Nrf2信號(hào)通路在白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展中的作用

陳月芹 綜述 薛春燕 審校

1南京鼓樓醫(yī)院眼科,南京 210009;2東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院眼科,南京 210002

白內(nèi)障是世界上主要的致盲眼病,除手術(shù)外,缺乏針對(duì)其潛在機(jī)制的有效防治方法[1]。雖然白內(nèi)障病因復(fù)雜多樣,其發(fā)病機(jī)制未完全闡明,但不少研究表明氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致白內(nèi)障的共同因素,過度的氧化應(yīng)激引起晶狀體蛋白發(fā)生氧化、變性、聚集,最終導(dǎo)致晶狀體混濁形成白內(nèi)障[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2信號(hào)通路的激活可以上調(diào)抗氧化基因的表達(dá),是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激損傷的重要通路之一[3]。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2信號(hào)通路異常與白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[1,4-5]。本文就Nrf2氧化防御通路與白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行綜述,以期為白內(nèi)障的防治提供新靶點(diǎn)。

1 Nrf2信號(hào)通路

1.1 Nrf2信號(hào)通路構(gòu)成

Nrf2是CNC(cap‘n’collar)轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員,具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),是機(jī)體抵抗氧化損傷的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。正常生理狀態(tài)下,Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與其抑制因子Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)結(jié)合,Keap1的DGR區(qū)與Nrf2上Neh2區(qū)中的2個(gè)基序79ETGE82(高親和力)、29DLG31(低親和力)結(jié)合。Tong等[6]提出這種結(jié)合方式是一種“鉸鏈與門閂”方式,Keapl與親和力較高的ETGE結(jié)合后,Nrf2可自由移動(dòng),其類似于“鉸鏈”;親和力低的29DLG31結(jié)合部位相當(dāng)于“門閂”,Nrf2與之結(jié)合后其活動(dòng)受到抑制,Neh2區(qū)賴氨酸殘基泛素化的位置得到暴露。Keap1作為Cul3-E3泛素連接酶與底物Nrf2的連接分子,不斷對(duì)Nrf2進(jìn)行泛素化,泛素化的Nrf2被26S蛋白酶體降解,使Nrf2維持在一個(gè)較低的水平[6]。

1.2 Nrf2信號(hào)通路調(diào)控方式

Nrf2信號(hào)通路可以通過Keap1依賴和Keap1非依賴方式激活。

1.2.1依賴Keap1 受到氧化應(yīng)激損傷時(shí),Keap1半胱氨酸基團(tuán)發(fā)生修飾,蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,Nrf2與Keap1結(jié)合,低親和力部位29DLG31得到解離,干擾泛素的轉(zhuǎn)移。繼而Keap1被Nrf2飽和,Nrf2不再被降解,被釋放的Nrf2在細(xì)胞質(zhì)聚集。最后,Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,與小分子肌腱纖維瘤蛋白形成異源二聚體后與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)-Nrf2調(diào)控基因啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)的一個(gè)順式增強(qiáng)子序列(TCAG/CXXXGC)相結(jié)合[7],繼而上調(diào)其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶[如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、NADPH醌氧化還原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)]的表達(dá),發(fā)揮抵御氧化損傷或解毒的作用,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。該方式是經(jīng)典的激活方式。

依賴Keap1的Nrf2信號(hào)通路的激活除了與其解偶聯(lián)這個(gè)方式,還可通過減弱Keap1介導(dǎo)的蛋白酶對(duì)Nrf2降解進(jìn)行激活。氧化應(yīng)激或親電試劑使Cul3從Keap1解偶聯(lián)從而抑制蛋白酶體對(duì)Nrf2的降解。一些Nrf2的激活劑,一方面能終止Nrf2被泛素化,另一方面能增加Keap1的泛素化降解[8]。

除了上述途徑外,最近發(fā)現(xiàn)自噬通路也可以通過Keap1調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路。白內(nèi)障的形成與晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)的異常聚集沉積有關(guān),自噬是清除受損蛋白的主要途徑,維持晶狀體的透明性可以通過調(diào)節(jié)自噬完成,調(diào)節(jié)自噬是預(yù)防白內(nèi)障形成的重要途徑[9]。p62是自噬的核心,是一種自噬受體蛋白,也稱為“垃圾清潔工”[10-11]。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),p62與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Keap1,使Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,從而上調(diào)Nrf2下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。還有研究表明,p62的KIR結(jié)構(gòu)域可以直接與Keap1的Kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)域結(jié)合,干擾Keap1和Nrf2的結(jié)合,使Keap1通過自噬降解,從而激活Nrf2信號(hào)途徑[11]。當(dāng)p62過度表達(dá)時(shí)Keap1蛋白水平下降;而通過小干擾RNA敲除p62基因后,Keap1蛋白增加、Nrf2蛋白減少(mRNA未發(fā)生改變)、Nrf2調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)下降[10]。

1.2.2非依賴Keap1 (1)Nrf2發(fā)生蛋白修飾 Nrf2有絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基,可以通過磷酸化、乙?；揎椷M(jìn)行調(diào)節(jié)[13]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶途徑可參與Nrf2的磷酸化。PKC、MAPK ERK、MAPK JNK、PERK可以磷酸化Nrf2促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移激活該通路;MAPK P38可以磷酸化Nrf2促進(jìn)其與Keap1結(jié)合抑制Nrf2核轉(zhuǎn)移,從而抑制Nrf2信號(hào)通路。P300/CBP能夠乙?；疦rf2,從而促進(jìn)Nrf2與啟動(dòng)子特殊DNA序列結(jié)合,啟動(dòng)抗氧化基因的表達(dá),發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。(2)Nrf2與表觀遺傳 機(jī)體內(nèi)表觀遺傳調(diào)節(jié)方式包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA。DNA甲基化是DNA復(fù)制后常見的調(diào)控方法之一,是機(jī)體正常發(fā)育和分化的重要調(diào)控因子,通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。Liu等[14]用鎳誘導(dǎo)小鼠肝損傷炎癥模型,發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟Nrf2啟動(dòng)子甲基化程度較高、Nrf2蛋白與其下游基因HO-1表達(dá)下調(diào);槲皮素干預(yù)后,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性下降、Nrf2 DNA甲基化水平降低,Nrf2核轉(zhuǎn)移增加、HO-1表達(dá)上調(diào)減輕肝臟損傷。不少研究表明,一些天然藥物可以使Nrf2 DNA啟動(dòng)子甲基化水平降低,促進(jìn)下游基因HO-1、NQO1的表達(dá)從而發(fā)揮抗氧化活性[15]。

組蛋白修飾是指組蛋白在相關(guān)酶作用下發(fā)生乙?；?、甲基化等修飾的過程。當(dāng)組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)活性增強(qiáng),組蛋白乙?；瘻p少,從而降低Nrf2及其靶基因的表達(dá),導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷加重;使用HDAC抑制劑可以增加組蛋白的乙酰化,從而增加Nrf2蛋白表達(dá),減輕氧化應(yīng)激損傷[16]。腫瘤細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性與其可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferases,HMTs)有關(guān),HMTs可通過增加Nrf2基因組蛋白甲基化引起Nrf2表達(dá)增加,從而增加細(xì)胞的耐藥性[17]。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼RNA,包含22個(gè)核苷酸,可以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而干擾其表達(dá)[18]。目前發(fā)現(xiàn)與Nrf2調(diào)控有關(guān)的miRNA包括miR-144、miR-28和miR-34,這些miRNA對(duì)Nrf2有負(fù)調(diào)控作用,但具體機(jī)制尚未完全明確[18]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一種長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過干預(yù)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)以及表觀遺傳的方式,調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)與Nrf2調(diào)控有關(guān)的LncRNA包括:(1)UCA1、MEG3和NRAL通過扮演內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA角色競(jìng)爭(zhēng)相關(guān)的miRNA;(2)HOTAIR增加NFE2L2啟動(dòng)子組蛋白H4乙?；?(3)TUG1直接與Nrf2蛋白相互作用;(4)NMRAL2P充當(dāng)Nrf2上游以及下游一種新的功能假基因[19]。

2 Nrf2信號(hào)通路在白內(nèi)障中的作用

2.1 年齡相關(guān)性白內(nèi)障

氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞抗氧化能力下降通常被認(rèn)為是年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生的2個(gè)重要因素[4]。晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)自身有很強(qiáng)的抗氧化能力,其中Nrf2占重要地位,Nrf2系統(tǒng)能夠清除活性氧(reactive oxygen species,ROS),維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)定狀態(tài)[4]。Keap1可通過負(fù)性調(diào)控Nrf2的蛋白表達(dá)參與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的進(jìn)展。Gao等[20]收集15～80歲白內(nèi)障患者的晶狀體以及LECs進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng),晶狀體內(nèi)Keap1含量顯著上升、Nrf2表達(dá)顯著下降;Keap1 DNA啟動(dòng)子在66～80歲的白內(nèi)障人群晶狀體內(nèi)發(fā)生明顯的去甲基化。Keap1啟動(dòng)子去甲基化使Keap1蛋白表達(dá)增多,增多的Keap1使Nrf2降解增多,Nrf2水平的降低導(dǎo)致其下游抗氧化酶表達(dá)減少,晶狀體氧化防御系統(tǒng)功能受到抑制,最終引起白內(nèi)障。Elanchezhian等[21]將LECs暴露于高濃度同型半胱氨酸建立年齡相關(guān)性白內(nèi)障體外模型,發(fā)現(xiàn)高濃度同型半胱氨酸能引起LECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)、慢性非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)、ROS升高和Nrf2降解,從而阻斷Nrf2對(duì)LECs的氧化防御反應(yīng)。升高的ROS超過了Nrf2的抗氧化能力從而引起晶狀體的過度氧化,最終導(dǎo)致年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。Ma等[22]發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Nrf2的LECs對(duì)過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)引起的細(xì)胞形態(tài)和活性損傷的抵抗能力增強(qiáng),上調(diào)Nrf2的表達(dá)有望延緩LECs的老化和年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)升高的ROS能夠啟動(dòng)PERK信號(hào)通路并誘導(dǎo)下游Nrf2和ATF4的磷酸化;此外,ATF4能夠促進(jìn)Nrf2與ARE結(jié)合,上調(diào)抗氧化物以及抗氧化酶的表達(dá),減輕細(xì)胞氧化損傷。由此可見,隨著年齡的增長(zhǎng),晶狀體內(nèi)一些產(chǎn)物可以通過直接或間接機(jī)制下調(diào)Nrf2通路活性,使晶狀體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。Chhunchha等[23]發(fā)現(xiàn),年齡大的人LECs缺乏Bmal1蛋白,該蛋白的缺失會(huì)引起Nrf2/ARE調(diào)控的抗氧化基因,如過氧化物氧還蛋白6(peroxiredoxin-6,Prdx6)表達(dá)水平逐漸下降,最終導(dǎo)致ROS升高、細(xì)胞氧化損傷加重、細(xì)胞死亡。該研究團(tuán)隊(duì)在動(dòng)物模型中還發(fā)現(xiàn)晶狀體內(nèi)Bmal1/Nrf2/Prdx6和Ⅱ相抗氧化酶表達(dá)的變化與24 h節(jié)律有關(guān),這些蛋白表達(dá)的變化可影響ROS的表達(dá)水平。Choi等[24]采用亞硝酸鈉注射幼鼠皮下誘導(dǎo)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的在體模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組晶狀體內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性下降,丙二醛升高,細(xì)胞核Nrf2表達(dá)下降。篤斯越桔可以通過激活Nrf2/HO-1通路呈劑量依賴性地減輕亞硝酸鈉引起的氧化應(yīng)激損傷,從而發(fā)揮減輕白內(nèi)障的作用。以上在體、體外研究均表明,Nrf2信號(hào)通路與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。由于年齡增大、過強(qiáng)的氧化應(yīng)激等因素引起LECs以及晶狀體內(nèi)Nrf2信號(hào)通路的激活受到抑制,使其下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)下降、氧化防御能力下降,LECs以及晶狀體組織氧化損傷加重,最終導(dǎo)致晶狀體由透明變混濁。

2.2 糖尿病性白內(nèi)障

糖尿病也是白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展的重要因素,長(zhǎng)期高血糖引起機(jī)體多條代謝途徑紊亂,產(chǎn)生過量ROS,過量的ROS又進(jìn)一步加重這些代謝途徑的紊亂,形成惡性循環(huán);當(dāng)ROS產(chǎn)生過量超過晶狀體的抗氧化防御能力,即會(huì)引起晶狀體氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。Palsamy等[25]研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病患者中,高血糖使患者體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS,引起晶狀體內(nèi)Keap1啟動(dòng)子去甲基化,Keap1蛋白表達(dá)增加,負(fù)性調(diào)控Nrf2信號(hào)通路。該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)糖尿病患者晶狀體皮質(zhì)、核以及后囊膜中Keap1 DNA啟動(dòng)子甲基化的5-mc降低90%,而該變化與年齡無關(guān)。Ma等[26]采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型并用klotho干預(yù),發(fā)現(xiàn)klotho治療后糖尿病大鼠白內(nèi)障程度減輕,這與klotho能激活Nrf2信號(hào)通路、增強(qiáng)晶狀體的氧化防御能力有關(guān)[26]。Sun等[27]和Feng等[28]采用D半乳糖誘導(dǎo)糖尿病性白內(nèi)障的動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)模型組晶狀體混濁程度升高,Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降,羥苯磺酸鈣和海藻酸寡糖能通過激活晶狀體內(nèi)Nrf2通路上調(diào)HO-1的表達(dá),減輕晶狀體混濁程度。以上細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均一致表明,高糖能夠通過多種方式引起Nrf2蛋白表達(dá)減少,抑制Nrf2信號(hào)通路,從而下調(diào)其下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),引起晶狀體的氧化損傷,導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。

2.3 其他類型白內(nèi)障

其他一些因素,例如輻射、藥物、高度近視也可引起白內(nèi)障,這些致病因素均可通過調(diào)控Nrf2信號(hào)通路活性參與白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。Sun等[29]采用紫外線照射LECs建立紫外線對(duì)晶狀體輻射損傷的體外模型發(fā)現(xiàn),miR-4532抑制劑能夠通過激活SIRT6-Nrf2通路減輕紫外線對(duì)LECs的氧化損傷,miR-4532-SIRT6-Nrf2有望發(fā)展成為治療晶狀體紫外線損傷的新靶點(diǎn)。近期流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),抗癲癇藥物丙戊酸與白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān),Palsamy等[30]用丙戊酸體外作用于LECs發(fā)現(xiàn),丙戊酸可以通過修飾DNA去甲基化酶使Keap1啟動(dòng)子去甲基化,Keap1表達(dá)升高,從而抑制Nrf2并下調(diào)其下游抗氧化酶,如過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶的表達(dá),細(xì)胞內(nèi)ROS升高,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,最終引起白內(nèi)障的形成。Zhu等[31]將高度近視白內(nèi)障患者LECs和年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者LECs的抗氧化基因的甲基化水平進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),高度近視組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1水平升高,GSTP1和TXNRD2這2個(gè)Nrf2調(diào)控的抗氧化基因啟動(dòng)子CpG區(qū)域高度甲基化,導(dǎo)致GSTP1和TXNRD2表達(dá)下降,最終引起細(xì)胞抗氧化能力下降。他們推測(cè)高度近視患者白內(nèi)障發(fā)生較早的原因在于高度近視患者玻璃體液化發(fā)生早,導(dǎo)致晶狀體較早地暴露于高氧環(huán)境,容易受到氧化應(yīng)激損傷,持續(xù)的氧化應(yīng)激損傷使抗氧化基因發(fā)生甲基化,抗氧化酶蛋白水平下降,細(xì)胞氧化損傷加重,最終導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生。以上研究表明,Nrf2信號(hào)通路可能通過調(diào)控LECs和晶狀體的氧化防御能力參與放射性白內(nèi)障、藥物性白內(nèi)障以及高度近視性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。

3 Nrf2激活劑與白內(nèi)障

目前已有不少研究證明Nrf2激活劑能夠抑制、延緩白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。一些中藥和化合物有激活Nrf2通路的作用,通過上調(diào)下游抗氧化蛋白的表達(dá),抑制晶狀體的氧化損傷。Park等[32]采用H2O2干預(yù)建立LECs氧化損傷的年齡相關(guān)性白內(nèi)障的體外模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑色素(Morin,3,5,7,2',4'-五羥黃酮)和金絲桃苷(一種類黃酮)可以通過激活LECs的ERK-Nrf2信號(hào)途徑,促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,與ARE結(jié)合后上調(diào)HO-1的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),發(fā)揮減輕H2O2引起LECs氧化損傷的作用。Liu等[33]發(fā)現(xiàn)異硫氰酸酯(蘿卜硫素)也能通過激活Nrf2信號(hào)途徑促進(jìn)其核轉(zhuǎn)移,上調(diào)其下游抗氧化酶NQO1和TXNRD1的表達(dá),減輕H2O2引起LECs DNA鏈的斷裂和晶狀體混濁的程度。Liu等[34]用高糖誘導(dǎo)糖尿病性白內(nèi)障的細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)金櫻子提取物(RLM)能夠通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑清除ROS、提高線粒體膜電位,減輕高糖引起的LECs氧化損傷發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Wang等[35]研究發(fā)現(xiàn),丁苯酞可以通過上調(diào)糖尿病大鼠晶狀體內(nèi)Nrf2、硫氧還蛋白、過氧化氫酶蛋白水平,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。Elanchezhian等[36]采用動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn),乙酰左旋肉堿可以通過激活Nrf2通路、上調(diào)其下游抗氧化蛋白的表達(dá),從而預(yù)防白內(nèi)障的發(fā)生。以上在體、體外模型表明,不少化合物可以作為Nrf2信號(hào)通路的激活劑促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,上調(diào)其下游抗氧化基因的表達(dá),提高氧化防御能力,抑制多種因素引起的LECs和晶狀體的氧化損傷,達(dá)到延緩及減輕年齡相關(guān)性、糖尿病性等多種白內(nèi)障的作用。

綜上所述,Nrf2信號(hào)通路在白內(nèi)障中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用,可以將其作為預(yù)防、延緩白內(nèi)障的新思路和新靶點(diǎn)。今后的研究可以考慮將以上Nrf2激活劑進(jìn)行加工、修飾,使其高效性和特異性得到提高,甚至可以將其開發(fā)為滴眼液、眼膏等眼局部藥物,避免全身用藥的不良反應(yīng)。Nrf2信號(hào)通路的上游調(diào)控機(jī)制目前仍不明確,且該通路與表觀遺傳學(xué)之間的關(guān)系研究仍不深入,Nrf2信號(hào)通路與白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究,從而為Nrf2信號(hào)通路作為白內(nèi)障防治靶點(diǎn)提供更多的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突