四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性及黑色素合成的影響

鄭世祥，張?zhí)?，郭雨昭，?潔，范詠梅

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

四氯蟲(chóng)酰胺（Tetrachlorantraniliprole）是我國(guó)自主研發(fā)的雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑，2013 年在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獲得登記，具有高效、低毒、廣譜的特點(diǎn)[1]。已有研究報(bào)道，10%四氯蟲(chóng)酰胺懸浮劑對(duì)玉米田棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）[2]和玉米螟（Pyrausta nubilalis）[3]有較好的防治效果。四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)水稻二化螟（Chilo suppressalis）[4]和水稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）[5]田間防治效果較好，但藥劑在水稻田的噴灑使用行為會(huì)造成水體環(huán)境污染，從而對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性危害。四氯蟲(chóng)酰胺與甲維鹽復(fù)配對(duì)草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）有較好的防治效果[6]，但由于農(nóng)藥在生態(tài)環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化，會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生一定的影響，如雙酰胺類(lèi)農(nóng)藥氯蟲(chóng)苯甲酰胺和溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)螟黃赤眼蜂（Trichogramma chilonis Ishii）成蜂表現(xiàn)為低風(fēng)險(xiǎn)性[7]；在水生生態(tài)系統(tǒng)中，溴氰蟲(chóng)酰胺會(huì) 影響羊角月牙藻（Selenastrum bibraianum）的光合作用并抑制生長(zhǎng)[8]；10%四氯蟲(chóng)酰胺懸浮劑對(duì)家蠶（Bombyx moriLinnaeus）的毒性為中毒，96 h 的LC50為27.28 mg·L-1；10%四氯蟲(chóng)酰胺懸浮劑對(duì)水生生物鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）為低毒，96 h的LC50為89.11 mg·L-1[9]。黑色素是通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程被合成為紫外線(xiàn)防御機(jī)制，該過(guò)程涉及一系列酶和多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。黑色素生成是由酪氨酸酶基因（Tyr）催化的酪氨酸經(jīng)中間體3,4-二羥基苯丙氨酸氧化為多巴醌而引發(fā)的；在沒(méi)有巰基（例如半胱氨酸或谷胱甘肽）的情況下，黑色素合成途徑中的第二種酶酪氨酸酶相關(guān)蛋白2（Trp-2）將多巴醌迅速轉(zhuǎn)化為多巴色素，隨后將多巴色素轉(zhuǎn)化為5,6-二羥基吲哚（DHI）或吲哚5，6-醌2-羧酸（DHICA）；參與黑色素合成的最后一種酶，即酪氨酸酶相關(guān)蛋白1 （Trp-1），催化DHICA的氧化形成直鏈黑色素[10]。Tyr是一種糖蛋白，它的糖基化和降解作用在抗黑素形成劑的開(kāi)發(fā)中起著至關(guān)重要的作用。小眼癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF），通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Tyr，Trp-1和Trp-2表達(dá)在黑色素生成中起重要作用，為此MITF為黑色素生成的主轉(zhuǎn)錄因子[11]。SRY-box轉(zhuǎn)錄因子10 （Sox10）可以調(diào)節(jié)小眼癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Mitf/mitfa的表達(dá)，Sox10在分化前的神經(jīng)嵴細(xì)胞中廣泛表達(dá)。Sox10功能的喪失會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)（Danio rerio）和小鼠（Mus musculus）中黑色素細(xì)胞和大多數(shù)其他神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞完全或部分缺失，因此Sox10對(duì)于黑色素細(xì)胞的發(fā)育非常重要[12]。

目前未見(jiàn)有四氯蟲(chóng)酰胺原藥對(duì)模式生物斑馬魚(yú)的毒性影響力的研究報(bào)道。本研究以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)靜態(tài)染毒觀察農(nóng)藥暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的影響；同時(shí)通過(guò)RT-qPCR 方法研究四氯蟲(chóng)酰胺原藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎黑色素合成的相關(guān)基因的影響，以期為四氯蟲(chóng)酰胺農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)品和儀器四氯蟲(chóng)酰胺（純度96%，CAS：1104384-14-6），購(gòu)自海南青峰生物科技有限公司；Tween-80、二甲基甲酰胺（DMF）購(gòu)自Solarbio 科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自上海立菲生物技術(shù)有限公司；Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen 科技有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒購(gòu)自Roche 公司；SYBR Green I Master（Roche diagnostics A/S）試劑盒購(gòu)自Roche 公司；Triple Quad 6500+超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀UPLC-MSMS（SCIEX 美國(guó)Waters 公司）；LightCycler96 R 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche 公司）。

1.2 水樣中四氯蟲(chóng)酰胺的測(cè)定

1.2.1 樣品處理試驗(yàn)分別在24，48，72，96 h 對(duì)各試驗(yàn)濃度四氯蟲(chóng)酰胺藥液取樣，并對(duì)樣品進(jìn)行前處理。樣品前處理：將試驗(yàn)藥液稀釋成設(shè)定的濃度的10 倍，取1mL 稀釋后的藥液并加入9 mL的甲醇，使得水藥液與甲醇的體積比為1∶9，再渦旋，搖勻，取1 mL 經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到樣品瓶。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制根據(jù)試驗(yàn)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度為0.005，0.01，0.05，0.1，0.2 μg·mL-1。

1.2.3 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相A：超純水，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫程序：0～0.5 min，保持初始10%的乙腈；0.5～2 min，乙腈的比例線(xiàn)性增加從10%～95%；2～5 min，保持95%的乙腈3 min；5.0～5.2 min，乙腈的比例線(xiàn)性下降從95%～10%；5.2～8.0 min，保持10%的乙腈2.8 min。每個(gè)樣品進(jìn)樣結(jié)束，儀器平衡5 min。流速：0.25 mL·min-1。

1.2.4 質(zhì)譜條件離子化方式：電噴霧離子源（ESI)；檢測(cè)模式：多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM)；掃描方式為負(fù)離子掃描（ESI-），一級(jí)掃描范圍(m/z)：201.9～535.8，二級(jí)掃描范圍(m/z)：499.7～535.8；氣簾氣：0.28 Mpa；碰撞氣：0.06 Mpa；去簇電壓(DP)：70 V；碰撞能量(CE)：5 eV；離子噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550℃。

1.2.5 添加回收和精度設(shè)定加標(biāo)濃度分別為0.01、0.02、0.05 μg·mL-1。然后按照上述的分析方法測(cè)定,并根據(jù)建立的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方程，采用外標(biāo)法計(jì)算回收濃度，根據(jù) SANCO/12 571/2013[13]的要求計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3 斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)及產(chǎn)卵試驗(yàn)用AB 野生型斑馬魚(yú)(Danio rerio)引自國(guó)家斑馬魚(yú)中心，并參照OECD 標(biāo)準(zhǔn)[14]，采用北京愛(ài)生科技公司的斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)中嚴(yán)格控制飼養(yǎng)條件。飼養(yǎng)條件：室溫28 ℃，水的pH 為7.5 左右，水中電導(dǎo)率550 μS·cm-1左右，通過(guò)加氧泵使水中含氧量在80%以上，調(diào)節(jié)養(yǎng)殖時(shí)的光暗比為14 h∶10 h。

斑馬魚(yú)胚胎的獲取：將5 cm 左右的成年斑馬魚(yú)按照雌雄比例為1∶2 的標(biāo)準(zhǔn)放到孵化盒中用擋板隔開(kāi)，并控制光暗比（14 h∶10 h），次日拔掉擋板，使得雌雄魚(yú)之間自由交配，收集交配后30 min 之內(nèi)的胚胎，并小心地用孵化液清洗。

1.4 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)方法以及濃度設(shè)計(jì)按照OECD 標(biāo)準(zhǔn)[14]開(kāi)展斑馬魚(yú)胚胎急性毒性試驗(yàn)，采用靜態(tài)染毒法將暴露于四氯蟲(chóng)酰胺的斑馬魚(yú)胚胎放到24 孔板中觀察，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)6 個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度為：16.00，19.20，23.04，27.65，33.18，39.80 mg·L-1（公比為1.2）。在試驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置溶劑對(duì)照SC 和空白對(duì)照CK，并且每個(gè)濃度選取20 個(gè)觀察胚胎。

1.4.2 藥液設(shè)置四氯蟲(chóng)酰胺原藥試驗(yàn)質(zhì)量濃度： 16.00、 19.20、 23.04、 27.65、 33.18、 39.80 mg·L-1。溶劑和助劑采用DMF 和Tween-80，其最高用量低于0.1%。

1.4.3 試驗(yàn)現(xiàn)象觀察及數(shù)據(jù)處理根據(jù)OECD 標(biāo)準(zhǔn)[14]分別于暴露24、48、72、96 h，使用體視顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)指標(biāo)（死亡率、自主運(yùn)動(dòng)、孵化率及體長(zhǎng)等）。

1.5 斑馬魚(yú)胚胎黑色素含量分析通過(guò)image-J軟件對(duì)斑馬魚(yú)胚胎黑色素顏色區(qū)域進(jìn)行提取，得到黑色素整體面積。將圖片進(jìn)行Color Inspector 3D 軟件分析得到RGB 三維顏色分析圖片，通過(guò)直觀圖片中黑色區(qū)域來(lái)表現(xiàn)黑色素的變化。

1.6 基因的表達(dá)分析使用Trizol 試劑提取斑馬魚(yú)胚胎染毒24 h 后各濃度的總RNA，包括溶劑對(duì)照SC 和空白對(duì)照CK。采用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，并使用Roche 公司的Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)的基因和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列見(jiàn) 表1。將各濃度反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 分別稀釋到同一濃度后，使用SYBR Green I Master（Roche diagnostics A/S）試劑盒方法在LightCycler96 R（Roche diagnostics A/S）儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，循環(huán)1 次，然后95℃進(jìn)行15 min，在60℃下退火20 min，以及72℃下延伸20 min，40 個(gè)循環(huán)。RT-qPCR 結(jié)果數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt方法，每個(gè)基因進(jìn)行3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析使用體視顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)指標(biāo)（死亡率、自主運(yùn)動(dòng)、孵化率及體長(zhǎng)等）。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS Statisitics 22.0 軟件分析計(jì)算LC50。并采用Dunnett’s 方法對(duì)每個(gè)濃度處理的結(jié)果和空白對(duì)照的結(jié)果進(jìn)行比較，差異不顯著用P＞0.05 表示，差異顯著性用P＜0.05 和P＜0.01 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水中四氯蟲(chóng)酰胺的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合方程為y=5.07e+0.05x(R2=0.999 1)；四氯蟲(chóng)酰胺的加標(biāo)濃度0.01，0.02 和0.05 μg·mL-1對(duì)應(yīng)的平均回收率分別為97.98%，101.60%和103.92%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在4.3%～6.0%，說(shuō)明該方法有較好的回收率。

按照上述儀器條件和樣品前處理方法，以甲醇為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)水中四氯蟲(chóng)酰胺的濃度進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)24、48、72 、96 h 中各樣品分別在甲醇和水中的濃度（表2），四氯蟲(chóng)酰胺在水中96 h 的最高降解率為7.6%，濃度大于80%。因此，四氯蟲(chóng)酰胺在水中96 h 穩(wěn)定性良好，滿(mǎn)足OECD 標(biāo)準(zhǔn)中靜態(tài)染毒法的要求。

表2 四氯蟲(chóng)酰胺的檢測(cè)濃度

2.2 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性斑馬魚(yú)胚胎暴露在四氯蟲(chóng)酰胺24 h 和48 h 的LC50均為112.88 mg·L-1， 72 h 的LC50為30.421 mg·L-1，95%置信區(qū)間（CI）為27.652～34.480 mg·L-1；96 h的LC50為23.775 mg·L-1，95%置信區(qū)間（CI）為22.066～25.582 mg·L-1（表3）。

表3 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)胚胎急性毒性

2.3 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響

2.3.1 自主運(yùn)動(dòng)頻率增加試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。處理后24 h，隨著四氯蟲(chóng)酰胺濃度的增加斑馬魚(yú)胚胎每分鐘自主運(yùn)動(dòng)頻率加快(圖1)，當(dāng)四氯蟲(chóng)酰胺暴露濃度高于27.65 mg·L-1時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎自主運(yùn)動(dòng)頻率與對(duì)照相比差異即達(dá)顯著水平（P＜0.01），其中自主運(yùn)動(dòng)對(duì)照組為0.25 次·min-1，暴露濃度為39.8 mg·L-1時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎自主運(yùn)動(dòng)頻率達(dá)到5.5次·min-1，為對(duì)照自主運(yùn)動(dòng)頻率的22 倍。

圖1 四氯蟲(chóng)酰胺暴露24 h 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎自主運(yùn)動(dòng)頻率的影響

2.3.2 孵化率降低暴露時(shí)間72 h 和96 h 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率有明顯的抑制作用。暴露96 h 斑馬魚(yú)胚胎的孵化率也受到明顯抑制，其中，暴露于四氯蟲(chóng)酰胺濃度在19.02 mg·L-1以上，與對(duì)照相比，暴露濃度在19.02 mg·L-1時(shí)的孵化率下降了15%，暴露濃度在27.65 mg·L-1時(shí)斑馬魚(yú)胚胎孵化率下降75%以上（圖2） 。用16.00 mg·L-1四氯蟲(chóng)酰胺溶液暴露斑馬魚(yú)胚胎，四氯蟲(chóng)酰胺暴露96 h 顯著抑制斑馬魚(yú)胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育，斑馬魚(yú)胚胎的體長(zhǎng)隨著四氯蟲(chóng)酰胺濃度的增加而降低（圖3）。當(dāng)四氯蟲(chóng)酰胺暴露濃度高于16.00 mg·L-1時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎的體長(zhǎng)與對(duì)照相比差異即達(dá)顯著水平（P＜0.01），其中體長(zhǎng)對(duì)照組為2.755 mm，暴露濃度為39.8 mg·L-1時(shí)，斑馬魚(yú)體長(zhǎng)為0.677 mm，較對(duì)照減少了32.27%。

圖2 四氯蟲(chóng)酰胺不同暴露時(shí)長(zhǎng)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響

圖3 暴露96 h 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體長(zhǎng)的影響

2.4 四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)黑色素生成的影響四氯蟲(chóng)酰胺暴露24、48 、72 、96 h 的斑馬魚(yú)胚胎與空白對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的色素沉著產(chǎn)生影響（圖4），隨著四氯蟲(chóng)酰胺處理濃度的增加斑馬魚(yú)黑色素區(qū)域顯著減少。通過(guò)Image-J 使用RGB 三維色素模型分析結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，黑色素區(qū)域的密度隨著暴露濃度的增加而顯著降低（圖5）。四氯蟲(chóng)酰胺暴露24 h 通過(guò)計(jì)算黑色素面積發(fā)現(xiàn)隨著四氯蟲(chóng)酰胺濃度的增加，斑馬魚(yú)黑色素面積明顯減少，最高四氯蟲(chóng)酰胺暴露濃度39.8 mg·L-1與空白相比黑色素面積減少了80%（圖6）。四氯蟲(chóng)酰胺暴露48 h 和72 h 隨著四氯蟲(chóng)酰胺濃度的增加，斑馬魚(yú)胚胎黑色素面積顯著減少，并且和暴露濃度之間有著良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。暴露濃度33.18 mg·L-1與空白相比黑色素面積減少了60%。四氯蟲(chóng)酰胺暴露96 h 斑馬魚(yú)胚胎黑色素面積隨著四氯蟲(chóng)酰胺暴露濃度的增加明顯減少，最高暴露濃度39.8 mg·L-1與空白相比黑色素面積減少了65%。

圖4 斑馬魚(yú)胚胎黑色素形態(tài)觀察

圖5 斑馬魚(yú)胚胎黑色素RGB 三維色素模型

圖6 四氯蟲(chóng)酰胺不同暴露時(shí)長(zhǎng)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎黑色素面積的影響

2.5 四氯蟲(chóng)酰胺暴露對(duì)斑馬魚(yú)黑色素相關(guān)基因表達(dá)的影響對(duì)RT-qPCR 結(jié)果分析表明，在急性濃度暴露下四氯蟲(chóng)酰胺會(huì)影響斑馬魚(yú)黑色素合成相關(guān)基因的變化，分別使用β-actin和GAPDH兩個(gè)內(nèi)參基因?qū)Π唏R魚(yú)黑色素合成相關(guān)基因進(jìn)行分析（圖7、圖8），發(fā)現(xiàn)2 個(gè)內(nèi)參基因趨勢(shì)一致。

圖7 四氯蟲(chóng)酰胺暴露24 h 下斑馬魚(yú)胚胎黑色素合成相關(guān)基因的差異分析

圖8 四氯蟲(chóng)酰胺暴露24 h 下斑馬魚(yú)胚胎黑色素合成相關(guān)基因的差異分析

2.5.1 以β-actin為內(nèi)參基因的結(jié)果以β-actin內(nèi)參基因進(jìn)行結(jié)果分析，圖7-a 中Tyr，Sox10，Trp-1a，Mitfa基因在處理濃度23.04 mg·L-1以上的表達(dá)量隨著濃度的增加先上調(diào)后下調(diào)，相比對(duì)照CK 最高處理濃度的基因表達(dá)量分別是對(duì)照的0.15 倍、0.43 倍、0.96 倍和1.30 倍；圖8-a 表明四氯蟲(chóng)酰胺暴露24 h 誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎黑色素合成通路中Tyr，Sox10，Trp-1a，Mitfa，Dicer，Trp-1b等基因表達(dá)量變化趨勢(shì)，其中Sox10基因與Mitfa基因變化幅度較大，且趨勢(shì)相對(duì)較一致，均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，Trp-1a次之，說(shuō)明這3 個(gè)基因在四氯蟲(chóng)酰胺誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎黑色素合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用（圖7-a、圖8-a）。

2.5.2 以GAPDH為內(nèi)參基因的結(jié)果以GAPDH內(nèi)參進(jìn)行結(jié)果分析，圖7-b 中，Sox10，Tyr，Trp-1a，Mitfa基因在處理濃度27.65 mg·L-1以上的表達(dá)量隨著濃度的增加呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的現(xiàn)象，相比對(duì)照CK 最高處理濃度的基因表達(dá)量分別是對(duì)照的0.60 倍、0.14 倍、1.34 倍和1.82 倍。圖8-b表明 四氯蟲(chóng)酰胺暴露24 h 誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎黑色素合成通路中Tyr，Sox10，Trp-1a，Mitfa，Dicer，Trp-1b等基因表達(dá)量變化趨勢(shì)，其中Sox10、Mitfa基因變化幅度較大，Trp-1a次之,說(shuō)明這3 個(gè)基因在四氯蟲(chóng)酰胺誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎黑色素合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用（圖7-b、圖8-b）。

3 討 論

斑馬魚(yú)為評(píng)價(jià)除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑等農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響提供了有前景的生物平臺(tái)。有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑殺螟松暴露72 h 對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性平均 LC50為0.341 mg·L-1，并誘導(dǎo)卵黃囊腫等軀體畸形[15]。殺菌劑三氯生暴露96 h 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎急性毒性平均LC50為0.42 mg·L-1，顯著延遲孵化[16]；有機(jī)磷農(nóng)藥久效磷 (MCP) 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有中等毒性，暴露96 h 的LC50為（37.44 ± 3.32）mg·L-1[17]；除草劑2,4-D 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的急性毒性暴露96 h的LC50為15.010 mg·L-1，表明毒性為低毒[18]。乙基多殺菌素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的毒性為低毒并具有致畸作用，暴露96 h 的LC50為9.713 mg·L-1[19]，黃偉康[20]研究了溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的急性毒性，暴露96 h 的LC50為1.57 mg·L-1，屬于中毒范圍。四氯蟲(chóng)酰胺是我國(guó)自主研發(fā)的具有低毒、高效等特點(diǎn)的殺蟲(chóng)劑，本研究按照OECD 的準(zhǔn)則開(kāi)展了四氯蟲(chóng)酰胺原藥對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的急性毒性試驗(yàn)，暴露96 h 的LC50為23.775 mg·L-1，結(jié)果表明為低毒，這與張琦[9]報(bào)道的10%四氯蟲(chóng)酰胺懸浮劑對(duì)水生生物鯉魚(yú)的結(jié)果相似。本試驗(yàn)結(jié)果表明與對(duì)照相比，隨著四氯蟲(chóng)酰胺濃度的升高斑馬魚(yú)胚胎在暴露96 h 下的孵化率降低、自主運(yùn)動(dòng)頻率增加以及體長(zhǎng)降低，并且較高濃度四氯蟲(chóng)酰胺顯著地減少斑馬魚(yú)黑色素的面積。新型吡啶基惡唑甲酰胺可以引起斑馬魚(yú)胚胎的黑色素細(xì)胞缺失現(xiàn)象[21]，說(shuō)明化學(xué)物質(zhì)在水體中會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)黑色素細(xì)胞的生成產(chǎn)生影響，本研究結(jié)果表明四氯蟲(chóng)酰胺對(duì)斑馬魚(yú)胚胎黑色素的合成有顯著的抑制作用，這與前人的結(jié)果具有相似性。

與黑色素合成相關(guān)基因的報(bào)道中，Mitfa是在黑色素母細(xì)胞前體中表達(dá)的早期基因之一，Mitfa置于產(chǎn)生黑色素和最終分化黑色素細(xì)胞所必需的多個(gè)基因的上游，包括多巴色素互變異構(gòu)酶，酪氨酸酶，酪氨酸酶相關(guān)蛋白1，C-kit和Bcl2轉(zhuǎn)錄因子[22]。也有研究報(bào)道表明，Mitf作為主導(dǎo)作用的天然木質(zhì)素通過(guò)下調(diào)Mitf和Tyr的表達(dá)，從而有效地抑制斑馬魚(yú)黑色素細(xì)胞的生成[23]；在新型污染物三氯卡班影響斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)黑色素生成的研究報(bào)道中，也指出Mitfa（小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）和Tyr（酪氨酸酶）的表達(dá)水平的變化是影響黑色素合成的關(guān)鍵因子[24],本研究中Mitf基因是四氯蟲(chóng)酰胺誘導(dǎo)斑馬魚(yú)黑色素減少變化最大的基因。另文獻(xiàn)[25]報(bào)道，在損害神經(jīng)嵴細(xì)胞分化的過(guò)程中Sox10和Mitfa轉(zhuǎn)錄所涉及的成熟miRNA 的生成來(lái)實(shí)現(xiàn)存在一致性。黑色素細(xì)胞由Sox10轉(zhuǎn)錄因子核心參與的神經(jīng)嵴細(xì)胞生成，Sox10通過(guò)Mitfa啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)黑色素細(xì)胞的命運(yùn)，存在調(diào)控關(guān)系[26]，且Mitf/mitfa作為黑色素分化多個(gè)關(guān)鍵基因的上游基因，決定黑色素細(xì)胞的命運(yùn)，導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的生成和發(fā)育受到影響。本研究結(jié)果顯示，Sox10基因與Mitfa基因變化幅度較大，且趨勢(shì)相對(duì)較一致，均呈現(xiàn)上調(diào)超勢(shì)。

黑色素生物取決于酪氨酸酶家族的3 種酶的功能，有研究表明酪氨酸酶 (Tyr)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1 (Tyrp1) 和多巴色素互變異構(gòu)酶 (Dct 或Tyrp2)等3 種酶的功能直接影響黑色素的生物合成，其中酪氨酸酶相關(guān)蛋白的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致黑色素細(xì)胞死亡[27]，有文獻(xiàn)報(bào)道殺菌劑惡霉靈通過(guò)抑制酪氨酸酶活性降低了斑馬魚(yú)胚胎黑色素密度[28]，本研究中酪氨酸酶相關(guān)基因Trp-1a也是變化較大的3 個(gè)基因之一。