基于高通量測序分析高粱紫斑病葉片的微生物組成及多樣性

羅文梅 楊遠橋 孫靜娥 王勇 任明見

摘 要： 本研究采用ITS高通量測序（擴增子測序）技術(shù)對已感染紫斑?。ˋ和B）和未感染紫斑病（CK）的高粱葉片進行檢測，以明確其真菌的群落組成及多樣性。結(jié)果表明：高粱紫斑病病葉中真菌菌群組成豐富，總共檢出820種真菌，3個樣品共同擁有的為155種，所有菌群分屬于9門29綱60目122科和206屬。3份樣品Shannon指數(shù)分別為3.98、4.67、4.11，按大小排序為B>CK>A。同時，含量排名靠前的屬之間親緣關(guān)系比較復(fù)雜，且沒有出現(xiàn)前人報道的高粱尾孢 Cercospora sorghi ，可能的原因是引起該病害發(fā)生的病原菌發(fā)生了變化，或是存在由多種真菌共同作用從而導(dǎo)致病害發(fā)生的可能性。本研究結(jié)果能幫助我們更好地了解高粱紫斑病發(fā)病期葉片真菌的組成和分布的多樣性，為該病害的研究和防治提供更好的指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞： 高通量測序；高粱紫斑病；ITS；分類

中圖分類號：S432

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）02－0017－06

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.02.003

高粱是禾本科一年生草本植物，具有許多優(yōu)質(zhì)的特點，例如抗旱、耐澇、耐貧瘠等，是世界上重要的禾谷類作物之一，據(jù)不完全統(tǒng)計，其種植總面積在世界排名前五［1］。高粱用途廣泛，可用于釀酒、加工成生物燃料或建筑材料、喂食家養(yǎng)牲畜等［2-4］。同時，高粱不僅在國內(nèi)備受歡迎，在西方國家也逐步廣泛出現(xiàn)，這進一步表明該產(chǎn)業(yè)有著巨大的潛力［5］。然而隨著高粱種植面積的擴增，其病蟲害的發(fā)生日益嚴(yán)重。據(jù)報道，病害發(fā)生程度一般時高粱的產(chǎn)量損失在10%～20%，嚴(yán)重時可達到70%［6］。據(jù)報道，我國高粱病蟲害大約有100多種，其中真菌病害有28種［7］，例如造成葉部危害的病害有炭疽病、銹病、紫斑病、大斑病和紋枯病等［8］；造成穗部危害的病害有黑穗?。?］；造成莖部病害的有莖腐?。?0］。在國外，高粱病害的發(fā)生也十分嚴(yán)重，Nutsugah等［11］通過對高粱的病害流行調(diào)查發(fā)現(xiàn)上述病害普遍存在。

仁懷市是貴州省遵義市一個縣級市，位于貴州西北部、赤水河中游，夏季特有的高溫多雨以及地理環(huán)境，十分適宜高粱的生長，因而成為了茅臺酒的故鄉(xiāng)［12］。但高溫高濕的環(huán)境同樣也增加了高粱病蟲害的發(fā)生，其中紫斑病是高粱常見的真菌病害之一，嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)［13-14］。高通量測序技術(shù)的發(fā)展不僅提升了我們對微生物種群的組成了解，也幫助我們能更好地分析微生物菌群的多樣性［15-18］。同時，已有研究表明基于高通量測序技術(shù)可以幫助真菌病害病原菌的鑒定，如通過該技術(shù)幫助鑒定紅棗黑斑?。?9］和草莓白粉病的病原菌［20］。但是，至今尚未有具體的報道對高粱紫斑病發(fā)生時微生物種群的組成情況進行分析，基于此本研究通過高通量測序技術(shù)對發(fā)病時期高粱紫斑病菌的菌群群落結(jié)構(gòu)差異比較分析，以期有利于進一步分析高粱紫斑病的發(fā)病機制，為高粱紫斑病的防治提供更好的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

供試材料為高粱紫斑病病葉，于2021年8月采集自貴州省遵義市仁懷市。共3份樣品，A（癥狀較輕）、B為感病葉片，CK為健康葉片。

1.2 ?基因組DNA的提取和PCR擴增

采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準(zhǔn)確性。引物為ITS1（ITS5-1737F和ITS2-2043R）。

1.3 ?PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對檢測合格的PCR產(chǎn)物進行磁珠純化，采用酶標(biāo)定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.4 ?文庫構(gòu)建和上機測序

使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation ?Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000 進行上機測序。

1.5 ?信息分析部分

1.5.1 ?測序數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對每個樣本的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）；拼接得到的Raw Tags，經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理［21］得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）。

1.5.2 ?OTU聚類和物種注釋

利用Uparse算法對所有樣本的全部Effective Tags進行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）， 同時選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為 OTUs的代表序列。 對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA138（http：//www.arb-silva.de/）［22］的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1），獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平：kingdom（界），phylum（門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬）統(tǒng)計各樣本的群落組成。

1.5.3 ?樣本多樣性分析

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-otus， Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree指數(shù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?測序數(shù)據(jù)處理與OTU分析

從3份測序樣品（樣品A，樣品B和CK）中共獲得247981條原始測序Reads，數(shù)據(jù)質(zhì)控（QC）后得到241461條凈數(shù)據(jù)Reads，其平均長度為409 bp（表1）。完成數(shù)據(jù)質(zhì)控和去除嵌合體分析后，將拼接序列聚類成物種OTU，總共得到820條物種OTU；A、B、CK分別含有256、302、262條OTU，所有樣品共享155條物種OTU（圖1）。

2.2 ?物種分布情況

通過對測序結(jié)果進行整理，并在門、綱、目、科、屬5級分類水平上水平對各個樣品進行分類（表2），總共注釋得到9門、29綱、60目、122科和206屬。圖2和圖3表明，樣本A與B存在明顯差異，但樣本A與樣本CK的菌群組成比較相似。再由表2可知，感病前后真菌群落組成結(jié)構(gòu)基本相同，差異較大的是不同分類水平下的相對豐度。在門分類水平擔(dān)子菌門Basidiomycota和子囊菌門Ascomycota 為優(yōu)勢菌群，且感病后Ascomycota在B中的豐度明顯大于CK；在綱分類水平座囊菌綱 Dothideomycetes和銀耳綱Tremellomycetes為優(yōu)勢菌群，在目分類水平銀耳目Tremellales和葉黑粉菌目Entylomatales為優(yōu)勢菌群，在科分類水平Entylomatales和牛肝菌科Bulleribasidiaceae為優(yōu)勢菌群，在屬分類水平上，按相對豐度排序靠前的順序分別為 Tilletiopsis 、枝孢屬 Cladosporium 、亞隔孢殼屬 Didymella 、漢納酵母屬 Hannaella 、附球菌屬 Epicoccum 、 Dioszegia 、 Papiliotrema 、 Apiotrichum 。樣本B中 Cladosporium 和 Epicoccum ?的相對豐度大于CK，其余屬相對豐度在CK中均大于樣本B。因此根據(jù)相應(yīng)數(shù)據(jù)推測，高粱紫斑病害的前后期葉片的真菌群群豐度發(fā)生了較大的變化，可能存在多種致病菌共同作用的情況。

2.3 ?高粱紫斑病病葉菌群的多樣性

由表3可知，Goods Coverage均為1.00，說明試驗測序結(jié)果能夠準(zhǔn)確的反應(yīng)供試樣品真實情況。在同一時期，3個樣本的Chao1指數(shù)大小順序為B>CK>A，ACE指數(shù)為269.58～315.52，PD whole tree指數(shù)在57.34～71.68，表明本次多樣性測序深度達到了豐富度估計值，而且樣本中的絕大部分真菌物種信息都能被本研究捕捉到，但不同菌種間親緣關(guān)系差異較大。同時，樣本的Shannon指數(shù)大小順序為B>CK>A，Simpson指數(shù)大小排序也相同，上述結(jié)果均說明同一時期的樣本B真菌群落多樣性高于CK真菌群落多樣性。

3 ?結(jié)論與討論

隨著高通量測序技術(shù)的日趨成熟，其應(yīng)用范圍越發(fā)廣泛。目前，已有運用該技術(shù)對高粱根際微生物群落［23］、雪茄煙微生物群落［24］、健康桑果和患病桑果內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)［25］等各方面的研究。李祥棟等［26］通過ITS高通量測序技術(shù)對薏苡的黑穗病癭的真菌進行檢測，發(fā)現(xiàn)了黑穗病害的致病菌為 Sporisorium 與 Ustilago ，其中 Sporisorium 屬于優(yōu)勢菌群，該結(jié)論與前人報道的薏苡黑穗病菌的鑒定并不相同［27］，推測薏苡黑穗病菌存在多種變異類型。有研究表明，同一寄主在不同產(chǎn)地的不同生長時間里的病原菌不一定相同［28］，因而對單一的病原菌進行分離和回接并不能準(zhǔn)確的認(rèn)識各個病害的病原菌，這也是高通量測序技術(shù)被更廣泛用于患病植株微生物群落結(jié)構(gòu)分析的原因之一。對于高粱紫斑病，有報道表明引起該病害的病原菌為 Cercospora sorghi ［29-30］。但本研究的基因組測序結(jié)果表明，在所采集的紫斑病病葉上微生物組成含量列表排名靠前的屬中并沒有 Cercospora 。病害樣本中A與B中 Cercospora 豐度比例僅分別為2.16%與0.15%，其含量并不占優(yōu)勢。加之在初期的病樣分離時并沒有分離得到 Cercospora 所屬的菌株。因此，不排除在貴州省遵義市仁懷市的高粱紫斑病病害葉片中，其病原菌已經(jīng)發(fā)生了變化。當(dāng)然也可能由于 Cercospora ?sp.生長比較慢且分離比較困難，故而我們沒有分離到。

本文基于對所采患紫斑病的高粱病葉與健康葉片進行高通量測序，并對其結(jié)果進行分析得出：（1）高粱感染紫斑病后，葉片的真菌菌群相對豐度發(fā)生了明顯變化，與健康葉片菌群相比，在一定程度上打破了原有的微生物生態(tài)平衡，形成了新的真菌群落關(guān)系；（2）患病樣本B中 Cercospora 含量極少，不排除在貴州省遵義市仁懷市的高粱紫斑病病害葉片中，該病害的病原菌已經(jīng)發(fā)生了變化。

綜上所述，高粱紫斑病的病原菌也許已開始變得復(fù)雜多樣，通過高通量測序技術(shù)的分析幫助我們更加清晰地了解發(fā)病前后其真菌群落的變化情況。因此對該病害病原菌的準(zhǔn)確鑒定及發(fā)病規(guī)律研究將是以后需要全面研究的方向，以期為該病害的防治提供更好的理論指導(dǎo)。

（責(zé)任編輯：段麗麗）

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Analysis of Microbial Composition and Diversity of Sorghum Purple Spot Leaves based on High-throughput Sequencing

Luo Wenmei1，Yang Yuanqiao1，Sun Jinge1，Wang Yong1*，Ren Mingjian2

（1.Key Laboratory of Agricultural Microbiology，College of Agriculture，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2.College of Agriculture，Guizhou University/ Guizhou Subcenter of National Wheat Improvement Center，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：

ITS high-throughput sequencing technology was used to detect sorghum leaves infected and uninfested with purple spot disease，to determine the composition and diversity of fungal community.The results showed that a total of 820 species OTUs were obtained from fungal community in sorghum purple leaf spot，155 OTU species were shared by the three samples.All these species belonged to 9 phylum，29 classes，60 orders，122 families and 206 genus.The Shannon index relation of the three samples was 3.98，4.67 and 4.11，respectively，which were in the order of B>CK>A.Genetic relationship among the top ten genus were relatively complex，and ?Cercospora sorghi ?reported by previous reports was not included in them.We presumed that the pathogen changed or was caused by the combined action of multiple fungi.The results of this study could help us better understand the composition and distribution diversity of leaf fungi during the onset of sorghum purple spot disease.It has a better guiding function for the research and control of this disease.

Keywords：

high-throughput sequencing; purple spot disease; ITS; taxonomic