異甘草酸鎂對山羊心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

王鐸 劉曉林 趙冀山 李曉瓊 王義華 甘甜 李猛

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種十分常見的心血管疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率總體呈上升態(tài)勢。而最及時有效的治療措施是改善心肌缺血，限制心肌梗死面積。臨床上常通過血管成形術(shù)或溶栓治療迅速恢復(fù)心肌血液供應(yīng)［1］。然而，這種突然的再灌注會導(dǎo)致繼發(fā)性級聯(lián)損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），這會惡化缺血性損傷并進(jìn)一步擴(kuò)大梗死面積［2］。研究顯示，MIRI可能引發(fā)多種病理變化，包括局部急性炎癥反應(yīng)、代謝紊亂和細(xì)胞凋亡和（或）壞死，最終導(dǎo)致心臟功能障礙［3］。MIRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個分子過程，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累［4］、鈣離子超載［5］、炎性細(xì)胞因子流入［6］以及細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（m i t oc h o n d r ia l permeability transition pore，mPTP）開放［7］。其中冠狀動脈微血管功能障礙（coronary microvascular dysfunction，CMD）又是MIRI中亟待解決的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［8-10］。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是從甘草植物的根莖部分離提純出來的三萜類化合物，具有廣泛的藥理活性和生物活性［11］。在各種疾病模型中，GA均顯示出抗氧化應(yīng)激和抗炎反應(yīng)的巨大潛力。既往研究發(fā)現(xiàn)GA預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)異丙腎上腺素對組織氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)作用，對心肌缺血具有保護(hù)作用［12］。此外，GA已被證明通過抑制高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)的Toll樣受體-4/核因子κB（Toll-like receptor 4，TLR4/nuclear factor kappa B，NF-κB）通路來保護(hù)腦的再灌注損傷［13］。目前對于GA改善MIRI的作用及其機(jī)制研究有限，特別是對CMD相關(guān)的MIRI研究更為有限。本研究選用GA的衍生物制劑——異甘草酸鎂作為研究對象，旨在對GA在MIRI中的作用進(jìn)行研究，并闡明可能的相關(guān)機(jī)制，驗證GA對山羊MIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物 雄性薩能奶山羊16只，5～8月齡，體質(zhì)量18.8～31.4 kg［西安臻品生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（陜）2020-003］。

1.1.2 實驗試劑 本研究中所使用的化學(xué)試劑和生化試劑均為分析級和最高純度。異甘草酸鎂注射液（批號：H20051942，江蘇南京正大天晴藥業(yè)）、B細(xì)胞淋巴因子2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）檢測試劑（批號：C20210814D）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bll-2 associated X protem，Bax）檢測試劑（批號：C20210814D）、半胱氨酸蛋白酶3（Casepase-3）檢測試劑（批號：C20210814D）、超氧化物歧化酶（superonide dismutase，SOD）檢測試劑（批號：C20210814D）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑（批號：C20210814D）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑（批號：C20210814D）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）檢測試劑（批號：C20210814D）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測試劑（批號：C20210814D）均由武漢純度生物科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組、準(zhǔn)備及麻醉 將16只山羊隨機(jī)分為4組（采用Excel軟件隨機(jī)生成相應(yīng)的數(shù)字），分別為對照組、栓塞組、異甘草酸鎂低劑量組、異甘草酸鎂高劑量組，每組4只。異甘草酸鎂組采用灌胃的方法，分別給予4 mg/kg（低劑量組）、10 mg/kg（高劑量組）異甘草酸鎂、每日1次，對照組及栓塞組予以等量0.9%生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。山羊術(shù)前禁食24 h、禁水8 h，備皮（耳朵/胸前區(qū)/四肢）后沿耳緣靜脈穿刺靜脈留置針，連接三通管。誘導(dǎo)麻醉：丙泊酚2.5～3.5 mg/kg；維持麻醉：丙泊酚22～30 mg/kg，并根據(jù)麻醉深淺程度及手術(shù)需要追加。術(shù)中注意觀察山羊呼吸情況，記錄12導(dǎo)聯(lián)心電圖并行心電監(jiān)護(hù)。

1.2.2 動物模型制備 誘導(dǎo)麻醉后捆綁四肢，取左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺。常規(guī)消毒鋪巾后采用Seldinger’s法于右側(cè)股動脈穿刺，穿刺成功后注入肝素100 U/kg，再置入Medtronic-6 F動脈鞘管，在透視下將6 F EBU 3.0指引導(dǎo)管送達(dá)山羊左冠狀動脈開口行冠狀動脈造影。對照組只做冠狀動脈左回旋支（left circumflex branch，LCX）造影，其余3組即MIRI微循環(huán)障礙模型組參照文獻(xiàn)［14］構(gòu)建，沿指引導(dǎo)管送入BMW導(dǎo)引導(dǎo)絲，并送達(dá)LCX血管遠(yuǎn)段，選擇與血管直徑相匹配的球囊順導(dǎo)引導(dǎo)絲進(jìn)入LCX近中1/3處，擴(kuò)張封堵30 min后，抽取2 ml充分混勻的混合液（20 μm微球原液1 ml，微球計數(shù)約5.8×106個，非離子對比劑碘海醇9 ml），借助于1.9 F微導(dǎo)管在LCX遠(yuǎn)段緩慢分批釋放，再抽取適量生理鹽水緩慢注入。術(shù)中出現(xiàn)心律失常時對癥處理。術(shù)畢按壓股動脈30 min后逐步麻醉蘇醒。

1.2.3 體表心電圖的變化 在整個實驗中，所有動物模型均記錄球囊閉塞前、閉塞30 min時及缺血再灌注2 h心電圖。心電圖ST段弓背向上抬高（2個或2個以上相鄰的導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高），胸前導(dǎo)聯(lián)≥0.2 mV，肢體導(dǎo)聯(lián)≥0.1 mV則提示心肌梗死，ST段回落≤30%判斷為心肌微循環(huán)出現(xiàn)灌注障礙，表明造模成功。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測 術(shù)后72 h清晨抽取靜脈血，以3000 r/min離心后，留取血清待測。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA水平，采用比色法測定GSH活性。炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)檢測：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定IL-10、IL-6，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀（HBS-1096C，南京德鐵實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)）在450 nm處測定吸光度（optical density，OD）值。使用試劑標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，將標(biāo)本的OD值代入回歸方程，計算出標(biāo)本樣品濃度，之后乘以稀釋倍數(shù)，得出標(biāo)本的實際濃度。凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測：Bax、Bcl-2、Casepase-3同樣采用ELISA方法測定。上述檢測過程均嚴(yán)格按照試劑盒的說明書執(zhí)行。

1.2.5 病理學(xué)檢查 采用空氣栓塞法于造模1周后處死實驗動物，由病理科醫(yī)師迅速取出心臟，冰凍后從心尖到心底部，沿垂直于心室長軸的方向，切為20 mm薄片，依據(jù)2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）染色（存活心肌染色為磚紅色，梗死心肌不能染成紅色）結(jié)果判斷心肌各節(jié)段情況。LCX供血區(qū)域各節(jié)段心肌以4%多聚甲醛溶液浸泡固定12 h，常規(guī)石蠟包埋，間斷均勻切片（2 μm）。行蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，光鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS 22.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用（±s）進(jìn)行統(tǒng)計描述，正態(tài)性檢驗采用單樣本K-S擬合優(yōu)度法。服從正態(tài)分布的多組均數(shù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況

16只山羊均分在4組，體質(zhì)量分別為對照組（24.71±1.28）kg，栓塞組（26.41±0.74）kg，低劑量組（25.70±1.32）kg，高劑量組（25.93±1.38）kg，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.485，P=0.111）。

2.2 體表心電圖變化及冠狀動脈造影圖像

山羊體表心電圖的演變規(guī)律符合臨床AMI及缺血再灌注過程：急性缺血后T波高尖，胸前區(qū)導(dǎo)聯(lián)快速出現(xiàn)ST段弓背向上抬高，漸與高大的T波融合，R波逐漸降低，再灌注后ST段回落≤30%，提示心肌微循環(huán)出現(xiàn)灌注障礙（圖1～3）；山羊選擇性冠狀動脈LCX造影，球囊封堵30 min后，經(jīng)微導(dǎo)管注入微球（圖4～6）。

圖1 術(shù)前心電圖Figure 1 Preoperative electrocardiogram

圖2 球囊封堵30 min 心電圖Figure 2 30 minutes electrocardiogram after balloon occlusion

圖3 再灌注心電圖Figure 3 Reperfusion electrocardiogram

圖4 左回旋支造影Figure 4 Left circumf lex branch angiography

圖5 球囊封堵Figure 5 Balloon closure

圖6 微球栓塞Figure 6 Microsphere Embolization

2.3 異甘草酸鎂對MIRI山羊心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

在栓塞組中，GSH濃度顯著降低，SO D的活性顯著降低，MDA濃度升高，在異甘草酸鎂預(yù)處理治療組中則有效降低了山羊血清中MDA的含量，顯著增強(qiáng)了SOD的活性，升高了GSH濃度，并且呈劑量依賴（表1）。

表1 異甘草酸鎂對心肌缺血再灌注損傷山羊的外周靜脈血清中SOD、MDA、GSH 氧化應(yīng)激的影響（±s）Table 1 Eff ects of magnesium isoglycyrrhizinate on oxidative stress of SOD，MDA and GSH in peripheral venous serum of goats with myocardial ischemia-reperfusion injury （±s）

表1 異甘草酸鎂對心肌缺血再灌注損傷山羊的外周靜脈血清中SOD、MDA、GSH 氧化應(yīng)激的影響（±s）Table 1 Eff ects of magnesium isoglycyrrhizinate on oxidative stress of SOD，MDA and GSH in peripheral venous serum of goats with myocardial ischemia-reperfusion injury （±s）

注：a，與對照組比較，P ＜0.05；b，與栓塞組比較，P ＜0.05；c，與低劑量組比較，P ＜0.05；SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛；GSH，谷胱甘肽。

指標(biāo) 對照組（4 只）栓塞組（4 只）異甘草酸鎂 F 值 P 值低劑量組（4 只）高劑量組（4 只）SOD（U/ml）148.58±1.67 107.57±4.28a 123.05±5.21ab 134.78±4.24abc 171.927 ＜0.001 MDA（nmol/ml）1.83±0.99 4.29±0.06a 3.26±0.19ab 2.11±0.11abc 347.557 ＜0.001 GSH（μmol/ml）0.43±0.01 0.12±0.01a 0.23±0.02ab 0.33±0.02abc 354.298 ＜0.001

2.4 異甘草酸鎂對MIRI山羊心肌細(xì)胞炎癥介質(zhì)的影響

炎癥反應(yīng)也是再灌注損傷中導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和壞死的重要機(jī)制。檢測結(jié)果表明，與栓塞組相比，異甘草酸鎂預(yù)處理治療可以使IL-6水平顯著降低，而IL-10水平顯著升高，且存在劑量依賴（表2）。

表2 異甘草酸鎂對心肌缺血再灌注損傷山羊心肌細(xì)胞炎癥因子濃度的影響（pg/ml，±s）Table 2 Eff ect of magnesium isoglycyrrhetinic acid on the concentration of inf lammatory factors in goat myocardial cells after myocardial ischemia-reperfusion injury（pg/ml，±s）

表2 異甘草酸鎂對心肌缺血再灌注損傷山羊心肌細(xì)胞炎癥因子濃度的影響（pg/ml，±s）Table 2 Eff ect of magnesium isoglycyrrhetinic acid on the concentration of inf lammatory factors in goat myocardial cells after myocardial ischemia-reperfusion injury（pg/ml，±s）

注：a，與對照組比較，P ＜0.05；b，與栓塞組比較，P ＜0.05；c，與低劑量組比較，P ＜0.05；IL-6，白細(xì)胞介素6；IL-10，白細(xì)胞介素10。

指標(biāo) 對照組（4 只）栓塞組（4 只）異甘草酸鎂 F 值 P 值低劑量組（4 只）高劑量組（4 只）IL-6 68.21±3.19 152.93±5.45a 115.08±4.35ab 74.94±3.50abc 398.776 ＜0.001 IL-10 60.54±1.99 22.63±2.22a 34.35±1.78ab 42.97±1.99abc 254.902 ＜0.001

2.5 異甘草酸鎂對MIRI山羊心肌細(xì)胞Casepase-3、Bcl-2、Bax的影響

與栓塞組相比，異甘草酸鎂的預(yù)處理治療顯著降低了山羊外周血清中Casepase-3、Bax的水平，升高了Bcl-2水平，并呈劑量依賴（表3）。

表3 異甘草酸鎂對心肌缺血再灌注損傷山羊心肌細(xì)胞 Casepase-3、Bcl-2、Bax 的影響（±s）Table 3 Eff ects of magnesium isoglycyrrhetinic acid on Casepase-3，Bcl-2，and Bax in goat myocardial cells after myocardial ischemia-reperfusion injury（±s）

表3 異甘草酸鎂對心肌缺血再灌注損傷山羊心肌細(xì)胞 Casepase-3、Bcl-2、Bax 的影響（±s）Table 3 Eff ects of magnesium isoglycyrrhetinic acid on Casepase-3，Bcl-2，and Bax in goat myocardial cells after myocardial ischemia-reperfusion injury（±s）

注：a，與對照組比較，P ＜0.05；b，與栓塞組比較，P ＜0.05；c，與低劑量組比較，P ＜0.05；Casepase-3，半胱氨酸蛋白酶3；Bcl-2，B細(xì)胞淋巴因子2；Bax，Bcl-2 相關(guān)X 蛋白。

指標(biāo) 對照組（4 只）栓塞組（4 只）異甘草酸鎂 F 值 P 值低劑量組（4 只）高劑量組（4 只）Casepase-3（pmol/L）12.04±2.69 39.27±1.14a 27.13±1.75ab 17.67±1.05abc 166.804 ＜ 0.001 Bcl-2（ng/ml）71.38±1.52 30.56±2.21a 43.76±1.40ab 55.10±1.24abc 447.867 ＜ 0.001 Bax（ng/ml）59.63±1.97 112.46±6.51a 87.96±3.10ab 70.98±2.12abc 139.745 ＜ 0.001

2.6 心肌梗死面積TTC染色

TTC染色圖中蒼白色點片狀為缺血壞死區(qū)域，正常區(qū)域為磚紅色。心肌壞死區(qū)域評價結(jié)果顯示，對照組中未發(fā)現(xiàn)有心肌梗死表現(xiàn)，栓塞組、低劑量組、高劑量組均可見心肌組織壞死明顯。而在異甘草酸鎂預(yù)處理后的山羊接受MIRI手術(shù)后，其心肌梗死面積比栓塞組的心肌梗死面積小，高劑量組的心肌梗死面積也小于低劑量組。將各組的心肌組織用數(shù)碼相機(jī)攝取成為圖片后用IPP病理圖片處理軟件進(jìn)行分析，得出相應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果：對照組、栓塞組、低劑量組、高劑量組梗死面積比值，組間比較［（0.00±0.00）比（55.19±2.93）比（38.34±1.29）比（22.77±2.26），P＜0.01］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；低劑量組、高劑量組與栓塞組比較，梗死面積減少（P＜0.01）；高劑量組梗死面積顯著小于低劑量組（P＜0.01），提示異甘草酸鎂可以降低MIRI山羊的心肌梗死面積，且呈劑量依賴（圖7～10）。

圖7 無梗死心肌Figure 7 Infarction free myocardium

圖8 栓塞組梗死心肌Figure 8 Embolization group with infarcted myocardium

圖9 低劑量組梗死心肌Figure 9 Low dose group with infarcted myocardium

圖10 高劑量組梗死心肌Figure 10 High dose group with infarcted myocardium

2.7 HE染色

觀察各組術(shù)后1周心肌組織的鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，圖11是正常心肌組織。在栓塞組可以看到組織壞死、中性粒細(xì)胞浸潤、間隙性水腫和血管改變等表現(xiàn)（圖12），而在經(jīng)過異甘草酸鎂處理的心肌細(xì)胞中，這種病理性改變明顯減輕。其中，高劑量組病理改變明顯較低劑量組輕，細(xì)胞排列相對規(guī)則，組織壞死少，炎癥細(xì)胞浸潤范圍小，成纖維細(xì)胞增生少，對比分析可知異甘草酸鎂的保護(hù)作用呈劑量依賴（圖13～14）。

圖11 正常心肌組織（HE×100）Figure 11 Normal myocardial tissue（HE×100）

圖12 栓塞組心肌組織（HE×100）Figure 12 Myocardial tissue in the embolization group（HE×100）

圖13 低劑量組心肌組織（HE×100）Figure 13 Low dose group myocardial tissue（HE×100）

圖14 高劑量組心肌組織（HE×100）Figure 14 High dose group myocardial tissue（HE×100）

3 討論

隨著我國人民生活方式的改變及人口老齡化的進(jìn)展，心血管疾病逐漸成為威脅我國人民群眾身體健康的主要公共衛(wèi)生問題。這其中以心肌梗死最為兇險，致死、致殘率較高。在急性期及早開通閉塞的冠狀動脈血管，及時恢復(fù)血流是目前公認(rèn)的有效降低AMI致死、致殘的積極方法。多數(shù)情況下，缺血后再灌注可使心肌功能得到恢復(fù)，損傷的結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，但有時缺血后再灌注反而進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷和死亡，加重心臟功能障礙和心肌結(jié)構(gòu)損傷，即MIRI，也是AMI早期開通血管過程中不可避免的問題。因此，如何降低MIRI是目前心血管疾病的研究熱點之一。

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）可以提高AMI的生存率，但仍有30%以上的患者會出現(xiàn)CMD和心力衰竭，冠狀動脈樹由作為容量血管的心外膜動脈和作為阻力血管并調(diào)節(jié)冠狀動脈血流和營養(yǎng)代謝的微循環(huán)（包括前微動脈、微動脈、毛細(xì)血管和微靜脈，直徑＜500 μm）組成［15］，所以AMI患者行PCI后即使心外膜動脈通暢，冠狀動脈微循環(huán)障礙仍會導(dǎo)致心肌灌注無法完全恢復(fù)，越來越多的研究認(rèn)識到CMD在PCI術(shù)后心肌缺血和心絞痛中的核心致病作用，且與負(fù)性預(yù)后顯著相關(guān)。因此，建立模擬臨床上心肌缺血再灌注治療中CMD的動物模型就顯得很有必要，同時也是研究CMD類疾病發(fā)展轉(zhuǎn)歸及評價藥物治療作用必不可少的工具。

CMD發(fā)病機(jī)制涉及血管內(nèi)皮損傷、血管平滑肌功能異常、機(jī)械性壓迫、冠狀動脈微栓塞以及MIRI等［15］。目前國內(nèi)外MIRI模型常采用開胸后選擇性冠狀動脈結(jié)扎的方法，以造成左心室缺血或梗死［16］，無法完全模擬出臨床上AMI后血運重建過程中的病理生理學(xué)過程，如冠狀動脈微血管阻塞等改變。相比之下，在大多數(shù)動物模型中健康的冠狀動脈被進(jìn)行閉塞和再灌注，而冠狀動脈微栓塞的問題在很大程度上被忽視了。早期再灌注期間的冠狀動脈微栓塞不僅會導(dǎo)致MIRI，而且也是損傷心臟自身保護(hù)性改變對心肌潛在搶救的混雜因素。

冠狀動脈微循環(huán)模型多采用直接冠狀動脈內(nèi)注射微栓塞球法、自體微血栓法及化學(xué)損傷法［17］，雖適用于不同發(fā)病機(jī)制導(dǎo)致的CMD實驗研究，但是其模型構(gòu)建并未在動物已經(jīng)發(fā)生心肌梗死的基礎(chǔ)上。本模型則綜合了上述多種方法，采用直徑為20 μm的聚苯乙烯單分散微球，通過球囊擴(kuò)張及微導(dǎo)管選擇性注入的介入方法，成功建立山羊MIRI-CMD模型。本模型從接近臨床實際的角度為缺血性心臟病中CMD病理生理改變的深入研究創(chuàng)造了可能，并為預(yù)防和治療干預(yù)提供了轉(zhuǎn)化模型。本研究所選用的山羊被認(rèn)為是心血管研究的良好模型［18］，其冠狀動脈循環(huán)與人類相似，且冠狀動脈側(cè)支發(fā)育較?。?9］。選擇性栓塞可有效控制心肌損傷的面積，而非缺血區(qū)可部分代償栓塞區(qū)的功能，從而提高動物的存活率。山羊因其體型較大，易于進(jìn)行介入操作，避免開胸等不良創(chuàng)傷因素對心臟病理生理學(xué)的影響，從而保證研究的可靠性。丙泊酚耳緣靜脈輸注，具有起效快、作用時間短、安全不易蓄積、易于操作等優(yōu)點，心臟節(jié)律保持平穩(wěn)，效果可靠。實驗山羊均為左冠狀動脈優(yōu)勢型血供，LCX較粗大、右冠狀動脈短小，所有動物均于LCX中遠(yuǎn)段釋放微球，以組織病理學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合心電圖檢查表明球囊擴(kuò)張30 min后，再灌注時注入適量微球誘導(dǎo)微栓塞，可以造成局部心肌壞死及不同程度的成纖維細(xì)胞增生和血管內(nèi)微球填充。與栓塞組相比，非栓塞組顯示心肌損傷輕微，且病理結(jié)果證實缺血心肌多為前壁、間隔壁，其中重要的損傷機(jī)制涉及到氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等。選取術(shù)后72 h抽取山羊靜脈血，一方面是基于現(xiàn)有的文獻(xiàn)闡述，另一方面是考慮到損傷后的相關(guān)檢測物質(zhì)濃度改變需要時間，而且微球栓塞的不均一性（由于冠狀動脈微循環(huán)血管內(nèi)徑不同，心肌缺血時不同部位損傷程度不同，再灌注時血流恢復(fù)情況不同等）也會延長損傷反應(yīng)表現(xiàn)。由于經(jīng)費等問題，未能進(jìn)行連續(xù)動態(tài)的血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測，為本動物實驗的不足之處。需注意的是，研究發(fā)現(xiàn)山羊?qū)τ诒捶拥哪褪苄暂^高，造模開始后，需要密切觀察麻醉深度以確保實驗安全順利進(jìn)行。

研究表明，炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［20-21］，在MIRI的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，而抑制炎癥和抗氧化可作為預(yù)防或干預(yù)MIRI的有效策略。GA的抗炎和抗氧化特性已被廣泛報道［22］，可降低結(jié)腸癌大鼠的過度增殖反應(yīng)，下調(diào)促炎細(xì)胞因子、炎癥和血管生成標(biāo)志物以及凋亡水平［23-24］。其作用可能與心肌Nrf-2/HO-1的激活和抑制心肌NF-κB信號通路有關(guān)［25］。此外，體內(nèi)實驗顯示，GA治療可顯著減輕MIRI引起的左心室功能障礙、纖維化和心肌凋亡，同時抑制炎癥反應(yīng)和減少氧化因子的表達(dá)。這些結(jié)果表明，GA治療通過下調(diào)炎癥反應(yīng)和氧化水平來緩解缺血/再灌注大鼠的MIRI［26-27］。MIRI是再灌注治療的主要障礙，預(yù)防心肌缺血后心肌細(xì)胞死亡是控制MIRI的最佳方法。所以本實驗選擇異甘草酸鎂作為預(yù)處理藥物，以驗證其對于山羊MIRI的保護(hù)作用。

研究表明，在體內(nèi)SOD是抗氧化酶中清除氧自由基的主力軍［28］；GSH發(fā)揮作用的機(jī)制是當(dāng)體內(nèi)自由基含量增加、氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯時，通過其結(jié)構(gòu)中的巰基被氧化脫氫來清除體內(nèi)多余的自由基［29］；MDA是脂質(zhì)過氧化物代謝后的終產(chǎn)物，MDA含量常常與機(jī)體組織氧化損傷程度呈正比［30］。本研究表明，與栓塞組血清中MDA、GSH、SOD指標(biāo)相比，異甘草酸鎂的預(yù)處理有效降低了山羊血清中MDA的含量，增強(qiáng)了SOD的活性，升高了GSH濃度，并且呈一種劑量依賴性的方式。提示GA的心血管保護(hù)作用是由于它具有抗氧化潛力，能夠減輕MIRI山羊心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，維護(hù)心肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定。

心肌梗死后，M1巨噬細(xì)胞滲入受損的心臟組織，引發(fā)炎癥并釋放促炎細(xì)胞因子，包括一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子α、IL-1β和IL-6。相反，抗炎巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子（精氨酸酶、IL-4和IL-10），并促進(jìn)傷口愈合和瘢痕形成［31］。MIRI的病理過程可引發(fā)有害的炎癥反應(yīng)，涉及多種炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）的浸潤和促炎細(xì)胞因子的累積，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟功能障礙。本實驗檢測了炎癥介質(zhì)IL-10、IL-6，不同組的IL-6、IL-10含量存在差異，而予以異甘草酸鎂處理后的山羊心肌梗死細(xì)胞的IL-6水平則明顯降低，且存在一定的劑量依賴。

心肌細(xì)胞的凋亡是一個由一系列程序控制的細(xì)胞死亡的過程，這與細(xì)胞壞死不同。心肌細(xì)胞凋亡開始于心肌缺血并被再灌注放大，導(dǎo)致部分心肌細(xì)胞的死亡。通過細(xì)胞外信號或通過線粒體釋放凋亡酶激活因子均可以激活凋亡酶Casepase（半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶），啟動凋亡程序。Casepase是引起細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵、最重要、最核心的酶［32］，在大多數(shù)凋亡的檢測實驗中，Casepase-3是必不可少的。Casepase-3的激活很大程度上依賴于細(xì)胞色素C的釋放，而Bcl-2家族中的Bcl-2、Bax也是凋亡過程中的重要調(diào)控基因，它們可以通過線粒體途徑介導(dǎo)胱抑素C的釋放。Bcl-2、Bax、Casepase-3在細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)過程中相互影響、相互制約、相互促進(jìn)，Bcl-2、Bax既可以作為Casepase-3的上游調(diào)控基因，也可以作為Casepase-3的直接底物［33］。Bax/Bcl-2比例在凋亡過程中也具有重要的意義，上調(diào)Bcl-2或下調(diào)Bax均可以抑制細(xì)胞凋亡。正如前述實驗表明，異甘草酸鎂預(yù)處理能夠有效減輕心肌梗死細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥介質(zhì)生成，并且能夠上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax的比值，從而有效地減弱細(xì)胞凋亡過程。本實驗認(rèn)為，異甘草酸鎂預(yù)處理可以有效減少心肌梗死后心肌細(xì)胞的凋亡。

本研究觀察了山羊心肌MIRI的大體心肌梗死面積及組織病理改變，在栓塞組山羊心肌梗死面積較大，病理切片可以觀察到組織壞死、肌纖維排列紊亂、中性粒細(xì)胞浸潤、間隙性水腫和血管改變，壞死的心肌細(xì)胞胞漿中HE染色明顯。而異甘草酸鎂預(yù)處理組的心肌梗死面積減小，病理結(jié)果提示心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變較少，心肌細(xì)胞排列相對整齊、規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤較少，損傷較輕。這一結(jié)果提示異甘草酸鎂對于心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上具有保護(hù)作用，并減輕了山羊MIRI的細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷。

綜上所述，本實驗認(rèn)為，異甘草酸鎂能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少炎性介質(zhì)釋放，起到有效抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，從而有效地減輕由心肌梗死及再灌注引起的心肌損傷，并最大限度降低梗死面積。本實驗發(fā)現(xiàn)對于心肌梗死的患者，異甘草酸鎂可能是潛在的心血管保護(hù)藥物。本實驗研究了異甘草酸鎂在MIRI過程中的作用及其潛在的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其作用可能與抑制氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)，且呈現(xiàn)出濃度依賴的方式，抑制炎癥和抗氧化應(yīng)激可作為預(yù)防或干預(yù)MIRI的有效策略。甘草作為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的重要組成部分，入藥歷史悠久，應(yīng)用范圍廣泛，具有多種藥理作用和生物活性，近年來，國內(nèi)外對其不同提取物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了更多獨特的臨床應(yīng)用價值。在內(nèi)蒙古，甘草作為當(dāng)?shù)靥禺a(chǎn)，如能進(jìn)一步開發(fā)利用，將帶動系列產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展。本研究選用GA的衍生物制劑——異甘草酸鎂作為研究對象，以探究其對于模型動物MIRI的保護(hù)作用及機(jī)制，為其進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。因條件所限，本課題組所建模型數(shù)量比較少且觀察時間較短，未能通過心臟超聲檢查評估不同組別造模后不同時間段心功能狀態(tài)，將在以后的實驗中逐步完善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突