醛糖還原酶和晚期糖化終產(chǎn)物受體對糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平的影響

王雅清 李紅敏 張茜玉 王莉 王勇 劉永勝 龐英杰

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常見和最嚴重的并發(fā)癥之一,是老年人視力受損的主要原因[1]。有證據(jù)表明,抑制神經(jīng)細胞凋亡可能是預防DR病理變化的一種治療策略[2]。體內(nèi)細胞存活平衡取決于細胞蛋白質(zhì)和細胞器的合成和降解。如果自噬失敗,這可能導致有害的受損細胞器和蛋白質(zhì)聚集體的積累[3]。自噬受一系列壓力和刺激的調(diào)節(jié),如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基應激、缺氧、細胞毒性和感染。根據(jù)刺激,細胞通過特定元素的自噬降解或與其他途徑的相互作用來實現(xiàn)多種功能,從而導致細胞凋亡[4]。因此,細胞死亡和存活取決于自噬控制。自噬途徑在防止衰老和某些癌癥、感染、神經(jīng)退行性疾病以及代謝、炎癥和肌肉疾病方面起著關鍵作用[5]。高血糖是神經(jīng)退行性疾病發(fā)展的關鍵因素,醛糖還原酶(aldose reductase,AR)表達水平升高與DR發(fā)病機制有關[6]。此外,由于AR在高血糖患者葡萄糖代謝中的活性增強,活性氧和山梨糖醇的產(chǎn)生增加,表明AR在神經(jīng)退行性疾病的進展中發(fā)揮了作用[7]。晚期糖化終產(chǎn)物受體(advanced glycation end product receptor,RAGE)免疫球蛋白家族跨膜蛋白是細胞外糖基化終產(chǎn)物AGE 以及其他類別的蛋白質(zhì)和分子的主要受體[8]。RAGE的最佳特征配體是CML蛋白加合物,其在高血糖和其他壓力條件下升高。RAGE是第一個發(fā)現(xiàn)的也是迄今為止研究最多的 AGE受體[9]。臨床證據(jù)表明,高RAGE水平可能會促使視網(wǎng)膜毛細血管的增殖變化,使其發(fā)生更嚴重的DR[10]。本研究在1型鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中探討AR和RAGE對DR神經(jīng)細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗小鼠:使用C57BL/6J 小鼠(Jackson Laboratories,Sacramento,CA,USA)購自河北省實驗動物中心,合格證號:SCXK(冀)2022-001。將其飼養(yǎng)在 12 h光照/黑暗循環(huán)中,光照水平<60勒克斯。飼養(yǎng)期間小鼠可隨意獲取食物和水。動物研究符合 ARVO 關于在眼科和視覺研究中使用動物的聲明。該研究方案得到了當?shù)貏游镅芯總惱砦瘑T會的批準。

1.1.2 糖尿病小鼠模型:通過連續(xù)5 d腹膜內(nèi)注射鏈脲佐菌素(55 mg/kg BW),在2個月大的禁食雄性小鼠中誘發(fā)胰島素缺乏型糖尿病。根據(jù)需要給予胰島素以維持 BW并允許 BW 緩慢增加,同時允許高血糖、多尿和食欲亢進(每2～3天0～0.2 U)。每 2～3個月通過測量總糖化血紅蛋白水平和測量血糖濃度。血糖值超過 300 mg/dl 的小鼠被認為患有糖尿病。

1.1.3 實驗分組:對照組(標準條件飼養(yǎng)的小鼠,注射0.9%的氯化鈉溶液作為對照,n=15),模型組(如前所述,通過腹腔注射鏈脲佐菌素誘導小鼠發(fā)生糖尿病,n=15),觀察組(糖尿病小鼠誘導成功后,飲食中加入依帕司他原藥按50 mg/kg,FPS-ZM 5 mg/d喂養(yǎng),依帕司他和FPS-ZM分別為AR和RAGE的抑制劑,用藥持續(xù)1周,n=15)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)印跡分析:從安樂死的小鼠中快速解剖視網(wǎng)膜組織并在含有蛋白酶抑制劑(Beyotime)和磷酸酶抑制劑的 RIPA 緩沖液(Beyotime,上海,中國)中裂解。裂解液于 4℃ 12 000 r/min 離心 10 min,收集上清液。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)(20 μg)并印跡到聚偏二氟乙烯膜(Millipore,USA)上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,膜與以下一抗4℃孵育過夜:RAGE、AR。在 Tris 緩沖鹽水和 Tween-20(TBST)中洗滌后,將免疫印跡與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶10 000,Cell Signaling Technology)在室溫下孵育 1 h,使用化學發(fā)光試劑使用化學發(fā)光試劑顯色印跡。增強化學發(fā)光(ECL)試劑盒(Millipore)。

1.2.2 RT-PCR:為了分析 mRNA 表達,從小鼠視網(wǎng)膜組織中提取總RNA,定量并使用 1μg 總 RNA 合成第一鏈 cDNA。使用 StepOnePlusTM實時 PCR 系統(tǒng)進行實時(RT)-PCR。PCR 擴增使用 SYBR Green PCR Master Mix 進行三次重復。使用以下循環(huán)優(yōu)化每個基因的反應條件:初始循環(huán)設置為 95°C 7min;在 95°C15秒和 60°C 1min下進行 30 個循環(huán);在 95°C1min、55°C30秒和 95°C30秒下進行1個循環(huán)以獲得解離曲線。不含模板 cDNA 的反應混合物用作陰性對照。使用GAPDH的 Ct 值作為內(nèi)源對照,通過比較 Ct 方法(ΔΔCT)確定基因表達水平。

1.2.3 視網(wǎng)膜電圖(ERG):在患糖尿病后,對各實驗組小鼠進行暗視和明視 ERG 測試。對于暗視 ERG 記錄,向小鼠呈現(xiàn)強度增加的單次閃光(2.19 × 10-4至 83.7 cd·s-1·m-2,0.6 log 單位步長),每次重復5次,刺激間隔為 20 s最亮的閃光為 1 min。平均每個閃光亮度下的5個 ERG 軌跡。從背景開始≥15 min后,通過將測試閃光(0.016～377 cd·s-1·m-2)疊加在桿飽和強度(30 cd/m2)的穩(wěn)定背景上,獲得孤立的錐體成分。

1.2.4 視網(wǎng)膜組織中的免疫熒光:將眼球摘除并用 4% 多聚甲醛固定,在磷酸鹽緩沖液中的 30% 蔗糖中冷凍保護,在包埋培養(yǎng)基中冷凍。10 μm 視網(wǎng)膜切片用 BSA 封閉,并與抗Caspase-8和抗Caspase-3 一起孵育,在 4℃下過夜,與適當?shù)亩挂黄鸱跤?。通過省略一抗建立陰性對照。將切片與適當?shù)亩挂黄鸱跤?。將切片沖洗并用含有用于細胞核染色的 4’,6’-二氨基-2-苯基吲哚的抗褪色培養(yǎng)基蓋玻片。在熒光顯微鏡下檢查載玻片,使用合適的熒光素異硫氰酸酯 1 和羅丹明發(fā)射濾光片。來自每只動物的3個非連續(xù)視網(wǎng)膜切片(相距 100 μm)和每組4只動物的3張圖像被納入分析。

1.2.5 TUNEL 檢測:通過TUNEL測定檢查細胞凋亡計數(shù)視網(wǎng)膜的 TUNEL 陽性細胞核 GCL。簡而言之,在室溫下用冰-丙酮溶液固定 8 min后,將冷凍保存的組織切片與 1 ml 封閉緩沖液(PBS 中的 3% 正常山羊血清)一起孵育 1 h。孵育后,將切片置于透化溶液(0.1% Triton X-100 的 0.1% 檸檬酸鈉溶液)中冰上 2 min。將切片在 50 μl TUNEL 反應混合物(Roche Diagnostics GmbH,德國)中孵育,并在 37℃下在黑暗中孵育 60 min。在反應后用 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對切片進行復染。在熒光顯微鏡(Olympus,Japan)下觀察切片。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗:使用相應的小鼠 TNF-α、IL-6、IL-1β DuoSet ELISA 開發(fā)試劑盒(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,USA)和小鼠 VEGF DuoSet 試劑盒(R&D Systems,Inc.)測定培養(yǎng)基中分泌的 TNF-α TNF-α、IL-6、IL-1β和 VEGF。使用 BioTek SynergyTM4 Hybrid Microplate Reader 檢測光密度,并通過平行生成的標準曲線外推的吸光度值推導出細胞因子水平。

2 結果

2.1 蛋白印跡分析AR和RAGE表達 模型組較對照組AR和RAGE的蛋白表達升高(P<0.05),觀察組較模型組AR和RAGE的蛋白表達降低(P<0.05),表明AR和RAGE促進了DR的發(fā)生,而藥物阻斷成功抑制體內(nèi)AR和RAGE的表達水平。見圖1,表1。

表1 蛋白印跡分析AR和RAGE表達

圖1 蛋白印跡分析AR和RAGE

2.2 AR和RAGE誘導自噬機制的啟動 通過PCR分析大鼠視網(wǎng)膜裂解組織中自噬相關蛋白Beclin-1、LC3 II/I 和 p62/SQTSM1的mRNA表達,模型組較對照組Beclin-1、LC3 II/I 和 p62/SQTSM1的mRNA表達升高(P<0.05),觀察組較模型組表達降低(P<0.05),實驗數(shù)據(jù)表明AR和RAGE參與了自噬通量功能障礙的形成。見表2。

表2 PCR分析自噬蛋白的轉(zhuǎn)錄

2.3 AR和RAGE參與DR的發(fā)生 模型組較對照組暗視b波和暗視a波的振幅降低(P<0.05),觀察組較模型組升高(P<0.05),實驗數(shù)據(jù)表明當AR和RAGE表達受阻降低了鏈脲佐菌素誘導的小鼠DR。見表3。

表3 ERG分析小鼠的視網(wǎng)膜受損程度 μV,

2.4 AR和RAGE加劇神經(jīng)細胞凋亡 通過免疫熒光分析大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達,模型組較對照組Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達升高(P<0.05),觀察組較模型組的蛋白表達降低(P<0.05),表明當降低AR和RAGE的表達,caspase 8、Caspase-3的活性和細胞凋亡就會得到改善,從而保護細胞免于死亡。TUNEL分析了小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的凋亡,與對照組相比,鏈脲佐菌素誘導的DR神經(jīng)細胞凋亡量增加(P<0.05),當AR和RAGE受到抑制后,陽性細胞數(shù)量降低(P<0.05)。見圖2,表4。

表4 免疫熒光分析Caspase-8和Caspase-3表達

觀察組 模型組 觀察組

2.5 ELISA試劑盒測定分泌的炎性因子和VEGF水平 通過ELISA分析血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β及VEGF的分泌水平,模型組較對照組TNF-α、IL-6、IL-1β及VEGF的水平升高(P<0.05),觀察組較模型組降低(P<0.05)。見表5。

表5 ELISA分析TNF-α、IL-6、IL-1β及VEGF水平 pg/ml,

2.6 PCR分析高爾基應激反應相關因子的表達 模型組較對照組DR4、TRAPPC13、MAPK和ETS的mRNA表達升高(P<0.05),觀察組較模型組表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),數(shù)據(jù)表明抑制AR和RAGE表達可以降低小鼠DR神經(jīng)細胞的高爾基應激反應。見表6。

表6 PCR分析高爾基應激反應相關因子的表達 pg/ml,

3 討論

DR被認為是一種微血管并發(fā)癥。最近的研究指出,神經(jīng)變性發(fā)生在血管病變發(fā)生之前,并有助于DR的發(fā)生和進展[11]。AR是多元醇途徑的第一個限速酶和醛酮還原酶超家族的成員,負責 NADPH 依賴性葡萄糖還原為山梨糖醇[12]。一般來說,葡萄糖主要通過糖酵解途徑代謝,因此多元醇途徑對葡萄糖代謝的影響很小,不被認為對非糖尿病患者構成威脅。然而,在高血糖時,多元醇途徑和AR刺激后有很大的增加[13]。依賴RAGE和AR的信號傳導是高血糖積累的致病原因,并且其本身對于正常發(fā)育和衰老在很大程度上是可有可無的。因此,RAGE 途徑的抑制構成了治療與AGE積累相關的疾病的有吸引力的目標。在生理上,幾種RAGE抑制劑是通過選擇性剪接產(chǎn)生的,以產(chǎn)生沒有細胞內(nèi)結構域的RAGE分子[14]。已經(jīng)產(chǎn)生了幾種RAGE抑制劑藥物,其中一些已進入臨床研究,包括 PF-04494700,目前正處于治療阿爾茨海默病患者癡呆癥的3期試驗中。PF-04494700 通過阻止許多配體與 RAGE結合而在細胞外發(fā)揮作用,并且能夠穿過血腦屏障[15]。另一種細胞外作用的RAGE抑制劑 FPS-ZM1 能夠阻斷由 Aβ42 和 BSA-AGE 介導的RAGE信號傳導。其他靶向RAGE細胞內(nèi)結構域的藥物正在開發(fā)過程中,該結構域與RAGE依賴性信號調(diào)節(jié)劑 DIAPH1 相互作用,盡管這些研究仍處于臨床前階段。

自噬是在正常和壓力條件下調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)的重要過程。多項研究表明,自噬的作用會隨著時間和損傷程度而變化,自噬早期可能通過抑制細胞凋亡而具有保護作用,而晚期或過度自噬會加重細胞損傷[16]。一項研究發(fā)現(xiàn)適當?shù)淖允傻恼T導可能對果蠅和帕金森病小鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[17]。我們的初步研究表明,暴露于高糖條件下的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的自噬水平升高,自噬的激活可能表現(xiàn)出細胞保護作用。多項研究表明,自噬功能障礙是DR發(fā)病機制中存在的早期事件[18]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠模型中,自噬相關蛋白 LC3-II 和 Beclin-1 的表達升高,而降低RAGE和AR的表達處理有效地抑制自噬和自噬相關蛋白的表達。盡管自噬在DR發(fā)病機制中的作用仍不確定,但現(xiàn)有的幾項研究表明,抑制高糖誘導的細胞和神經(jīng)元的自噬,同時激活自噬可產(chǎn)生保護作用?；诖?我們推測 DR中視網(wǎng)膜自噬的恢復可能會發(fā)揮保護作用。

這項研究檢查了由于鏈脲佐菌素誘導的糖尿病在小鼠視網(wǎng)膜中發(fā)生的電生理、和生化變化。除了已知的細胞凋亡過程外,自噬途徑可能與神經(jīng)元視網(wǎng)膜變性有關?？傮w而言,我們的結果表明,視網(wǎng)膜神經(jīng)特別容易受到糖尿病的影響,這可能是由于它們的高代謝需求。我們的結果顯示暗視a波和b波減少,這與其他作者先前報道的糖尿病小鼠模型數(shù)據(jù)一致。在體內(nèi)研究中,糖尿病小鼠表現(xiàn)出Beclin-1和p62/SQTSM1的明顯增加,并伴有視網(wǎng)膜組織中溶酶體功能的損害。這表明溶酶體損傷和自噬功能障礙是DR發(fā)病機制中存在的早期事件。正如其他小組先前所描述的那樣,視網(wǎng)膜繆勒氏細胞會對各種損傷做出反應,包括向視網(wǎng)膜組織大量釋放 VEGF。這種后來的現(xiàn)象可能導致血視網(wǎng)膜屏障的破壞,最初導致視網(wǎng)膜水腫,導致視網(wǎng)膜新生血管形成[19]。蛋白質(zhì) p62/SQTSM1 是一種功能性蛋白質(zhì),它在細胞的命運中起到關鍵作用。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)Caspase-8和Caspase-3參與高血糖條件下誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的凋亡。p62/SQTSM1 和Caspase-8和Caspase-3途徑之間的相互作用表明 p62/SQTSM1 決定了糖尿病條件下的神經(jīng)細胞的死亡。我們的研究結果表明,在高糖條件下,自噬機制被觸發(fā),但自噬通量受到損害。由于其溶酶體儲存性質(zhì),自噬底物(p62/SQTSM1)在細胞質(zhì)中積累,發(fā)出細胞凋亡和大量 VEGF 產(chǎn)生的信號。當RAGE和AR降低表達恢復溶酶體活性,改善自噬并減輕視網(wǎng)膜細胞凋亡和VEGF產(chǎn)生。VEGF誘導的新血管形成是DR的另一個主要原因,其涉及不穩(wěn)定的視網(wǎng)膜毛細血管的異常增殖。血漿內(nèi)容物毛細血管滲漏到視網(wǎng)膜會導致視網(wǎng)膜水腫和視力障礙。研究表明,RAGE和AR抑制是減少DR中視網(wǎng)膜炎癥和 VEGF 分泌的有吸引力的治療靶點。TNF-α是DR中最主要的促炎細胞因子之一,參與白細胞活化和細胞凋亡,主要由活化的內(nèi)皮細胞和炎癥細胞產(chǎn)生。與我們的研究結果表明,先前的研究表明,糖尿病視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-6、IL-1β 的表達增加,并有助于 DR 的進展。表明RAGE和AR抑制能抑制炎癥介質(zhì)的釋放和減少細胞凋亡因子的表達來改善視網(wǎng)膜損傷。

類似于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,高爾基體應激也可以誘導細胞死亡。ARF4 是一種小 G 蛋白,調(diào)節(jié)來自高爾基體的囊泡運輸。使用布雷菲爾德菌素A處理后,ARF4 mRNA 水平增加,表明 ARF4 是CREB3 途徑的靶基因。CREB3 通路的其他靶基因包括DR4和TRAPPC13[20]。DR4 編碼一種死亡受體,調(diào)節(jié)高爾基體應激誘導的細胞死亡,而TRAPPC13是TRAPPIII 復合物的組分,在某些應激條件下調(diào)節(jié)自噬通量。他們將 CREB3 鑒定為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的傳感器轉(zhuǎn)錄因子,它屬于 ATF6 蛋白家族。ATF6 是眾所周知的傳感器轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的 ATF6 通路,其中靶基因包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶。在沒有高爾基體應激的情況下,CREB3 保留在ER膜中,而CREB3 在高爾基體應激時被轉(zhuǎn)運到高爾基體并被蛋白酶S1P和S2P裂解,導致 CREB3 的胞質(zhì)區(qū)域從高爾基體膜及其易位到細胞核。除了 CREB3 通路之外, MAPK-ETS 通路也誘導細胞死亡以應對高爾基體應激,通過檢查在高爾基體脅迫誘導劑處理后轉(zhuǎn)錄增加的靶基因的啟動子區(qū)域,并通過轉(zhuǎn)錄因子結合基序富集分析尋找可以與啟動子結合的轉(zhuǎn)錄因子,從而得到 鑒定來自 ETS 家族的三種轉(zhuǎn)錄因子(ELK1、ETS1 和 GABPA/B)。該項研究還發(fā)現(xiàn)MEK1/2 和ERK1/2 等MAPK被 BFA、Golgicide A 和莫能菌素處理激活,并提出高爾基體應激通過激活 MAPK 級聯(lián)反應激活 ETS轉(zhuǎn)錄因子,導致細胞死亡。[20]

綜上所述,我們研究表明,AR表達水平與DR發(fā)病機制相關,RAGE的最佳特征配體是CML蛋白加合物,其在高血糖和其他壓力條件下升高。1型鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中AR和RAGE對DR神經(jīng)細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平有影響。抑制RAGE和AR可預防鏈脲佐菌素誘導的小鼠的DR,降低RAGE和AR體內(nèi)的表達可顯著改善小鼠的視力情況,并且可以抑制視網(wǎng)膜病變神經(jīng)細胞凋亡、自噬和高爾基應激水平的發(fā)生。