河流原位自生古菌對四醚脂類古溫度代用指標的影響

鄭平波，張虎才，孫惠玲**

(1.云南師范大學(xué) 地理學(xué)部，云南省高原地理過程與環(huán)境變化重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，高原湖泊生態(tài)與污染治理研究院，云南 昆明 650500)

古菌膜脂類化合物（isoprenoid GDGTs，isoGDGTs）廣布于海洋和陸地環(huán)境，其碳鏈具有獨特的類異戊烯烴結(jié)構(gòu)，且與甘油分子以醚鍵形式相連，常被認為來源于氨氧化奇古菌膜脂[1-2].IsoGDGTs 包含多種化合物，主要是依次含有0～3個五元環(huán)的GDGT-0、GDGT-1、GDGT-2、GDGT-3，及具有4 個五元環(huán)和1 個六元環(huán)的泉古菌醇（Crenarchaeol，Cren）及其異構(gòu)體（Crenarchael′，Cren′）.對海洋、陸地、湖泊和河流等環(huán)境中isoGDGTs 數(shù)十年的研究表明，古菌膜脂類化合物采取合成更多的五元環(huán)的策略來適應(yīng)更高的環(huán)境溫度，進而維持細胞膜內(nèi)外環(huán)境之間穩(wěn)定的質(zhì)子滲透梯度[3].由于奇古菌合成的isoGDGTs 結(jié)構(gòu)與溫度的這種關(guān)聯(lián)特征，代表GDGTs-1～3 和Cren′相對豐度變化的四醚指數(shù)（TEX86）可以良好反映表層海水溫度（SST）變化[4].隨后，古溫度TEX86指標逐漸由海洋沉積物的應(yīng)用拓展到陸相湖泊沉積物[5-6]、黃土[7]、石筍[8-9]等地質(zhì)載體中.目前，TEX86指數(shù)已成為海陸古溫度定量重建的常用指標[10-15].

學(xué)者們注意到，TEX86指標在海洋和湖泊環(huán)境中廣泛應(yīng)用的同時，不同古菌來源的isoGDGTs 彼此組分的分布特征差異顯著，進而會影響TEX86信號的解譯.例如，土壤通常以Group I.1b 奇古菌來源的古菌類群為主，水環(huán)境中以Group I.1a 奇古菌來源的古菌類群為主.當(dāng)湖泊環(huán)境中的土壤Group I.1b 類群貢獻的Cren′比例遠高于水生Group I.1a類群的Cren′輸入時，較多土壤來源的isoGDGTs會導(dǎo)致湖泊沉積物中的TEX86信號出現(xiàn)偏差[11,16-17].此外，厭氧的水體環(huán)境中的產(chǎn)甲烷古菌貢獻的isoGDGTs 比例增加時，不僅會產(chǎn)生豐度較高的GDGT-0 組分，也會干擾TEX86的信號[18-19]，導(dǎo)致TEX86重建的溫度異常.河流是內(nèi)陸環(huán)境中地表徑流的重要環(huán)節(jié)，是陸相土壤生成的isoGDGTs 輸入海洋或湖泊環(huán)境的重要載體.在獨立的河流環(huán)境中，其原位自生的isoGDGTs 屬性特征是什么？是否會影響湖泊環(huán)境中isoGDGTs 衍生的TEX86指標的溫度重建？目前相關(guān)的研究工作多集中在邊緣海附近的河口[20-24]環(huán)境中，內(nèi)陸湖泊[11,25-26]環(huán)境的相關(guān)研究常常忽視了河流這一中間介質(zhì)在土壤-河流-湖泊體系中原位自生古菌的作用及影響[27].本研究檢測了撫仙湖流域表層土壤、河流表層沉積物與撫仙湖表層水體懸浮顆粒物（SPM）的isoGDGTs 相對分布特征，旨在探究TEX86在不同載體中的信號特征，檢驗TEX86衍生溫度是否會受到河流相原位自生古菌的影響.

1 研究區(qū)域和研究方法

1.1 研究區(qū)域概況撫仙湖（24°21′～24°38′N，102°49′～102°57′E）地處亞熱帶高原半濕潤季風(fēng)氣候區(qū)的云南省中部[圖1(b)]，屬于高原貧營養(yǎng)型深水湖泊（海拔1 721 m，湖泊表面積211 km2，平均水深89.6 m）.撫仙湖由地質(zhì)構(gòu)造斷裂形成[28].撫仙湖出湖河流僅為海口河，尖山大河、梁王河、東大河、路局河、牛魔大河和青魚灣等為穩(wěn)定的入湖河流.此外，由于長期人類活動，流域植被覆蓋率僅為27%，水土流失較嚴重[29].

圖1 撫仙湖流域2016 年4 月至2017 年3 月氣溫、降水逐月變化及采樣點地理位置Fig.1 The monthly temperature and precipitation variations during the year cycle from April 2016 to March 2017 of lake basin and the sampling site of Lake Fuxian

撫仙湖流域多年平均氣溫15.6 ℃，平均降水量為879.1 mm[30].本研究采樣期間（2016 年4 月至2017 年3 月）年均溫和降水量分別約為17.0 ℃和980 mm，月均溫在春季（3—5 月）至夏季（6—8 月）處于升高階段，由14.9 ℃升高至21.3 ℃；秋季（9—11 月）至冬季（12 月—次年2 月）氣溫由19.6 ℃降至12.3 ℃[圖1(a)].流域降水以夏秋季（雨季）為主，占全年降水量的81%[圖1(a)].氣象數(shù)據(jù)獲取自國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心（http://data.cma.cn/data/weatherBk.html）.

1.2 樣品采集2016 年7 月在撫仙湖流域分別采集了19 個表層土壤樣品（0～0.5 cm）、6 個入湖河流（東大河，尖山大河，路居河，梁王河，牛魔河和青魚灣）的表層沉積物樣品（0～0.5 cm）和9 個湖泊表層水樣[圖1（b）].表層水樣使用20 L Niskin 瓶采集，并現(xiàn)場用預(yù)先灼燒過的Whatman 玻璃微纖維濾紙GF/C（100 目，孔徑47 mm）過濾水樣獲得SPM樣品，并冷凍干燥后低溫保存.

1.3 脂類提取、檢測及計算GDGTs 的提取檢測在中國地質(zhì)大學(xué)武漢的生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點實驗室完成.具體方法如下：流域表土、河流沉積物樣品均冷凍干燥后研磨成粉末；水柱SPM濾紙剪碎放銅片，置于以下有機溶劑中抽提.隨后用二氯甲烷（DCM）-甲醇[V(DCM)∶V（甲醇）=9∶1]溶液分別對上述樣品進行超聲抽提，同時在分液漏斗中用DCM 溶液萃取過濾的溶液，萃取完成后合并萃取液.萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1～2 mL，并通過0.45 μm 疏水性聚四氟乙烯（PTFE）濾膜后，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）進行檢測[31].

樣品溶解在300 μLV（正己烷）∶V（異丙醇）=9∶1 的混合溶液中，在樣品中加入10 μL 的C46GTGTs 內(nèi)標[32]（質(zhì)量濃度為1.157 μg/L）.隨后，用Agilent 1200 系列液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS/MS）的APCI 源對GDGTs 進行檢測，GDGTs化合物的檢測條件為：A 流動相為正己烷，B 流動相為V（正己烷）∶V（異丙醇）=9∶1 的混合液.使用的色譜柱為AlltectPrevail 氰基柱（規(guī)格150 mm×?2.1 mm，3 μm）.洗脫梯度分為2 個階段，0～5 min：90% A，10% B（體積分數(shù)）；5～45 min：A 比例從90%線性減至82%之后沖洗色譜柱并回到100%B，流速保持0.2 mL/min，柱溫箱恒溫40 ℃.接下來對化合物離子化，該過程在APCI 源中進行，具體要求為APCI/MS 條件為霧化器壓力413.69 kPa，霧化溫度400 ℃，干燥氣（N2）流速6 L/min，溫度200 ℃，毛細管電壓3 500 V.為提高檢測信噪比和重現(xiàn)性，采用單離子掃描模式（SIM）對質(zhì)子化離子[M+H]+進行掃描，掃描化合物質(zhì)核比（m/z）為1 302、1 300、1 298、1 296、1 292、1 292′和653.上述數(shù)字 分別對 應(yīng)GDGT-0、GDGT-1、GDGT-2、GDGT-3、Cren、Cren′和Archaeol的質(zhì)荷比.化合物在提取離子色譜（EIC）中對相應(yīng)的峰積分，獲取的積分峰面積用于后續(xù)計算不同類型樣品的 GDGTs化合物的含量，該含量通過在 LC-MS/MS 中檢測到的具體化合物的峰面積和內(nèi)標C46GTGTs 的峰面積的比值算得.在本文中，土壤和河流中的GDGTs 化合物的衍生代用指標和比值使用質(zhì)量比（ng·g-1）計算，湖泊 SPM 中的 GDGTs 化合物的衍生代用指標和化合物的比值使用質(zhì)量濃度（ng·mL-1）計算.

在本文中，土壤和河流中的GDGTs 化合物的衍生代用指標和比值使用質(zhì)量比(ng.g-1)計算，湖泊SPM 中的GDGT s 化合物的衍生代用指標和化合物的比值使用質(zhì)量濃度(ng·mL-1)計算.

依據(jù)式(1)計算得出土壤和河流中的化合物的相對豐度，

式中：X定義為isoGDGTs 中的某一個化合物；w(X)為這一化合物的質(zhì)量比；w(GDGT-0)、w(GDGT-1)、w(GDGT-2)、w(GDGT-3)、w(Cren)、w(Cren′)分別為isoGDGTs 各組分(GDGT-0、GDGT-1、GDGT-2、GDGT-3、Cren、Cren′)的質(zhì)量比.化合物isoGDGTs衍生的TEX86 指標的計算式如公式(2)[4]：

依據(jù)式(3)計算得出湖泊SPM 的化合物的相對豐度，

式中：X定義為isoGDGTs 中的某一個化合物；ρ(X)為這一化合物的質(zhì)量濃度；ρ(GDGT-0)、ρ(GDGT-1)、ρ(GDGT-2)、ρ(GDGT-3)、ρ(Cren)、ρ(Cren′)分別為isoGDGTs 各組分(GDGT-0、GDGT-1、GDGT-2、GDGT-3、Cren、Cren′)的質(zhì)量濃度.化合物isoGDGTs衍生的TEX86 指標的計算式如公式(4)[4]：

2 結(jié)果與討論

2.1 表層土壤、河流表層沉積物及湖泊SPM 中isoGDGTs 的主要生物源為了解isoGDGTs 在撫仙湖流域的分布異同，本研究對流域表層土壤、河流表層沉積物及湖泊表層水體SPM 中isoGDGTs的相對豐度（圖2）進行了對比.結(jié)果顯示，一方面，河流表層沉積物isoGDGTs 相對豐度與表土和SPM差異顯著，其中GDGT-0 相對豐度的均值（71.8%）遠高于表土和SPM，而Cren 相對豐度的均值（18.8%）遠低于表土和SPM.另一方面，表土與SPM 中isoGDGTs 的相對豐度分布模式相近，均以Cren（分別47.0%及51.2%）為主，其次為GDGT-0（分別為26.9%及28.6%），但表土Cren′（3.6%）相對豐度顯著高于湖泊（0.5%）.

圖2 表層土壤、河流表層沉積物和湖泊水柱 SPM 各isoGDGTs 化合物的相對豐度（誤差棒為標準誤差）Fig.2 The relative abundances of individual isoGDGTs in soils,river surface sediments and SPM of lake water(The error bars show the standard error)

前人研究表明，產(chǎn)甲烷古菌以GDGT-0 為主要的膜脂成分[11]，而奇古菌isoGDGTs 以Cren 為主要組分[3].因此，當(dāng)化合物GDGT-0 與Cren 的質(zhì)量比或質(zhì)量濃度比的比值（GDGT-0/Cren）大于2 時，樣品通常以厭氧產(chǎn)甲烷古菌貢獻的isoGDGTs 為主[11].河流表層沉積物的GDGT-0/Cren 值均大于2（圖3），均值為5.3，指示厭氧產(chǎn)甲烷古菌可能在河流古菌群落中占主導(dǎo).相反，表土和湖泊中的GDGT-0/Cren 均值分別為0.3 和0.7，表明兩者受厭氧產(chǎn)甲烷古菌活動的影響相對較弱.

圖3 對比GDGT-0/Cren 和Rc 在流域表土（紅色區(qū)域）、河流表層沉積物（藍色區(qū)域）和湖泊SPM（灰色區(qū)域）中的分布Fig.3 The comparison values distributions of GDGT-0/Cren and Rc indexes in the surface soils(red area),river surface sediments(blue area) and lake SPM(grey area)

奇古菌廣布于土壤和湖泊環(huán)境中，但土壤和湖泊一般分別由奇古菌中的Group I.1b[33-34]和Group I.1a 類群占主導(dǎo)[35].上述兩種古菌類型均以Cren為主要isoGDGTs 成分，不同的是，Group I.1b 類群的Cren′的相對豐度遠高于Group I.1a 類群[36-38].因此，化合物Cren 及其異構(gòu)體Cren′的質(zhì)量比或質(zhì)量濃度比的比值（Rc）在土壤和湖泊中通常分別小于25 和遠大于50[39-40].撫仙湖表土中Rc指標均值15.6，基本小于25（圖3），指示表土isoGDGTs 可能來源于奇古菌Group I.1b.在表層水SPM 中，Rc均值為72.0，指示其isoGDGTs 主要來自于Group I.1a 奇古菌（雨季9—10 月除外，后述）.河流表層沉積物Rc值分布（均值為21.4）與流域表土（均值15.6）相近，表明河流中同樣存在強烈的陸源土壤Group I.1b 奇古菌isoGDGTs 的信號.這與撫仙湖流域植被覆蓋度較低（27%）、土壤侵蝕較強[41-43]的事實相符.

綜上所述，在isoGDGTs 來源方面，流域表土可能主要來自于Group I.1b 奇古菌；河流表層沉積物中的isoGDGTs 部分來源于陸源Group I.1b 奇古菌，但以水體原位生產(chǎn)的厭氧產(chǎn)甲烷古菌的貢獻為主.湖泊表層水體SPM 中的isoGDGTs 主要來自Group I.1a 奇古菌的貢獻.

2.2 厭氧產(chǎn)甲烷古菌isoGDGTs 對河流表層沉積物溫度重建的影響作為承接了流域侵蝕土壤的河流表層沉積物，其TEX86值整體上顯著低于表土TEX86（圖4）.考慮到GDGT-0/Cren 指標指示河流表層沉積物中以厭氧產(chǎn)甲烷古菌為主要菌群，這種TEX86值顯著偏低的現(xiàn)象可能與河流中該類群古菌影響有關(guān).生物標志化合物Archaeol 廣泛存在于奇古菌和廣古菌膜脂中[44]，但廣古菌的Archaeol豐度高于奇古菌[45].尤其在鹽度變化不大[46]的厭氧環(huán)境，如飽水土壤[47]、泥炭中[48-50]，Archaeol 首要來源于厭氧產(chǎn)甲烷古菌，并被用于指示厭氧產(chǎn)甲烷古菌的生物量[47-48,50-51].因此，可通過Archaeol與isoGDGTs 各化合物的相關(guān)性分析判別厭氧河流[52]中產(chǎn)甲烷古菌對isoGDGTs 的影響，進而分析其對河流表層沉積物TEX86指標的影響[21,50,53].

圖4 流域表土、河流表層沉積物及湖泊表層SPM 載體中TEX86 值的對比Fig.4 The comparison of TEX86 values in surface soils,river surface sediments and lake SPM

結(jié)果顯示，河流表層沉積物中僅有GDGT-0（r=0.87，P＜0.01）和GDGT-1（r=0.99，P＜0.001）與Archaeol 顯著且正相關(guān)（圖5），表明他們具有高度的生物同源性，即，均主要來自厭氧產(chǎn)甲烷古菌.鑒于GDGT-1 組分與產(chǎn)甲烷古菌正相關(guān)（圖5）.可以推測高豐度的產(chǎn)甲烷古菌可能導(dǎo)致GDGT-1 相對豐度的增加，進而增大TEX86的分母值，使TEX86值降低.這種推測可以解釋河流表層沉積物中TEX86的值為何顯著低于流域表層土壤（圖4）.

圖5 河流表層沉積物Archaeol 與各isoGDGTs 質(zhì)量比（ng/g）之間的相關(guān)性Fig.5 The correlation between Archaeol and individual isoGDGT concentrations(ng/g) in river surface sediments

此外，相對于GDGT-1，GDGT-0 與Archaeol 相關(guān)性更弱（圖5），這可能指示了河流中存在其他的古菌對GDGT-0 組分的額外貢獻.GDGT-0 生物來源廣泛，除厭氧產(chǎn)甲烷古菌、奇古菌外，GDGT-0 還會由嗜甲烷古菌、深古菌等合成[44].然而，由于嗜甲烷古菌產(chǎn)生GDGTs-0～2 的比例大致相等[54-56]，而河流沉積物中高豐度的GDGT-0 及低豐度的GDGTs-1～2，表明嗜甲烷古菌在河流沉積物中isoGDGTs 的貢獻可能較為有限；而深古菌可能并不主要生成GDGT-0 以外的isoGDGTs 組分[25,50,55,57]，因而它對TEX86指標的潛在影響可以忽略.總之，這種TEX86值顯著偏低的結(jié)果可能主要與厭氧產(chǎn)甲烷古菌影響有關(guān).

事實上，近年對撫仙湖微生物群落結(jié)構(gòu)的宏基因調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)[58]，撫仙湖湖上層（富氧）的水柱剖面的產(chǎn)甲烷廣古菌以Methanonatronarchaeia 為主，該古菌類群可占古菌群落豐度29.87%（除奇古菌外），并且該古菌豐度隨深度增加顯著下降.該現(xiàn)象與Methanonatronarchaeia 的厭氧（anaerobic）生理特征相悖[59-62]，指示著該古菌在撫仙湖水體中是外源輸入.對Methanonatronarchaeia 的純培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)[61]，該古菌核心脂質(zhì)有高豐度的Archaeol，并且在isoGDGTs 中只檢測到GDGT-0 和GDGT-1 的存在.結(jié)合入湖河流的Archaeol 與GDGT-0、GDGT-1 豐度正相關(guān)（圖5），以及撫仙湖湖上層異常高豐度的Methanonatronarchaeia，可以推測本文在撫仙湖入湖河流中的產(chǎn)甲烷古菌信號可能主要來源于Methanonatronarchaeia，并且該古菌可能通過大量貢獻GDGT-1，導(dǎo)致了河流表層沉積物中的TEX86值偏低.

與撫仙湖流域河流表層沉積物的結(jié)果類似，一些土壤[49-50,63]的研究表明，當(dāng)樣品中存在明顯的厭氧產(chǎn)甲烷古菌影響時會伴隨著TEX86值的偏低.譬如，在東亞、東南亞及歐洲水稻土的研究中[63]，淹水期的稻田土壤的GDGT-0/Cren 升高至周邊土壤的3～27 倍，指示強烈的厭氧產(chǎn)甲烷古菌活動；相應(yīng)地，其TEX86均值普遍降至不足周邊土壤的一半，并且GDGT-1 的相對豐度變化是控制淹水期水稻土中四醚指數(shù)值變化的關(guān)鍵.仍需注意，可能由于海洋-河口古菌群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜變化[20,50]，入海河口與陸地厭氧產(chǎn)甲烷古菌對TEX86的影響并不完全一致.如，福建九龍江河口有較強厭氧產(chǎn)甲烷古菌活動[21]，但TEX86變化不顯著[23]；在厭氧產(chǎn)甲烷古菌活動強烈的珠江河口，TEX86值偏高[20,22].盡管如此，鑒于高豐度厭氧產(chǎn)甲烷古菌廣泛造成TEX86值出現(xiàn)偏差[6,44].因此，推測Archaeol 與GDGT-1 質(zhì)量比相關(guān)性變化可能也存在于其他陸地河口以及飽水厭氧土壤中，并指示著厭氧產(chǎn)甲烷古菌對TEX86的影響.

2.3 河流攜帶的isoGDGTs 在湖泊表層水SPM中的表現(xiàn)撫仙湖全年GDGT-0/Cren 小于閾值2，Rc值在一年中的大部分時期都大于閾值50，表明撫仙湖整體受河流輸入的isoGDGTs 的影響不大（圖6）.相較于土壤與河流中的TEX86值的分布，SPM 具有更低的TEX86值（圖4），可能指示了湖泊內(nèi)部來源的isoGDGTs 變化.不過，GDGT-0/Cren與Rc值在表層SPM 中呈現(xiàn)顯著的季節(jié)變化（圖6）.在降雨集中的8—10 月，GDGT-0/Cren 迅速升高至1.3，而Rc值快速降低至20 左右，表現(xiàn)出顯著反相位關(guān)系，說明河流自生來源的產(chǎn)甲烷古菌及土壤來源的Group I.1b 奇古菌的isoGDGTs 信號可能在雨季有一定程度的表達，這種現(xiàn)象也可見于其他研究中[23,27,64].不同的是，湖泊GDGT-0/Cren 值在雨季小于指示產(chǎn)甲烷古菌顯著影響的閾值2，而Rc值在9—10 月達到指示陸源Group I.1b 古菌影響的閾值25，表明相對于河流中厭氧產(chǎn)甲烷古菌的信號，陸源isoGDGTs 信號在湖泊中得到更好的表達.關(guān)于河流中主要攜帶的是產(chǎn)甲烷古菌信號，為何湖泊SPM 卻主要表達了陸源Group I.1b 奇古菌信號.一方面，可以推測湖泊SPM 中的Group I.1a 古菌以合成Cren 為主（圖2），從而削弱了GDGT-0/Cren 的信號；另一方面，Group I.1a 奇古菌合成的Cren′比例相對于土壤Group I.1b 合成的Cren′極低[35-36,40]，因而代表土壤Group I.1b 奇古菌信號的Rc值在雨季相對于GDGT-0/Cren 更容易得到表達.

圖6 湖泊表層水SPM 的GDGT-0/Cren 和Rc 指標值的逐月變化Fig.6 The monthly value variations of the GDGT-0/Cren and Rc indexes in SPM of lake surface water

3 結(jié)論

通過分析對比撫仙湖流域表層土壤、河流表層沉積物與撫仙湖表層水體懸浮顆粒物（SPM）的isoGDGTs 相對豐度異同，本研究得到了河流厭氧產(chǎn)甲烷古菌合成的isoGDGTs 如何影響TEX86指標的一些認識，可為TEX86指標更好地應(yīng)用于湖泊古溫度重建提供參考.

（1）撫仙湖流域表層土壤isoGDGTs 主要來源于Group I.1b 奇古菌；河流表層沉積物中isoGDGTs雖然受到一定程度的陸源土壤輸入的影響，但自生的厭氧產(chǎn)甲烷古菌為其主要生物源；湖泊表層水體SPM 中的isoGDGTs 以Group I.1a 奇古菌為主.

（2）河流表層沉積物中厭氧產(chǎn)甲烷古菌豐度（Archaeol）與GDGT-1 含量顯著正相關(guān)，表明其生物來源的同源性.即，河流厭氧產(chǎn)甲烷古菌（如Methanonatronarchaeia 類群）可以導(dǎo)致GDGT-1 相對豐度的增加，進而使TEX86值下降，最終導(dǎo)致河流表層沉積物TEX86值顯著低于表層土壤.

（3）在雨季，湖泊表層水SPM 一定程度表達了河流輸入的isoGDGTs 信號，其余大部分時間，撫仙湖中isoGDGTs 指示的是湖泊內(nèi)源古菌的信號.

（4）總之，本研究豐富了厭氧產(chǎn)甲烷古菌作用于TEX86古溫度代用指標的影響方式的認知，即，河流厭氧產(chǎn)甲烷古菌（如，Methanonatronarchaeia）可能導(dǎo)致湖相環(huán)境中GDGT-1 豐度的升高和TEX86值的下降.