p65和NF-κB p50的表達(dá)水平,表明NF-κB可能是被調(diào)控的靶點(diǎn)之一.

N.正常組;M.OX-LDL處理的模型組;L.低劑量MF-Na治療組;H.高劑量MF-Na治療組圖8 細(xì)胞中NF-κB p65、NF-κB p50的表達(dá)Fig.8 Expression of NF-κB p65 and NF-κB p50 in cells

3 討論

本次研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,通過TCMSP、STITCH、SEA、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫和相關(guān)的資料文獻(xiàn)篩選出了MF-Na的119個潛在靶點(diǎn),再通過OMIM、GAD和Genecards數(shù)據(jù)庫篩選出AS的433個靶點(diǎn),進(jìn)行比對之后得到23個核心靶點(diǎn)基因.結(jié)果表明,TNF-α、IL-6、CCL2等是MF-Na治療AS的重要靶點(diǎn).

AS屬于慢性炎癥疾病,炎癥的發(fā)生貫穿在整個AS的發(fā)生、發(fā)展等過程中.血脂升高等因素導(dǎo)致內(nèi)皮損傷,內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子和趨化因子,如單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemoat-tractant protein,MCP),單核細(xì)胞黏附、聚集并遷移至內(nèi)皮下分化為巨噬細(xì)胞.巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞,并形成脂質(zhì)條紋、粥樣硬化斑塊等病理改變,進(jìn)而引起炎癥大爆發(fā).因此,巨噬細(xì)胞在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中均起著直觀重要的作用[9-10].TNF-α是一種顯著的促炎細(xì)胞因子,參與多種炎癥反應(yīng).大量炎癥因子的產(chǎn)生會維持體內(nèi)的炎癥水平.當(dāng)體內(nèi)TNF-α水平較高時,大量巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型活化,從而加速AS的發(fā)展[11].大量TNF-α還能促進(jìn)其下游NF-κB信號的激活(圖9)[12].NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)其被激活時,體內(nèi)炎性因子的轉(zhuǎn)錄翻譯水平隨之上調(diào),增加活性氧自由基、促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、加重AS[13].NF-κB的激活可以調(diào)節(jié)CCL2的表達(dá)水平.CCL2作為趨化因子配體2,可與Th2型趨化因子受體(CCR2)協(xié)同作用,促進(jìn)單核細(xì)胞向動脈募集.此時,大量單核細(xì)胞聚集到動脈壁中,它們分化為巨噬細(xì)胞,這些巨噬細(xì)胞吞噬LDL后最終成為內(nèi)膜中的泡沫細(xì)胞,導(dǎo)致管腔狹窄[14].CXCL1結(jié)合CXCR2是造成急性細(xì)胞炎癥反應(yīng)的原因之一,并且CXCL1-CXCR2軸促進(jìn)巨噬細(xì)胞聚集,從而發(fā)生AS病變[15].此外,炎性因子IL-6可促使巨噬細(xì)胞對低密度脂蛋白(LDL)的攝取,使脂肪沉積增加,誘導(dǎo)形成泡沫細(xì)胞而促進(jìn)AS的形成[16].由此推測,MF-Na抗AS的作用機(jī)制與炎癥因子的關(guān)系十分緊密.

圖9 TNF-α促進(jìn)NF-κB的激活機(jī)制Fig.9 Mechanism of TNF-α promoting NF-κB activation

GO功能富集分析結(jié)果顯示,MF-Na治療AS涉及多個細(xì)胞進(jìn)程和生物過程,并且主要生物過程均與體內(nèi)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的增殖凋亡密切相關(guān).KEGG通路富集結(jié)果顯示,TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、Estrogen信號通路等是MF-Na發(fā)揮抗AS作用的重要信號通路.富集到TNF信號通路中的基因多以促炎癥基因?yàn)橹?此通路在影響巨噬細(xì)胞活化、釋放炎癥因子、調(diào)控免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用,從而對AS產(chǎn)生影響[17].此外,分子對接結(jié)果顯示,TNF、IL-6等炎癥因子靶標(biāo)與MF-Na的結(jié)合能較低,結(jié)合關(guān)系較好.MF-Na處在對接靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的氨基酸組成的活性區(qū)域里,并與這些氨基酸通過氫鍵連接,十分穩(wěn)定.因此本研究以TNF通路中的部分炎癥因子為目標(biāo),驗(yàn)證其與MF-Na的相互作用,從而探究MF-Na抗AS的作用機(jī)制.

研究結(jié)果表明,TNF-α、NF-κB、IL-6、CCL2和CXCL1在模型組中高表達(dá),加入MF-Na干預(yù)后它們表達(dá)水平均降低,表明MF-Na能逆轉(zhuǎn)AS過程中炎癥因子的升高.同時,免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NF-κB p65和NF-κB p50在模型組和MF-Na高劑量組中的表達(dá)水平具有顯著差異,MF-Na能顯著降低細(xì)胞中NF-κB p65和NF-κB p50的表達(dá)水平.已有研究表明,TNF能激活NF-κB表達(dá),NF-κB的激活可以調(diào)節(jié)CCL2的水平[12,14].這與本研究結(jié)果相一致,說明MF-Na可以通過TNF-α/NF-κB/CCL2途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮對AS的治療作用.

綜上所述,MF-Na對AS具有多途徑調(diào)節(jié)作用.MF-Na可以有效緩解細(xì)胞炎癥情況,降低炎性因子TNF-α、NF-κB、IL-6的含量和降低趨化因子CCL2、CXCL1的含量,并通過TNF-α/NF-κB/CCL2通路發(fā)揮治療作用.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,深入闡述了MF-Na治療AS的作用機(jī)制,為MF-Na治療AS的進(jìn)一步深入研究提供了依據(jù).