3種中藥提取物對獼猴桃葡萄座腔菌的毒力及聯(lián)合作用

田旭軍 廖遜 李榮玉 李明 吳小毛 龍友華

摘 要：采用菌絲生長速率法測定了3種中藥乙醇提取物對獼猴桃葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的毒力以及聯(lián)合作用。結(jié)果表明：苦參、丹參以及黃岑片3種乙醇提取物對B.dothidea菌絲生長均有一定的抑制作用，其EC50分別為60.44、60.78和97.86 μg/mL。苦參和丹參提取物以有效質(zhì)量比為1∶ 1、1∶ 3、1∶ 6時對獼猴桃B.dothidea均表現(xiàn)為增效作用，其CTC分別為133.16、126.16和129.56；而黃岑片·苦參、黃岑片·丹參的提取物復(fù)配則均表現(xiàn)為相加作用，其CTC為80.71～117.62。該研究結(jié)果可為防治獼猴桃軟腐病的藥劑組合提供參考。

關(guān)鍵詞： 中藥提取物；獼猴桃；葡萄座腔菌；毒力；聯(lián)合作用

中圖分類號：S435.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）02－0086－04

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.02.013

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），其果實中含有豐富的K、Zn、Ca等多種礦物元素、氨基酸和維C等物質(zhì)，因此被譽(yù)為“人間仙果”“果中之王”和“維C之王”等［1-4］。獼猴桃采摘后儲藏期間最常見的一種潛伏性病害（軟腐病）發(fā)生嚴(yán)重，腐爛率可達(dá)50%以上，嚴(yán)重影響獼猴桃的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值。獼猴桃軟腐病又稱熟腐病，主要是由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、擬莖點霉菌（Phomopsis macrospore）和灰霉菌（Botrytis cinerea）等病原菌引起的軟腐?。?-8］，而葡萄座腔菌被認(rèn)為是引起該病害的主要致病菌，發(fā)病快且難以防治［9-10］，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重影響。目前，獼猴桃軟腐病的防治依然以化學(xué)防治為主，為了降低對化學(xué)農(nóng)藥的過度依賴，篩選高效生物農(nóng)藥是一種較好的選擇。近年來，植物源殺菌劑作為“環(huán)境和諧農(nóng)藥”和“生物合理性農(nóng)藥”的重要組成部分［11］，植物源殺菌劑因其具有高效、低毒、易降解以及不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點而受到人們的高度關(guān)注。國內(nèi)外很多學(xué)者對其進(jìn)行了研究，如王帆帆等［12］明確了丁子香酚和蛇床子素對草莖點霉的室內(nèi)毒力較高；高以宸等［13］的研究表明了紅蓼揮發(fā)油在種子發(fā)芽期及苗期對馬鈴薯環(huán)腐病菌有顯著的抑制作用；Meena等［14］研究表明，牛蹄豆的水提物對茉莉的Sclertium rolfsii病菌具有一定的抑制作用。因此，本文選取了黃岑片、丹參、苦參3種中藥添加乙醇進(jìn)行提取，并研究乙醇提取物對獼猴桃軟腐病致病菌（葡萄座腔菌）的抑制作用，以及測定黃岑片、丹參和苦參3種乙醇提取物組合的聯(lián)合毒力，以期為獼猴桃軟腐病的防治及生物農(nóng)藥的篩選提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?供試病原菌

獼猴桃葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室供給。

1.1.2 ?供試藥劑及儀器設(shè)備

供試藥劑：黃岑片無水乙醇提取物、苦參無水乙醇提取物、丹參無水乙醇提取物。

儀器設(shè)備：SJ-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）、BIC-400人工氣候箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、立式壓力蒸氣滅菌器（LDZM-80L-1，上海申安醫(yī)療器械廠）、接種針、5 mm打孔器、9 mm培養(yǎng)皿、1 mL和5 mL移液槍及槍頭、10 mL離心管等。

1.1.3 ?供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基參照劉世江等［15］的方法，略加修改，具體如下：馬鈴薯200 g、葡萄糖15～20 g、瓊脂20 g、純凈水1000 mL。煮好后在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右備用。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?3種中藥乙醇提取物對獼猴桃軟腐病菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法［16］測定黃岑片、苦參和丹參3種中藥乙醇提取物對獼猴桃軟腐病菌的毒力。根據(jù)所設(shè)濃度梯度配置成相應(yīng)的母液，將其與PDA以體積比為1∶ 9倒入平板中，制成含黃岑片乙醇提取物25、50、100、200、400 μg/mL的系列濃度含藥平板；含苦參乙醇提取物25、50、100、200、400 μg/mL的系列濃度含藥平板；含丹參乙醇提取物25、50、100、200、400 μg/mL的系列濃度含藥平板，沿活化的菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，接至含不同濃度的PDA平板中央，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并采用十字交叉法測量各藥劑各濃度的菌落直徑，并利用Excel 2010計算出毒力回歸方程、有效抑制中濃度（EC50）及其相關(guān)系數(shù)等。

1.2.2 ?3種中藥乙醇提取物及其組合對獼猴桃軟腐病菌的聯(lián)合作用

采用菌絲生長速率法測定黃岑片、苦參和丹參乙醇提取物兩兩復(fù)配對獼猴桃軟腐病菌的聯(lián)合作用。沿活化的菌落邊緣 取直徑為5 mm的菌餅，接

至含不同組合不同濃度的PDA平板中央，各組合各比例的濃度見表1，并采用 1.2.1 中的方法測定各組合各比例對獼猴桃軟腐病菌的毒力。根據(jù)孫云沛法［17］進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計算混劑的共毒系數(shù)（CTC），當(dāng)共毒系數(shù)大于120時，表現(xiàn)為增效作用，小于80時表現(xiàn)為拮抗作用，在80～120之間時則表現(xiàn)為相加作用［18］。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?黃岑片、苦參和丹參3種中藥提取物對葡萄座腔菌的毒力分析

黃岑片、苦參及丹參3種中藥乙醇提取物對獼猴桃軟腐病致病菌（葡萄座腔菌）菌絲生長均具有一定的抑制作用（表2），其EC50分別為97.86、60.44和60.78 μg/mL。丹參、苦參和黃岑片乙醇提取物對獼猴桃軟腐病致病菌（葡萄座腔菌）的抑制作用無明顯差異，其中苦參和丹參乙醇提取物對獼猴桃葡萄座腔菌抑制作用較強(qiáng)，而黃岑片乙醇提取物抑制活性較弱。

2.2 ?3種中藥提取物組合對獼猴桃軟腐病菌的聯(lián)合毒力

2.2.1 ?黃岑片和苦參提取物組合對獼猴桃葡萄座腔菌的聯(lián)合毒力

黃岑片和苦參乙醇提取物組合（6∶ 1、3∶ 1、1∶ 1、1∶ 3、1∶ 6）對獼猴桃軟腐病致病菌（葡萄座腔菌）菌絲生長均有一定的抑制作用（表3）。根據(jù)EC50可知， 苦參提取物對獼猴桃葡萄座腔菌菌絲生長的抑制作用要優(yōu)于黃岑片提取物，其EC50值分別為68.34和98.16 μg/mL；黃岑片·苦參乙醇提取物以有效質(zhì)量比為6∶ 1、3∶ 1、1∶ 1、1∶ 3、1∶ 6時均表現(xiàn)為相加作用，其共毒系數(shù)（CTC）為84.59～96.15。

2.2.2 ?黃岑片和丹參提取物組合對獼猴桃葡萄座腔菌的聯(lián)合作用

黃岑片和丹參乙醇提取物組合（6∶ 1、3∶ 1、1∶ 1、1∶ 3、1∶ 6）對獼猴桃葡萄座腔菌菌絲生長均具有一定的抑制作用（表4）。黃岑片和丹參提取物對獼猴桃葡萄座腔菌的抑制作用無顯著差異，其EC50分別為98.16、89.35 μg/mL；黃岑片和丹參提取物組合中，黃岑片和丹參提取物以有效質(zhì)量比為1∶ 3和1∶ 6時相加作用比較明顯，其CTC分別為112.86和117.62。

2.2.3 ?苦參和丹參提取物組合對獼猴桃葡萄座腔菌的聯(lián)合作用

苦參和丹參提取物5個組合（6∶ 1、3∶ 1、1∶ 1、1∶ 3、1∶ 6）對獼猴桃軟腐病致病菌（葡萄座腔菌）菌絲生長均有一定的抑制作用（表5）。根據(jù)其EC50可知，苦參提取物對獼猴桃葡萄座腔菌菌絲生長的抑制效果要好于丹參提取物，其EC50分別為68.34和89.35 μg/mL；苦參·丹參提取物以有效質(zhì)量比為6∶ 1和3∶ 1時表現(xiàn)為相加作用，其EC50分別為70.55和65.04 μg/mL，CTC分別為100.23和111.63；而苦參·丹參提取物以有效質(zhì)量比為1∶ 1、1∶ 3和1∶ 6時表現(xiàn)為增效作用，其CTC值分別為133.16、126.16和129.56，均大于120。

3 ?結(jié)論與討論

本研究明確了黃岑片、苦參以及丹參3種乙醇提取物對獼猴桃葡萄座腔菌具有一定的抑制作用，其EC50為60.44～97.86 μg/mL。聯(lián)合作用表明，本研究篩選出的3個復(fù)配組合對獼猴桃葡萄座腔菌具有增效作用，分別為苦參·丹參以有效質(zhì)量比為1∶ 1、1∶ 3、1∶ 6，其CTC分別為133.16、126.16和129.56。以上3種中藥提取物對葡萄座腔菌引起的獼猴桃熟腐病的防治效果未見相關(guān)報道，但張盈等［19］研究表明了黃岑片對引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢菌具有較好的抑制效果；楊波等［20］也明確了0.3%苦參堿對葡萄霜霉病菌的EC50值和EC90值分別為2.1834和0.5464 mg/L；并且梁魁景等［21］研究表明3%苦參堿AS對蘋果斑點落葉病菌也具有較好的抑制作用。這些研究表明黃岑片、苦參和丹參對不同作物不同病原菌均具一定的抑制作用，與本試驗的研究結(jié)果一致。

隨著我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，獼猴桃軟腐病逐步得到重視。該病大多發(fā)生在果實采摘后貯藏期，當(dāng)果實發(fā)病后，其果肉組織變成水漬狀。病斑中心呈現(xiàn)乳白色，周圍的果肉組織變成黃綠色，病斑形狀表現(xiàn)為圓形或橢圓狀，病斑可逐漸擴(kuò)大引起整果腐爛［22］。目前，化學(xué)防治仍是防治獼猴桃軟腐病的主要措施，如5%己唑醇ME、10%苯醚甲環(huán)唑WG以及50%咪酰胺錳鹽WP等藥劑對葡萄座腔菌菌絲及孢子均具有較好的毒殺作用［23］。但由于化學(xué)農(nóng)藥長期單一的使用，易導(dǎo)致抗性 （resistance）、再猖獗（resurgence）以及殘留（residue）等問題。而生物農(nóng)藥具有不易產(chǎn)生抗藥性、對環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物安全等特點［9］。在綠色、有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物農(nóng)藥成為了防治病蟲害的主要手段。鑒于此，本研究主要選擇了黃岑片、苦參和丹參3種中藥提取物對引起獼猴桃熟腐病的葡萄座腔菌進(jìn)行室內(nèi)生物活性測，篩選出最佳組合，以期為獼猴桃熟腐病的防治提供新的防治措施。

（責(zé)任編輯：胡吉鳳）

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] ??雷霽卿，吳文能，劉穎，等.貴州六盤水地區(qū)“紅陽”獼猴桃軟腐病病原菌分離鑒定及致病力差異測定［J］.北方園藝，2019，427（4）：31-38.

［2］ ?李黎，陳美艷，張鵬，等.獼猴桃軟腐病的病原菌鑒定［J］.植物保護(hù)學(xué)報，2016，43（3）：527-528.

［3］ ?張國輝，李榮玉，李明，等.黔東南州獼猴桃真菌病害種類和病原鑒定［J］.中國森林病蟲，2021，40（1）：11-18.

［4］ ?黎曉茜，龍友華，尹顯慧，等.茉莉酸甲酯處理對獼猴桃軟腐病菌作用機(jī)制及果實品質(zhì)的影響［J］.食品科學(xué)，2019，40（15）：239-248.

［5］ ?魏玲.檸檬醛對獼猴桃采后軟腐病的防治機(jī)理及保鮮效果研究［D］.南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

［6］ ??肖劉華，李樹成，吳帆，等.幾種外源物質(zhì)誘導(dǎo)采后獼猴桃果實抗葡萄座腔菌的效應(yīng)［J］.中國南方果樹， 2022，51（1）：4.

［7］ ?石浩.中藥提取物對獼猴桃軟腐病菌抑制分析及對果實防腐保鮮效果研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

［8］ ?Hawthorne B T，Rees-George J，Samuels G J.Fungi associated with leaf spots and post-harvest fruit rots of kiwifruit （Actinidia chinensis） in New Zealand［J］.New Zealand Journal of Botany，2012，20（2）：143-150.

［9］ ?李青芝，蔣亞濤，張莉娟，等.河南周口水果市場上獼猴桃軟腐病主要病原真菌鑒定及防治研究［J］.中國果樹，2020，202（2）：63-68.

［10］ ?Wang Y，Wang G M，Xu W Y，et al.Exogenous melatonin improves pear resistance to Botryosphaeria dothidea by increasing autophagic activity and sugar/organic acid levels［J］.Phytopathology，2022，112（6）：1335-1344.

［11］ 曉菲，徐政.植物源殺菌劑研究進(jìn)展［J］.南方農(nóng)業(yè)，2018，12（13）：40-42，45.

［12］ ?王帆帆，唐濤，郭杰，等.植物源殺菌劑對白術(shù)葉斑病菌的室內(nèi)毒力和田間防效［J］.中國植保導(dǎo)刊， 2020，40（9）：77-80.

［13］ ?高以宸，蔡瑾，王夢亮，等.紅蓼揮發(fā)油殺菌劑對馬鈴薯環(huán)腐病的防治效果［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué) ，2019，47（12）：2185-2188，2194.

［14］ Meena B，Muthusamy M.Fungi toxic properties of plant extracts against Sclertium rolfsii in jasmine ［J］.Journal of Omamental Horticulture（New Series），2002，5（1）：82-83.

［15］ 劉世江，趙琪君，丁怡，等.己唑醇與丁香菌酯對水稻紋枯病菌增效作用及其生化特性的影響［J］.農(nóng)藥，2021，60（3）：215-219.

［16］ 趙琪君，劉世江，丁怡，等.稻瘟病菌對丙環(huán)唑和醚菌酯的敏感性檢測［J］.農(nóng)藥，2019，58（6）：462-464，468.

［17］ 夏麗娟，任丹，萬莉.氟環(huán)唑與三環(huán)唑復(fù)配對水稻紋枯病和稻曲病的聯(lián)合生物活性及田間防效［J］.農(nóng)藥，2021，60（9）：682-686.

［18］ 賀民榮，王曉敏，田旭軍，等.鐵皮石斛終極腐霉對10種生物農(nóng)藥及其組合的敏感性［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2021，40（3）：42-47.

［19］ 張盈，黃文源，魏進(jìn)，等.小麥赤霉病禾谷鐮孢菌生物基增效劑的篩選［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（3）：47-54.

［20］ 楊波，姜彩鴿，宋雙，等.不同生物藥劑防治葡萄霜霉病菌的室內(nèi)毒力測定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（1）：137-140.

［21］ 梁魁景，于占晶，侯曉杰.5種殺菌劑對蘋果斑點落葉病菌室內(nèi)毒力測定［J］.河北果樹，2021，167（3）：16-17，19.

［22］ 魏玲.檸檬醛對獼猴桃采后軟腐病的防治機(jī)理及保鮮效果研究［D］.南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

［23］ 何立楠，石金巧，張榮全，等.戊唑醇與氨基寡糖素復(fù)配對獼猴桃軟腐病的防控效果［J］.世界農(nóng)藥，2021，43（10）：25-29，34.

Toxicity and Combined Effects of Three Herbal Extracts on Botryosphaeria dothidea of Kiwifruit

Tian Xujun，Liao Xun，Li Rongyu*，Li Ming，Wu Xiaomao，Long Youhua

（Institute of Crop Protection/Engineering and Technology Research Center of Kiwifruit，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：

The virulence of three herbal extracts against the soft rot fungus （Botryosphaeria dothidea） of kiwifruit and the combined effect of the mixture were determined by the mycelial growth rate method.The results showed that Sophora flavescens，Salvia miltiorrhiza and Scutellaria baicalensis showed some ?inhibitory effects on B.dothidea with EC50 of 60.44，60.78 and 97.86 μg/mL，respectively.S.baicalensis and S.flavescens showed potentiation at effective mass ratios of 1∶ 1，1∶ 3 and 1∶ 6，with CTCs of 133.16，126.16 and 129.56，respectively.The extract combinations of S.baicalensis-S.flavescens and S.baicalensis-S.miltiorrhiza all showed additive effects with CTCs ranging from 80.71 to 117.62.The results of this study may provide a reference for determining the combination of agents for the control of soft rot of kiwifruit.

Keywords：

Chinese herbs extracts; kiwifruit; Botryosphaeria dothidea; toxicity; combined effect