長(zhǎng)鏈非編碼RNA Neat1對(duì)紫外線B誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞焦亡的抑制作用及其機(jī)制

王敏 王妍茜 陳穎 趙越越 楊濤 康剛勁

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,瀘州 646000

年齡相關(guān)性白內(nèi)障是造成視力損害和盲的主要原因之一,既往已有研究證實(shí),晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)凋亡參與了白內(nèi)障的形成[1]。日光紫外線輻射作為不可避免的環(huán)境和物理因素,是導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的重要原因之一[2-4],其中紫外線B對(duì)白內(nèi)障的影響最為重要[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),紫外線B照射還可使LECs發(fā)生焦亡,從而導(dǎo)致白內(nèi)障形成[6]。焦亡在1922年首次被發(fā)現(xiàn)并正式命名[7]。目前在心肌梗死、腎炎、創(chuàng)傷性腦損傷、急性肝損傷、糖尿病腎病、阿爾茨海默病等疾病中均發(fā)現(xiàn)有焦亡參與[8]。近年來(lái)亦有研究表明,年齡相關(guān)性黃斑變性、白內(nèi)障、干眼、蠶食性角膜潰瘍和青光眼的形成中也有焦亡的參與[9-11]。細(xì)胞焦亡有經(jīng)典和非經(jīng)典2種途徑:(1)經(jīng)典途徑 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)參與且依賴胱天蛋白酶1(cysteine aspartic acid specific protease-1,caspase-1)的焦亡經(jīng)典途徑目前研究較多也較成熟;(2)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)核旁斑長(zhǎng)點(diǎn)組裝轉(zhuǎn)錄本1(nuclear enrichment abundant transcript 1,Neat1)途徑 LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且不具有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA,調(diào)控許多生物學(xué)過(guò)程[12-13]。近來(lái)有研究顯示,Neat1參與H2O2誘導(dǎo)的LECs凋亡和LECs的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7,14],還可調(diào)控caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,但其是否參與了LECs細(xì)胞焦亡目前尚不清楚,我們推測(cè)LECs發(fā)生焦亡可能與Neat1的表達(dá)相關(guān)。本研究擬探討Neat1對(duì)紫外線照射誘導(dǎo)LECs焦亡的作用及機(jī)制,以期為延緩年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及紫外線B照射 HLE-B3細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),隔天換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代。將細(xì)胞暴露于輻照峰為297 nm且光譜波長(zhǎng)為280～320 nm的紫外線燈下,調(diào)整高度,使照射強(qiáng)度為2 W/m2,分別照射細(xì)胞0、2、4、8 h。

1.2.2Western blot法檢測(cè)照射不同時(shí)長(zhǎng)細(xì)胞中caspase-1濃度 按照紫外線B照射不同時(shí)長(zhǎng)處理HLE-B3細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌細(xì)胞3次,吸盡PBS,加入全蛋白裂解液使細(xì)胞完全裂解,收集上清液,BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,電泳、轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉1 h,加入caspase-1一抗稀釋液(1∶1 000)和GAPDH稀釋液(1∶10 000),4 ℃過(guò)夜,采用TBST洗滌3次,加入二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育30 min,滴加ECL試劑,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影、拍照。以GAPDH為內(nèi)參,采用Fusion軟件分析各組灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)照射不同時(shí)長(zhǎng)細(xì)胞中Neat1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 收集紫外線B照射后的HLE-B3細(xì)胞,采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA,擴(kuò)增程序設(shè)置如下:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。Neat1正向引物序列為5'-AGTGA TGTGGAGTTAAGGCGC-3',反向引物序列為5'-CGGGC TTACCAGATGACCAG-3';GAPDH正向引物序列為5'-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3',反向引物序列為5'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算Neat1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)照射不同時(shí)長(zhǎng)細(xì)胞活力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化混勻后,細(xì)胞板計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml,每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板中,每組5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)箱中過(guò)夜,次日吸去培養(yǎng)基,每孔加入40 μl完全培養(yǎng)基,按相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行照射處理,照射結(jié)束后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h,采用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算照射不同時(shí)長(zhǎng)后的細(xì)胞活力值,根據(jù)細(xì)胞活力值確定UVB的照射時(shí)長(zhǎng)。細(xì)胞活力值(%)=照射不同時(shí)間點(diǎn)A值/照射0 hA值×100%。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板,細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml,隨機(jī)分為陰性siRNA轉(zhuǎn)染組、siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組,各組均根據(jù)siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染相應(yīng)試劑24 h,陰性siRNA堿基序列為5'-GGTTGTGAAGGGAGGGAAGG TCCAG-3',siRNA Neat1堿基序列為5'-GAGTCAGG AGGAATAGGCCGCAGCA-3'。其中陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組轉(zhuǎn)染相應(yīng)試劑后采用紫外線B照射4 h。收集細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力 按照1.2.4方法檢測(cè)各組細(xì)胞A值,計(jì)算各組細(xì)胞活力值。細(xì)胞活力值(%)=各實(shí)驗(yàn)組A值/陰性siRNA轉(zhuǎn)染組A值×100%。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞焦亡 收集處理后的各組HLE-B3細(xì)胞,PBS清洗2次,用不含EDTA的胰蛋白酶消化,離心半徑5 cm,1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,采用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,每組加入300 μl的1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,室溫避光加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate isomer I,Annexin V-FITC)染液,混勻后避光孵育10 min,加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液再次混勻后,避光反應(yīng)5 min,1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。計(jì)算Annexin V-FITC/PI雙陽(yáng)細(xì)胞的晚期凋亡率,即為細(xì)胞焦亡率。

(3)機(jī)會(huì)主義。威廉姆森認(rèn)為機(jī)會(huì)主義指的是人們出于自身的自利動(dòng)機(jī)以及信息失真的情況下所做出的決策。簡(jiǎn)言之，機(jī)會(huì)主義行為是在信息不對(duì)稱下，人們依靠不完全地信息，從而獲取他人不正當(dāng)利益的行為。合約的行為一旦難以被察覺(jué)，以及因果關(guān)系復(fù)雜時(shí)，交易主體就很容易做出機(jī)會(huì)主義的行為。在退耕還林政策中，地方政府為了實(shí)現(xiàn)造林的計(jì)劃要求，會(huì)出現(xiàn)利用植樹(shù)節(jié)造林造假的現(xiàn)象；而農(nóng)戶為了領(lǐng)取相應(yīng)的造林補(bǔ)貼，也會(huì)出現(xiàn)補(bǔ)栽等現(xiàn)象。為了保證政策的實(shí)施，政策的制定者不得不采用制定更加嚴(yán)格的制度，或者加大監(jiān)控的力度，而這樣做就會(huì)增大政策的交易成本。

1.2.8Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表達(dá) 按照1.2.2方法檢測(cè)各組紫外線B照射不同時(shí)長(zhǎng)處理HLE-B3細(xì)胞中caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表達(dá)量,caspase-1、GSDMD、NLRP3一抗稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000和1∶500。

1.2.9ELISA法檢測(cè)IL-1β質(zhì)量濃度 將處理后的細(xì)胞冰凍溶解,2 000 r/min離心20 min,收集上清液,按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,酶標(biāo)板中加入稀釋后的細(xì)胞上清液,加入抗體后封閉,37 ℃孵育1 h后洗滌,加入酶標(biāo)抗體后,37 ℃孵育30 min,加底物顯色后加入終止液,分光光度計(jì)450 nm處讀數(shù),檢測(cè)各孔A值。IL-1β濃度與A450值呈正比,通過(guò)參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)照未知樣本中A值,計(jì)算樣本中IL-1β質(zhì)量濃度。

1.2.10透射電子顯微鏡下觀察各組HLE-B3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 將細(xì)胞收集后離心,1 000 r/min離心5 min,棄去培養(yǎng)液,加入體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛,4 ℃固定過(guò)夜,PBS清洗4次,每次靜置15 min,質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定液(pH=7.4)室溫固定2 h,再次用PBS清洗4次,乙醇脫水后用丙酮置換2次,丙酮與包埋劑混合液浸漬后使用包埋劑包埋,60 nm厚切片,醋酸雙氧鈾、醋酸鉛染色,透射電子顯微鏡下觀察各組HLE-B3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紫外線B照射不同時(shí)長(zhǎng)后caspase-1蛋白表達(dá)比較

隨照射時(shí)間的延長(zhǎng),caspase-1蛋白表達(dá)條帶灰度呈遞增趨勢(shì)。照射0、2、4和8 h后caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.05±0.01、0.25±0.07、0.51±0.04和0.74±0.02,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=168.223,P<0.001),照射不同時(shí)長(zhǎng)兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖1)。

圖1 紫外線B照射不同時(shí)長(zhǎng)后caspase-1蛋白表達(dá)量比較 A:照射不同時(shí)長(zhǎng)后細(xì)胞caspase-1蛋白表達(dá)電泳圖 隨照射時(shí)間的延長(zhǎng),caspase-1蛋白表達(dá)條帶灰度呈遞增趨勢(shì) B:照射不同時(shí)長(zhǎng)后細(xì)胞caspase-1蛋白表達(dá)量比較 F=168.223,P<0.001.與照射0 h比較,aP<0.01;與照射2 h比較,bP<0.01;與照射4 h比較,cP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn);n=3) 1:照射0 h;2:照射2 h;3:照射4 h;4:照射8 h caspase:胱天蛋白酶;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.2 紫外線B照射不同時(shí)長(zhǎng)后HLE-B3細(xì)胞中Neat1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

Neat1 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨照射時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)。照射0、2、4和8 h后Neat1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.11±0.55、7.52±0.48、11.89±0.50和21.16±2.48,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.105,P<0.001),其中照射不同時(shí)長(zhǎng)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3 紫外線B照射不同時(shí)長(zhǎng)后HLE-B3細(xì)胞活力比較

倒置顯微鏡下可見(jiàn),照射0 h時(shí)HLE-B3細(xì)胞貼壁良好,呈梭形及多邊形,輪廓清晰,細(xì)胞飽滿,聚集生長(zhǎng);照射2 h后,貼壁細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)改變,為不規(guī)則多邊形,細(xì)胞密度低于照射0 h;照射4 h后,貼壁細(xì)胞數(shù)量及密度進(jìn)一步降低,明顯低于照射2 h后,細(xì)胞腫脹;照射8 h后,貼壁細(xì)胞零星分布,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,腫脹明顯,細(xì)胞質(zhì)不清晰(圖2)。照射0、2、4和8 h后細(xì)胞活力值分別為(100.00±0.00)%、(89.22±3.26)%、(65.94±9.03)%和(21.50±8.17)%,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.615,P<0.001),其中照射不同時(shí)長(zhǎng)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)?？紤]到后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用,故確定紫外線B的照射時(shí)長(zhǎng)為4 h。

圖2 紫外線B照射不同時(shí)長(zhǎng)后HLE-B3細(xì)胞形態(tài)(×100,標(biāo)尺=100 μm) A:照射0 h后 細(xì)胞貼壁良好,呈梭形及多邊形,細(xì)胞飽滿,聚集生長(zhǎng) B:照射2 h后 貼壁細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)改變,為不規(guī)則多邊形,細(xì)胞密度低于照射0 h C:照射4 h后 貼壁細(xì)胞數(shù)量及密度進(jìn)一步降低,明顯低于照射2 h后,細(xì)胞腫脹 D:照射8 h后 貼壁細(xì)胞零星分布,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,腫脹明顯,細(xì)胞質(zhì)不清晰

2.4 不同siRNA轉(zhuǎn)染組HLE-B3細(xì)胞中細(xì)胞活力比較

陰性siRNA轉(zhuǎn)染組、siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組、siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞活力值分別為(100.00±0.00)%、(130.33±8.18)%、(58.66±8.24)%和(77.12±10.69)%,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.417,P<0.001),其中與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較,siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力值升高,陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組比較,siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞活力值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組HLE-B3細(xì)胞活力值比較 F=46.417,P<0.001.與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較,aP<0.01;與陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn);n=3) 1:陰性siRNA轉(zhuǎn)染組;2:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組;3:陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組;4:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組

2.5 不同siRNA轉(zhuǎn)染組HLE-B3細(xì)胞焦亡率比較

陰性siRNA轉(zhuǎn)染組、siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組HLE-B3細(xì)胞焦亡率分別為(4.60±0.09)%、(2.74±0.03)%、(25.80±1.67)%和(10.73±1.01)%,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=333.868,P<0.001),其中陰性siRNA轉(zhuǎn)染組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞焦亡率明顯低于陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞焦亡率略低于陰性siRNA轉(zhuǎn)染組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖4 各組細(xì)胞焦亡情況 A:各組細(xì)胞焦亡流式細(xì)胞圖 B:各組細(xì)胞焦亡率比較 F=333.868,P<0.001.與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較,aP<0.01;與陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組比較,bP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn);n=3) 1:陰性siRNA轉(zhuǎn)染組;2:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組;3:陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組;4:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組

2.6 不同siRNA轉(zhuǎn)染組HLE-B3細(xì)胞中caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

陰性siRNA轉(zhuǎn)染組、siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞中caspase-1、NLRP3和GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.562、37.885、40.949,均P<0.001),其中陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于陰性siRNA轉(zhuǎn)染組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組HLE-B3細(xì)胞caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(圖5,表1)。

圖5 各組細(xì)胞caspase-1、NLRP3和GSDMD蛋白表達(dá)電泳圖 siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白條帶灰度弱于陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組,強(qiáng)于siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組;陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組3種焦亡相關(guān)蛋白條帶灰度均強(qiáng)于陰性siRNA轉(zhuǎn)染組;siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白條帶灰度均無(wú)明顯差異 1:陰性siRNA轉(zhuǎn)染組;2:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組;3:陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組;4:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組 caspase:胱天蛋白酶;NLRP:核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白;GSDMD:gasdermin D蛋白;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.7 不同siRNA轉(zhuǎn)染組HLE-B3細(xì)胞中IL-1β質(zhì)量濃度比較

陰性siRNA轉(zhuǎn)染組、siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組、陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組HLE-B3細(xì)胞中IL-1β質(zhì)量濃度分別為(19.29±1.41)、(16.80±1.29)、(66.59±8.11)和(31.10±4.74)pg/ml,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.851,P<0.001),其中與陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組相比,陰性siRNA轉(zhuǎn)染組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組IL-1β質(zhì)量濃度明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組IL-1β質(zhì)量濃度略低于陰性siRNA轉(zhuǎn)染組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 各組細(xì)胞中IL-1β質(zhì)量濃度比較 F=68.851,P<0.001.與陰性siRNA轉(zhuǎn)染組比較,aP<0.05;與陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組比較,bP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn);n=3) 1:陰性siRNA轉(zhuǎn)染組;2:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組;3:陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組;4:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組 IL:白細(xì)胞介素

2.8 不同siRNA轉(zhuǎn)染組HLE-B3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較

透射電子顯微鏡下觀察可見(jiàn),陰性siRNA轉(zhuǎn)染組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞腫脹不明顯,細(xì)胞膜完整,線粒體大小正常,線粒體嵴清晰;陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組和siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞腫脹,細(xì)胞膜孔隙形成,線粒體腫脹,呈空泡狀,線粒體嵴模糊,其中與陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組相比,siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞腫脹程度減輕,細(xì)胞膜孔隙減少,線粒體腫脹程度亦減輕(圖7)。

圖7 透射電子顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)變化(醋酸雙氧鈾+醋酸鉛) A～D:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞腫脹,程度較陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組輕(×6 000,標(biāo)尺=5 μm) E～H:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組細(xì)胞膜孔隙(紅色箭頭)形成,但較陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組減少(×30 000,標(biāo)尺=1 μm) I～L:陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組線粒體(白色三角)腫脹明顯,呈空泡狀,線粒體嵴模糊,siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組線粒體腫脹程度較陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組明顯減輕(×60 000,標(biāo)尺=500 nm) 1:陰性siRNA轉(zhuǎn)染組;2:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染組;3:陰性siRNA轉(zhuǎn)染+照射組;4:siRNA Neat1轉(zhuǎn)染+照射組

3 討論

焦亡是一種由caspase介導(dǎo),異于凋亡和壞死的細(xì)胞程序性死亡。Duprez等[15]認(rèn)為caspase-1是一種炎性caspase,調(diào)控細(xì)胞焦亡途徑,不參與凋亡過(guò)程。Wang等[16]在紫外線照射誘導(dǎo)白內(nèi)障形成的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡參與了白內(nèi)障的發(fā)生。本研究團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn),雌激素對(duì)LECs的保護(hù)機(jī)制與抑制LECs焦亡過(guò)程相關(guān),并且有經(jīng)典途徑的參與[17]。LncRNA是一種非蛋白編碼的轉(zhuǎn)錄單元,可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、mRNA加工、運(yùn)輸?shù)榷喾N生物過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),Neat1可促進(jìn)caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡[13],且在年齡相關(guān)性白內(nèi)障組織中的表達(dá)增加[7]。本研究結(jié)果顯示,紫外線B照射HLE-B3細(xì)胞后caspase-1表達(dá)增加,證明HLE-B3細(xì)胞焦亡模型誘導(dǎo)成功,并且隨紫外線照射時(shí)間延長(zhǎng),Neat1的表達(dá)也增加,由此推測(cè)Neat1可能參與了紫外線B誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞焦亡。

在細(xì)胞焦亡發(fā)生的2種途徑中,經(jīng)典途徑是細(xì)胞在外界刺激下,NLRP3等模式識(shí)別受體與有caspase激活募集域(caspase activation and recruitment domain,CARD)的凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、caspase-1前體結(jié)合形成NLRP3炎性小體,NLRP3炎性小體剪切激活caspase-1前體,生成活性caspase-1,caspase-1激活后切割GSDMD,生成N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域,GSDMD的活性N端異位到細(xì)胞膜,形成跨膜孔[18],IL-1β、IL-18等因子從胞內(nèi)釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂[19]。非經(jīng)典途徑由脂多糖直接激活caspase-4/5/11,活化后的caspase-4/5/11作用于GSDMD導(dǎo)致其活化裂解,膜孔形成,引起焦亡[20]。焦亡與凋亡形態(tài)學(xué)特征不同,焦亡發(fā)生時(shí)離子內(nèi)流、細(xì)胞腫脹、膜孔形成,線粒體去極化,染色質(zhì)凝集,而凋亡時(shí)細(xì)胞膜完整[21]。Neat1可與caspase-1前體P20結(jié)構(gòu)域結(jié)合,促進(jìn)NLRP3炎癥小體的組裝,增加caspase-1蛋白酶活性,促進(jìn)細(xì)胞焦亡[13]。細(xì)胞焦亡時(shí),細(xì)胞膜孔隙形成,Annexin V-FITC與PI進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞膜內(nèi)磷酯酰絲氨酸與Annexin V-FITC結(jié)合從而染色,DNA與PI結(jié)合從而染色,因此Annexin V-FITC/PI雙陽(yáng)的晚期凋亡可認(rèn)為是細(xì)胞焦亡。

本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染陰性siRNA的HLE-B3細(xì)胞經(jīng)紫外線B照射后細(xì)胞腫脹程度高、線粒體去極化及膜孔形成均較多。但轉(zhuǎn)染特異性siRNA Neat1沉默Neat1后,紫外線B照射的HLE-B3細(xì)胞腫脹程度、線粒體去極化程度及膜孔形成均減輕,并且細(xì)胞活力和細(xì)胞焦亡率均明顯降低,表明Neat1確實(shí)參與了紫外線B誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞焦亡,沉默Neat1可以抑制焦亡發(fā)生,維持HLE-B3細(xì)胞形態(tài)。Caspase-1、NLRP3和GSDMD是細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑的相關(guān)蛋白,本研究結(jié)果顯示,沉默Neat1后再經(jīng)紫外線B照射的HLE-B3細(xì)胞中caspase-1、NLRP3和GSDMD表達(dá)下調(diào),且細(xì)胞因子IL-1β分泌量減少,表明siRNA Neat1沉默Neat1抑制HLE-B3細(xì)胞焦亡可能有caspase-1依賴的焦亡經(jīng)典途徑的參與。

Neat1主要分布在細(xì)胞核,在胃癌、食管癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌等許多惡性腫瘤中高表達(dá)[22],同時(shí)也可以促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞及LECs的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14,23]。本研究結(jié)果顯示,Neat1通過(guò)caspase-1介導(dǎo)的焦亡經(jīng)典途經(jīng)參與紫外線B誘導(dǎo)的人LECs焦亡,沉默Neat1可以抑制LECs焦亡,維持LECs形態(tài),推測(cè)沉默Neat1可能延緩白內(nèi)障的發(fā)生。但本研究?jī)H探討了Neat1參與的經(jīng)典焦亡途徑,尚未研究具體經(jīng)何種信號(hào)通路介導(dǎo),因此,未來(lái)的研究將進(jìn)一步探索Neat1/caspase-1通路的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而為預(yù)防白內(nèi)障的形成提供新的治療靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明王敏:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草及修改文章;王妍茜:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱及指導(dǎo);陳穎:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱;趙越越:實(shí)施研究、分析/解釋數(shù)據(jù);楊濤:分析/解釋數(shù)據(jù);康剛勁:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱及定稿