枯草芽孢桿菌Czk1 與化學殺菌劑復配對橡膠樹炭疽病和白粉病的防效測定

尹建行，賀春萍，梁艷瓊，李銳，張營,3

（1.貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；2.中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南 海口 571101；3.華中農業(yè)大學植物科學技術學院，湖北 武漢 430070）

橡膠樹“兩病”是橡膠樹炭疽病和白粉病的合稱，兩種病害?；旌习l(fā)生，是影響橡膠干膠產量的主要病害，給我國天然橡膠產業(yè)帶來了嚴重影響[1]。目前防治橡膠樹“兩病”的主要手段為化學防治，但因橡膠樹樹體高大導致施藥器械缺乏、化學藥劑用量大及藥劑殘留造成生態(tài)環(huán)境污染等問題，因此，亟待開發(fā)安全性高、效果好的新型藥劑。

利用生防菌和化學殺菌劑聯(lián)合防治植物病害能夠使生防和化防形成優(yōu)勢互補，既能減少化學藥劑的使用量[2]，減緩病原菌抗藥性的產生和對環(huán)境的污染[3]，又能促進生防菌的定殖和生防效果的穩(wěn)定性[4-6]，并且有些生防菌和化學殺菌劑還能相互促進，產生增效作用[7-9]。劉郵洲等[10]研究表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）sf628 與咪鮮胺錳鹽復配對番茄枯萎病防效為75.95%~79.41%。張艷麗[11]研究發(fā)現(xiàn)生防木霉菌（Trichoderma spp.）與化學殺菌劑復配對辣椒疫病的田間防效顯著優(yōu)于單施化學殺菌劑，而且能夠減少25%~32%雙炔酰菌胺和10%丁子香酚的使用量。楊秀榮等[12]研究表明，生防菌B579 與多菌靈復配對蔬菜苗期立枯病有較好防效。尹敬芳[13]探究表明生防細菌BS 與烯酰嗎啉可協(xié)同抑制辣椒疫霉病，減量50%的烯酰嗎啉與BS 復配后的防治效果和烯酰嗎啉單劑相當，并且還具有增效作用。以上研究表明，菌藥協(xié)同防治植物病害具有較好的應用前景。

目前對于橡膠樹“兩病”在生物防治和菌藥協(xié)同方面開展的研究較少，本實驗室前期通過室內毒力測定和盆栽試驗表明，枯草芽孢桿菌Czk1 與化學藥劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺復配后，對橡膠樹炭疽病菌具有較好抑制作用，并篩選出了防治橡膠樹炭疽病的最佳復配組合。在此基礎上，本研究開展菌藥最佳復配組合對橡膠樹炭疽病和白粉病的田間防治試驗，測定菌藥復配劑對橡膠樹“兩病”的防治效果，探討復配劑有無增效作用。以期為開發(fā)安全、高效的橡膠樹炭疽病和白粉病的菌藥復配使用技術提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

生防菌枯草芽孢桿菌Czk1 由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所熱帶特色經濟作物病害實驗室4℃低溫保藏；LB 液體培養(yǎng)基參照謝立等[14]方法；化學殺菌劑詳情見表1；ZWYR-D2403 型恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；3WF-3 型背負式噴霧噴粉機購自山東華盛中天機械集團；TSB-35（W）熱力煙霧機購自深圳市隆瑞科技有限公司；紫外分光光度計購自德國耶拿分析儀器股份公司。

表1 3 種化學殺菌劑Table 1 3 kinds of chemical fungicides

1.2 生防菌液的制備

用無菌牙簽挑取在LB 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)好的Czk1 菌株的單菌落，接入LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min 條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)12 h 即為生防菌Czk1菌液原液（OD600=2.137，菌液濃度=4.07 108cfu/mL）。

1.3 田間防效測定

試驗地點在海南省儋州市中國熱帶農業(yè)科學院試驗場7 隊，供試橡膠品種熱研7-33-97，橡膠種植年限4 年，田間驗證25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺和Czk1 單用和/或復配對橡膠樹炭疽病和白粉病的防治效果。復配劑各濃度按照體積比Czk1:25%丙環(huán)唑 戊唑醇為7:3 或Czk1:25%咪鮮胺為8:2 配制[15]。試驗隨機區(qū)組設計4 次重復，每小區(qū)10 株橡膠樹。試驗處理：（1）Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑高濃度（Czk1菌液50 倍液+25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液）；（2）Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑中濃度（Czk1 菌液100倍液+25%丙環(huán)唑 戊唑醇500倍液）；（3）Czk1+25%咪鮮胺復配劑中濃度（Czk1 菌液100 倍液+25%咪鮮胺1 000 倍液）；（4）Czk1+25%咪鮮胺復配劑低濃度（Czk1 菌液200 倍液+25%咪鮮胺1 500 倍液）；（5）25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液；（6）25%丙環(huán)唑 戊唑醇500 倍液；（7）25%咪鮮胺1 000 倍液；（8）25%咪鮮胺1 500 倍液；（9）Czk1 菌液50 倍液；（10）Czk1 菌液100 倍液；（11）Czk1 菌液200 倍液；（12）16%百菌清咪鮮胺 三唑酮熱霧劑250 mL/hm2；（13）水噴霧。各藥劑有效成分的濃度見表2。每處理4 次重復，于2021年3 月始見橡膠樹“兩病”后噴霧（煙），各處理藥液用量為1 000 L/hm2，按照每公頃噴施1 000 L 藥液計算殺菌劑和生防菌原液的用量，再加水定容至1000L/hm2。隔7 d 重復噴霧1 次。于第1 次施藥時調查記錄病情基數(shù)，第2 次施藥10 d后調查最終病情，并計算防效。橡膠樹炭疽病的分級標準如下[16]，0 級：葉片無病斑；1 級：葉片有少量病斑，病斑占葉面積1%~5%；2 級：葉片有較多病斑，病斑占葉片面積6%~15%；3 級：葉片病斑占葉片面積16%~25%以下，或病斑在古銅葉基部1/2內的主脈上；4級：葉片病斑占葉片面積26%~50%，或病斑在古銅期葉基部；5 級：葉片病斑占葉片面積50%以上，或葉片嚴重畸形，或落葉，或芽枯死。橡膠樹白粉病的分級標準如下[17]，0 級：無病斑；1 級：病斑面積占葉片總面積1%~5%；3 級：病斑面積占葉片總面積的6%~10%；5 級：病斑面積占葉片總面積的11%~15%，或葉片組織因病而輕度畸形；7 級：病斑面積占葉片總面積的16%~20%，或葉片因病而卷曲；9級：病斑面積占葉片總面積的20%以上，或葉片因病而嚴重卷曲。每小區(qū)隨機選取5 株橡膠樹，每株膠樹東、南、西、北方向各取1 蓬葉，每蓬葉隨機取5 片中間小葉（共100 片），進行病情基數(shù)調查。

表2 各處理藥劑的有效成分及濃度Table 2 The active ingredient and concentration of each fungicide

病情指數(shù)和防治效果計算公式為：

病情指數(shù)=∑（各級葉片數(shù) 級值）/（調查總葉數(shù)最高病級）100

防治效果[18]（%）=[1-（空白對照區(qū)藥前病情指數(shù)處理區(qū)藥后病情指數(shù)）/（空白對照區(qū)藥后病情指數(shù) 處理區(qū)藥前病情指數(shù)）] 100；

1.4 Horsfall法測定復配劑對橡膠“兩病”的協(xié)同能力

協(xié)同能力測定采用Horsfall 法并稍加改進，計算協(xié)同增效[13,19,20]。計算公式：

式中：IR 為增效比率；Eab 為混劑的實際防效；Eth為混劑的理論防效。Eth=單劑生防菌實際防效 配比中的百分率+化學殺菌劑實際防效 配比中的百分率。若IR>1，為增效作用；若IR<1，為拮抗作用；IR=1，為相加作用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件和Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，采用LSD 法進行數(shù)據(jù)間的多重比較。

2 結果與分析

2.1 復配劑對橡膠樹炭疽病的田間防治效果

試驗結果表明（表3），防治橡膠樹炭疽病效果最好的藥劑組合是Czk1+咪鮮胺復配劑中濃度，防效為75.18%；其次是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑高濃度、單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液、單劑25%咪鮮胺1 000 倍液和單劑Czk1 菌液50 倍液，防效分別是58.24%、53.11%、54.20%和51.95%，除Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配高濃度處理外，其余3 個處理均顯著低于Czk1+25%咪鮮胺復配劑中濃度的防效；Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑中濃度、Czk1+25%咪鮮胺復配劑低濃度、單劑25%咪鮮胺1 500 倍液和單劑Czk1 菌液100 倍液、200 倍液的防治效果與對照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮的差異并不顯著，防效分別為39.02%、35.99%、33.94%、42.55%、39.68%和25.57%；單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇500 倍液的防治效果最差，僅為10.38%，低于對照藥劑，但差異并不顯著。

表3 復配劑對橡膠樹炭疽病的防治效果Table 3 Control efficacy of compound of Bacillus subtilis and fungicides on anthracnose of rubber tree

2.2 復配劑對橡膠樹白粉病的田間防治效果

由表4 可知，防治橡膠樹白粉病效果最好的藥劑組合是單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇500 倍液和單劑25%咪鮮胺1 500 倍液，防效分別為82.11%和76.88%，兩者的差異不顯著；其次是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑中濃度，防效為71.34%；防治橡膠樹白粉病效果較好的是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑高濃度、Czk1+25%咪鮮胺復配劑中和低濃度，防效分別為59.54%、64.27%和59.51%，顯著優(yōu)于對照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮；單劑25%咪鮮胺1 000 倍液的防治效果和對照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮相當，分別為51.90%和51.18%；單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液、單劑Czk1 菌液50 倍液、100 倍液和200倍液的防治效果較差，顯著低于對照藥劑16%百菌清咪鮮胺 三唑酮，其中單劑Czk1 菌液100 倍液的防治效果最差，防效僅為27.66%，顯著低于其他處理。

表4 復配劑對橡膠樹白粉病的防治效果Table 4 Control efficacy of Bacilus subtilis and fungicides on powdery mildew of rubber tree

2.3 復配劑對橡膠樹“兩病”防治協(xié)同能力的影響

采用Horsfall 法分析復配劑對橡膠樹炭疽病和白粉病的協(xié)同防治增效作用。如表5 所示，除Czk1+25%咪鮮胺復配劑低濃度的處理組對橡膠樹炭疽病防治有拮抗作用外，其余復配劑處理組在防治橡膠樹炭疽病和白粉病時均具有增效作用。在橡膠樹炭疽病防治方面，增效作用最強的處理組是Czk1+25%咪鮮胺復配劑中濃度，增效比率為1.68；其次是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑中濃度和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑高濃度，增效比率分別為1.19 和1.11。在橡膠樹白粉病防治方面，增效作用最強的復配劑處理組是Czk1+25%咪鮮胺復配劑中濃度，增效比率為1.98；增效作用較強的處理組是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑高濃度和中濃度，增效比率分別為1.49 和1.62，而Czk1+25%咪鮮胺復配劑低濃度的增效作用稍弱?？傮w來看，Czk1+25%咪鮮胺復配劑中濃度和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑中濃度對橡膠樹兩種葉部病害的防治均具有較好的增效作用，而Czk1+25%咪鮮胺復配劑低濃度對橡膠樹“兩病”防治未有明顯增效作用。

表5 復配劑對防治橡膠樹炭疽病和白粉病的增效作用Table 5 Synergistic effect of compound on control of anthracnose and powdery mildew of rubber tree

3 討論

橡膠樹是典型的熱帶雨林多年生喬木，其所產天然橡膠是我國重要的戰(zhàn)略物質資源，然而天然橡膠的生產因受炭疽病和白粉病嚴重危害導致膠樹落葉、枝條枯死，推遲開割時間2~3 個月，嚴重影響了天然橡膠的產量和質量，有效防治以上兩種橡膠樹重要病害具有重大意義。目前，盡管利用化學防治的方法可對橡膠樹“兩病”進行有效的控制，但化學防治易造成病原菌產生抗藥性、殺菌劑用藥量大及生態(tài)環(huán)境污染等問題。近年來，利用生防菌與化學殺菌劑聯(lián)合防治植物病害的研究成為熱點[21-24]，但對橡膠樹病害進行菌藥協(xié)同防治的研究鮮見報道。本研究中的枯草芽孢桿菌Czk1 是由本實驗室從橡膠樹根部分離獲得[25]，其抑菌活性物質能較好抑制橡膠樹的炭疽病、白粉病和根病病原菌生長[26-28]，謝立等[15]研究化學殺菌劑與枯草芽孢桿菌Czk1 復配對橡膠樹炭疽病菌的抑制活性結果表明，Czk1 與化學殺菌劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺均具有較好的相容性，并且兩兩復配對橡膠樹炭疽病菌的抑菌活性具有明顯增效作用，但Czk1 與化學殺菌劑對橡膠樹病害的田間防治效果尚不明確，阻礙了其進一步開發(fā)和應用。因此，研究菌藥聯(lián)合對橡膠樹“兩病”田間作用的效果及機制，對于進一步推動生防菌與化學藥劑協(xié)同防治橡膠樹病害的應用具有較大意義?；谇捌谘芯拷Y果，本研究在田間評價了生防枯草芽孢桿菌Czk1 與化學殺菌劑協(xié)同對橡膠樹“兩病”防效的影響及其增效作用。菌藥協(xié)同對橡膠樹“兩病”田間防治試驗結果表明，與常規(guī)熱霧劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮的防效相比，兩種菌藥復配劑（Czk1+25%咪鮮胺和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇）對橡膠樹“兩病”的防效均有較大提高，其中Czk1+25%咪鮮胺復配劑的中濃度對橡膠樹炭疽病的防效達75.18%，比對照藥劑提高了49.61%；Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑的中濃度對橡膠樹白粉病的防效為71.34%，比對照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮提高了20.16%。生防細菌和殺菌劑聯(lián)合作用，為化學殺菌劑的減量施用提供了很好的途徑。Kondoh 等[29]報道利用枯草芽孢桿菌與減半化學殺菌劑復配，對西紅柿立枯病和梨果病害的防效比使用單劑高；姚克兵等[30]利用枯草芽孢桿菌與減半用量化學殺菌劑對草莓病害的防效優(yōu)于二者單用；謝立[31]研究表明枯草芽孢桿菌Czk1與25%咪鮮胺和25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配對橡膠樹炭疽病菌抑菌作用明顯優(yōu)于單劑，但未進一步進行田間試驗驗證。在本研究中，田間試驗結果顯示，對于橡膠樹炭疽病，枯草芽孢桿菌Czk1 與25%咪鮮胺、25%丙環(huán)唑 戊唑醇分別復配防治炭疽病的效果優(yōu)于兩種化學殺菌劑單用，與謝立[31]的研究結果相似；而對于橡膠樹白粉病，菌藥復配劑防治白粉病的效果略低于二者單用的中低濃度，與上述學者的研究結論不一致，可能與田間復雜的環(huán)境狀況、病害發(fā)生流行等多種因素有關。在Czk1+25%咪鮮胺復配劑和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復配劑中25%咪鮮胺和25%丙環(huán)唑 戊唑醇的占比分別為20%和30%，這意味著在25%咪鮮胺減量80%和25%丙環(huán)唑 戊唑醇減量70%的條件下，菌藥復配劑仍然有很好的防效，與韓麗等[32]的研究結論相似，說明本研究中的兩種菌藥復配劑具有很好開發(fā)成為新型藥劑的潛力，研究結果對當前橡膠樹“兩病”綠色防控具有重大指導作用。

通過Czk1 和25%咪鮮胺、25%丙環(huán)唑 戊唑醇分別復配后的田間防效測定，發(fā)現(xiàn)在防治橡膠樹“兩病”時出現(xiàn)了較強增效作用?？赡苁怯捎?5%咪鮮胺、25%丙環(huán)唑 戊唑醇的存在抑制或減少了其他病原微生物的競爭，導致葉圍上營養(yǎng)供給相對增加，提高了Czk1在橡膠樹體內存活率和定殖能力?？莶菅挎邨U菌Czk1是橡膠樹的內生菌[25]，其發(fā)酵液、抗菌提取物和揮發(fā)性物質都具有較強的抑菌活性，而且還能誘導橡膠樹產生系統(tǒng)性抗性，其定殖能力的增強有利于增加其發(fā)揮抗菌和防病促生能力[33]，這與邱雪迎等[34]的研究結果一致。

綜上所述，枯草芽孢桿菌Czk1 可分別與25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺復配，能有效地防治橡膠樹炭疽病和白粉病，而且菌藥復配對橡膠樹“兩病”防治具有明顯的增效作用，因此，Czk1 與25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺菌藥復配具備開發(fā)成為有效防治橡膠樹“兩病”的新型藥物的潛能。本研究為橡膠樹“兩病”綠色防控技術應用提供了參考依據(jù)，但關于Czk1與25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺復配對橡膠樹“兩病”防治的增效機理還需進行深入的研究。