恩格列凈調(diào)節(jié)AMP依賴蛋白激酶/蛋白激酶B/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號(hào)通路對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)的影響

童凱 羅紅蘭

肺動(dòng)脈高壓(PH)也可稱為肺高血壓,主要特征為肺動(dòng)脈壓異常增高[1]。肺血管重構(gòu)是PH典型的病理學(xué)變化,是PH進(jìn)行性發(fā)展和療效不理想的重要因素之一[2],因此減輕或改善肺血管重構(gòu)對(duì)治療PH意義重大。AMP依賴蛋白激酶(AMPK)在調(diào)控細(xì)胞能量代謝過程中具有重要作用[3]。蛋白激酶B(AKT)參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝、轉(zhuǎn)錄等多種功能的調(diào)控[4]。研究發(fā)現(xiàn)在肺組織平滑肌細(xì)胞中環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的缺失會(huì)引起PH發(fā)生發(fā)展,而AMPK和AKT是CREB的上游蛋白,磷酸化AMPK(p-AMPK)和p-AKT能夠促進(jìn)磷酸化CREB(p-CREB)蛋白表達(dá)水平升高,減少CREB缺失,發(fā)揮維持血管穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄功能[5]。恩格列凈目前臨床主要用于糖尿病治療,但有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)改善PH、敗血癥引起的急性腎損傷、心力衰竭等疾病也有一定效果[6]。本研究旨在探究恩格列凈對(duì)PH大鼠肺血管重構(gòu)的影響及可能機(jī)制。

材料與方法

1.材料:SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,6周齡,購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(蘇)2016-0010。恩格列凈購(gòu)于康德樂大藥房(國(guó)藥準(zhǔn)字J20171073);AMPK抑制劑Compound C購(gòu)于美國(guó)Med Chem Express公司;HE染色試劑盒購(gòu)于上海吉至生化科技有限公司;大鼠低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α ELISA試劑盒購(gòu)于無錫云萃生物科技有限公司;大鼠內(nèi)皮素(ET)-1 ELISA試劑盒購(gòu)于上海酶研生物科技有限公司;一抗及二抗均購(gòu)于Cell Signaling Technology。ZF-258凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)于上海嘉鵬科技有限公司;Power Lab系統(tǒng)購(gòu)于澳大利亞AD儀器有限公司。

2.方法

(1)分組及PH模型構(gòu)建:將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PH組、恩格列凈低、中、高劑量組及恩格列凈+Compound C組,每組各10只。除對(duì)照組外,其余5組均低氧處理:在大鼠飼養(yǎng)倉(cāng)注入氮?dú)庖跃S持低氧狀態(tài)(氧氣濃度維持在10%±0.5%、每天8 h),持續(xù)3周、每周6 d,以構(gòu)建PH模型[7]。大鼠在低氧處理前1周,先進(jìn)行藥物處理。恩格列凈低、中、高劑量組分別以7.5 mg/kg、15.0 mg/kg、30.0 mg/kg恩格列凈灌胃[8],恩格列凈+Compound C組以30 mg/kg恩格列凈灌胃同時(shí)腹腔注射10 mg/kg Compound C,對(duì)照組和PH組予同體積生理鹽水灌胃,6組大鼠均每天1次,連續(xù)4周。

(2)大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)和右心室肥厚指數(shù)(RVHI)檢測(cè):通過右心導(dǎo)管插入肺動(dòng)脈測(cè)量大鼠mPAP。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,分離頸部血管,將連接壓力傳感器的聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈,穿過右心房、右心室,插入至肺動(dòng)脈,當(dāng)Power lab系統(tǒng)的監(jiān)視器上顯示壓力波形時(shí),記錄右心室收縮壓和肺動(dòng)脈壓(包括收縮壓和舒張壓),計(jì)算mPAP。mPAP(mmHg)=1/3×肺動(dòng)脈收縮壓(mmHg)+2/3×肺動(dòng)脈舒張壓(mmHg)。上述操作完成后摘取大鼠眼球取血,離心后取血清,置于-20 ℃冰箱保存。隨后處死大鼠,分別剪去右心室(RV)、左心室(LV)和室間隔(S),稱量并記錄,計(jì)算RVHI。RVHI(μg/mg)=RV重量(μg)/[LV重量(mg)+S重量(mg)]。

(3)大鼠肺小動(dòng)脈組織病理學(xué)變化觀察:將大鼠肺組織取出放置冰上,取部分肺動(dòng)脈組織置于多聚甲醛固定24 h,剩余肺動(dòng)脈組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?4 h后取出固定的肺動(dòng)脈組織,經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片、HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察,選取6條外徑﹤50 μm的肺小動(dòng)脈,分別測(cè)量血管總面積(TA)、管腔面積(IA)、血管外徑(ED)及管壁厚度(WT),并計(jì)算肺血管重構(gòu)指標(biāo):肺小動(dòng)脈管壁面積在血管總面積中的占比(WA%)=[TA(μm2)-IA(μm2)]/TA(μm2)×100%,肺小動(dòng)脈管壁厚度在血管外徑中的占比(WT%)=[WT(μm)/ED(μm)]×100%。

(4)大鼠血清HIF-1α、ET-1水平及肺動(dòng)脈組織AMPK/AKT/CREB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè):取凍存血清解凍后,采用ELISA試劑盒檢測(cè)HIF-1α、ET-1水平。取凍存肺動(dòng)脈組織,于液氮中研磨并制備勻漿,分別使用放射免疫沉淀分析(RIPA)試劑盒和二辛可寧酸(BCA)試劑盒提取總蛋白并檢測(cè)蛋白水平。通過十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳后,半干轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;使用5%脫脂奶粉封閉1 h;分別加入一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜;加入二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h;采用化學(xué)發(fā)光法顯色、Tanon軟件處理圖像并進(jìn)行半定量分析。

結(jié) 果

1.6組大鼠mPAP及RVHI比較:6組大鼠mPAP及RVHI比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PH組大鼠mPAP及RVHI均明顯高于對(duì)照組;恩格列凈低、中、高劑量組及PH組mPAP和RVHI均依次降低;恩格列凈+Compound C大鼠組mPAP及RVHI均明顯高于恩格列凈高劑量組(P<0.05)。見表1。

2.6組大鼠肺小動(dòng)脈組織病理學(xué)變化比較:對(duì)照組大鼠肺小動(dòng)脈管腔面積大,管壁較薄;與對(duì)照組比較,PH組大鼠肺小動(dòng)脈管腔明顯變小,管壁明顯增厚;與PH組比較,恩格列凈低、中、高劑量組及恩格列凈+Compound C組大鼠管腔面積和管壁厚度均有改善,且恩格列凈高劑量組改善效果較為明顯。見圖1。

表1 6組大鼠mPAP及RVHI比較

3.6組大鼠肺小動(dòng)脈WT%及WA%比較:6組大鼠肺小動(dòng)脈WT%及WA%比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PH組大鼠肺小動(dòng)脈WT%及WA%均明顯高于對(duì)照組;恩格列凈低、中、高劑量組及PH組大鼠肺小動(dòng)脈WA%和WA%均依次降低;恩格列凈+Compound C組大鼠肺小動(dòng)脈WT%及WA%均明顯高于恩格列凈高劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠肺小動(dòng)脈WT%及WA%比較

4.6組大鼠血清HIF-1α及ET-1水平比較:6組大鼠血清HIF-1α及ET-1水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PH組大鼠血清HIF-1α及ET-1水平均明顯高于對(duì)照組;恩格列凈低、中、高劑量組及PH組大鼠HIF-1α、ET-1水平均依次降低;恩格列凈+Compound C組大鼠血清HIF-1α及ET-1水平均明顯高于恩格列凈高劑量組(P<0.05)。見表3。

圖1 6組大鼠肺小動(dòng)脈組織病理學(xué)變化(A:對(duì)照組;B:PH組;C:恩格列凈低劑量組;D:恩格列凈中劑量組;E:恩格列凈高劑量組;F:恩格列凈+Compound C組,HE染色,×200)

表3 6組大鼠血清HIF-1α及ET-1水平比較

5.6組大鼠肺動(dòng)脈組織AMPK/AKT/CREB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較:6組大鼠肺動(dòng)脈組織AMPK/AKT/CREB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PH組大鼠肺動(dòng)脈組織p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT、p-CREB/CREB表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組;恩格列凈低、中、高劑量組及PH組大鼠肺動(dòng)脈組織p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT、p-CREB/CREB表達(dá)水平均依次升高;恩格列凈+Compound C組大鼠肺動(dòng)脈組織p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT、p-CREB/CREB表達(dá)水平均明顯低于恩格列凈高劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠肺動(dòng)脈組織AMPK/AKT/CREB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

討 論

緩解肺血管重構(gòu)是治療PH的重要方法之一,可通過調(diào)節(jié)肺血管阻力,改善肺動(dòng)脈順應(yīng)性實(shí)現(xiàn)[9]。WT%和WA%是肺血管重構(gòu)的兩個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)[10]。本研究結(jié)果顯示,PH組大鼠mPAP、PVHI及肺小動(dòng)脈WA%、WT%均明顯升高,表明大鼠出現(xiàn)PH病理學(xué)改變,且血管平滑肌細(xì)胞增殖引起了血管重構(gòu)。與PH組比較,恩格列凈低、中、高劑量組大鼠mPAP、PVHI及肺小動(dòng)脈WA%、WT%均依次降低,提示恩格列凈具有緩解肺血管重構(gòu)、減輕右心室肥厚的效果,可能通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖、減輕肺動(dòng)脈壓發(fā)揮作用。HE染色結(jié)果顯示,恩格列凈能夠改善大鼠肺小動(dòng)脈管壁增厚、管腔面積減小等,與上述研究結(jié)果一致,再次提示恩格列凈可改善肺血管重構(gòu)。

HIF-1α是包括α、β兩個(gè)亞單位的一種異源二聚體,能夠促進(jìn)肺血管重構(gòu),引起肺動(dòng)脈壓持續(xù)提高,推動(dòng)PH發(fā)生發(fā)展[11]。ET-1具有較強(qiáng)的血管收縮功效,是引起PH的重要原因之一[12]。本研究中PH組大鼠血清HIF-1α及ET-1水平均明顯升高,而與PH組比較,恩格列凈低、中、高劑量組大鼠血清HIF-1α及ET-1水平均依次降低,提示恩格列凈可能通過降低血清HIF-1α及ET-1水平緩解肺血管重構(gòu),進(jìn)而減輕PH。

PH的主要特征之一是肺血管重構(gòu),肺血管重構(gòu)主要由外周阻力引起,由整個(gè)肺循環(huán)阻力發(fā)展到一定程度造成[13]。在肺血管重構(gòu)過程中,血管壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,如內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞增殖和肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增生,進(jìn)而導(dǎo)致血管壁增厚,血管擴(kuò)張性降低,此外外側(cè)成纖維細(xì)胞增殖也會(huì)引起管腔變窄等現(xiàn)象[14]。研究發(fā)現(xiàn)CREB能夠調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖并影響巨噬細(xì)胞募集,在維持血管正常內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用,CREB減少或表達(dá)降低是造成肺組織血管重塑的一個(gè)重要因素[5]。AMPK和AKT是CREB的上游蛋白,能夠促進(jìn)CREB活化[15]。有研究報(bào)道,恩格列凈能夠激活A(yù)MPK,引起CREB上游AKT蛋白磷酸化,從而促進(jìn)CREB磷酸化,上調(diào)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2蛋白表達(dá),減輕高尿酸血癥[16]。本研究顯示,PH組大鼠肺動(dòng)脈組織p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT、p-CREB/CREB表達(dá)水平均明顯降低,而與PH組比較,恩格列凈低、中、高劑量組大鼠肺動(dòng)脈組織p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT、p-CREB/CREB表達(dá)水平均依次升高,提示恩格列凈可能通過提高AMPK、AKT及CREB磷酸化蛋白表達(dá)水平發(fā)揮維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用,緩解肺血管重構(gòu)。此外,AMPK抑制劑Compound C可逆轉(zhuǎn)恩格列凈對(duì)PH大鼠肺血管重構(gòu)的緩解作用,亦驗(yàn)證了上述推測(cè)。

綜上,恩格列凈可減輕PH大鼠肺血管重構(gòu),其機(jī)制可能通過提高AMPK、AKT及CREB磷酸化蛋白表達(dá)水平,減輕血管壁增厚。此外,恩格列凈也可降低PH大鼠血清HIF-1α及ET-1水平,緩解PH,從而發(fā)揮對(duì)肺血管重構(gòu)的保護(hù)作用。但本研究未進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),未能從細(xì)胞層面驗(yàn)證恩格列凈的作用,后期我們將通過分離培養(yǎng)原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,觀察恩格列凈對(duì)缺氧處理的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和AMPK/AKT/CREB信號(hào)通路的影響,進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。