植物乳桿菌的生理特性及影響其增殖的因素

馬翠柳，王金銘，袁偉濤，趙德輝，劉晗璐

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 長春 130112；2.河北科技師范學院，河北 秦皇島 066000；3.赤峰學院，內蒙古 赤峰 024000）

乳酸菌為當今益生菌生產應用中最廣泛的菌種，乳酸桿菌屬包含50 多個不同的物種，在乳酸菌中占據主要地位。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為其中一種乳酸桿菌，在生活生產中較易獲取，主要途徑有土壤、植物、乳制品、果汁、肉類和腸道等。不同來源的植物乳桿菌都可因其益生特性在生產中得到廣泛應用。植物乳桿菌耐受胃腸液的消化環(huán)境，可定植于腸道內，菌體存活率可接近100%。植物乳桿菌的抑菌能力在一定程度上可抵御腸道內致病菌的侵襲，間接提高機體免疫力；抑制食品中腐敗菌的生長，更有利于食品貯存。自身營養(yǎng)缺陷特性導致植物乳桿菌在生長過程中必須依靠生存環(huán)境提供的碳氮源，且菌體生長速度受發(fā)酵條件的影響較大。因此本文將主要綜述植物乳桿菌的生理特性以及影響其生長的因素，旨在為植物乳桿菌的研究和生產提供參考。

1 植物乳桿菌生理特性

植物乳桿菌是一類革蘭氏陽性厭氧或兼性厭氧、兼性異型發(fā)酵乳酸菌[1]，可在15 ℃條件下生長，在45 ℃以上不生長，最適生長溫度30~37 ℃。在pH 4.5~9.5生長，最適pH 為6.5 左右[2,3]。植物乳桿菌廣泛存在于自然界中，因其益生特性和安全性，常用于食品發(fā)酵、動物飼料、工業(yè)乳酸菌發(fā)酵和醫(yī)療保健等產業(yè)中[4]。不同來源的植物乳桿菌代謝過程中會產生不同的代謝物，主要為有機酸、小肽、細菌素、過氧化氫和蛋白酶等活性物質，可發(fā)揮抑菌作用，還可用于調節(jié)腸道菌群平衡、調節(jié)機體免疫功能及降低血清膽固醇含量等作用[5,6]。在研究植物乳桿菌的營養(yǎng)物質代謝過程中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌屬化能異養(yǎng)菌，生理系統(tǒng)缺少對多種化合物的合成能力，如糖類、氨基酸、生長因子和礦物質等，這類物質須從外界獲取[7]。

2 影響植物乳桿菌生長的因素

2.1 發(fā)酵底物的影響

2.1.1 氮源 氮源對植物乳桿菌的生長具有重要作用，菌體生長和代謝均需要氮源，主要用于菌體細胞壁（蛋白質、氨基酸）和代謝產物的合成[8]。植物乳桿菌對無機氮的分解利用率較低，因此，只能依賴一些富含氨基酸、肽類等小分子提供氮源。植物乳桿菌YM-4-3 可在不同氮源中培養(yǎng)，當檸檬酸銨作為單一氮源添加時，菌體代謝速度最快，且苯乳酸產量達到最大值[9]。酵母浸粉因在中性和酸性環(huán)境中熱穩(wěn)定較好，富含多種氨基酸，常被作為氮源用于培養(yǎng)基中[10]。劉利利等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同添加量的酵母浸粉也會對植物乳酸菌菌體生長產生影響，濃度為25 g/L 和35 g/L 時，菌體活菌數(shù)相當。但由于植物乳桿菌生理結構原因，酶體系較為簡單，無法合成多種氨基酸，僅添加酵母浸粉無法滿足氮源需求[12]。為進一步優(yōu)化氮源，促進植物乳桿菌生長，李景良等[13]在最佳單一氮源添加物的基礎上，探討了混合氮源的促生長效果，經多次試驗驗證得出最佳組合是酵母提取物10 g/L、蛋白胨10 g/L、檸檬酸三銨2 g/L。隨著研究的不斷深入，未來對乳酸菌適宜氮源的尋找和開發(fā)也一直是生產和科研的發(fā)展目標。

2.1.2 碳源 碳元素是構成細胞物質的基礎，也是培養(yǎng)基組成的主要成分，主要提供微生物生長繁殖所需能源、菌體合成所需的碳骨架及提供菌體合成目的代謝產物的原料；植物乳酸桿菌缺乏可分解大分子碳水化合物的酶系，所以常利用一些單糖來維持生長[9]。單糖無需分解，因此減少了菌體的能量消耗，進一步促進了植物乳桿菌的生長和繁殖；對一株具有強抑菌能力的植物乳桿菌進行培養(yǎng)基優(yōu)化，葡萄糖可作為植物乳桿菌最佳碳源，其菌體的生物量遠高于淀粉組和乳糖組，添加量為3% 時菌體密度達到最大[14]。在培養(yǎng)植物乳桿菌ATCC14917 過程用等量的低聚果糖代替葡萄糖，植物乳桿菌在低聚糖中的生長速率低于在葡萄糖中的生長速率。這可能是因為葡萄糖是一種單糖，最適合乳酸菌的生長[15]。大豆低聚糖由單糖基分子構成，同樣可以作為碳源添加在培養(yǎng)基；在植物乳桿菌ZPL001 培養(yǎng)過程中，添加比例為3%時，其體外促生長作用顯著優(yōu)于葡萄糖[16]。但也有研究表明，植物乳桿菌的碳源為蔗糖時可促進菌體的生長，且噴霧干燥后的活菌數(shù)明顯提高，可達4.2 109CFU/mL，表明植物乳桿菌也可以利用蔗糖作為碳源，此外蔗糖還可對抗干燥時所引起的高溫，保護菌體活性不受破壞，減少菌株在干燥保存過程中菌體量的損失[17]。對植物乳桿菌MDL1118[3]進行實驗室小規(guī)模擴大生產時，采用5%的蔗糖作為培養(yǎng)基的主要碳源，減輕了pH 對菌體生長的抑制作用，使7 h 靜止培養(yǎng)的活菌數(shù)達到3.18 109CFU/mL[18]。

2.1.3 碳氮總量 碳氮都是限制性底物，碳氮源總量多少和碳氮比例會影響著微生物細胞生長及發(fā)酵產物的合成[1]。碳氮比維持在一定范圍時，菌株生長情況較好；氮源過多會使微生物生長過快，容易導致細胞老化和自溶；碳源過多時會使培養(yǎng)環(huán)境偏酸性化，不利于微生物生長[19]。植物乳桿菌在原始培養(yǎng)基的基礎上維持4:6 的碳氮比不變，增加碳氮總量，菌體密度隨著總量的添加而增大，在7.5 倍時達到最大值[20]。

2.2 發(fā)酵條件的影響

2.2.1 培養(yǎng)溫度 溫度是保證各種酶活性的重要條件，一系列的酶促反應是微生物生命活動的基礎，適宜的溫度提供生長繁殖環(huán)境，促進微生物代謝產物的合成[17]。溫度過低，酶的活性受到抑制，酶促反應緩慢，導致菌體生長和代謝緩慢；溫度過高，會導致菌體蛋白變性，影響RNA和核糖體等大分子物質的正常代謝[21]。對于不同的植物乳桿菌菌株，培養(yǎng)溫度有一些差異。有研究表明，35 ℃是植物乳桿菌ZJ316 菌體生長的最佳溫度[22]。對植物乳桿菌LP-S2 培養(yǎng)時，在33~37 ℃時，菌液OD 值均保持在較高的濃度，但當培養(yǎng)溫度達到40 ℃和42 ℃時，菌液濃度顯著下降[23]。所以通常情況下植物乳桿菌的發(fā)酵溫度選擇為33~37 ℃。但在應用植物乳桿菌進行發(fā)酵生產時，根據發(fā)酵底物不同，選擇的發(fā)酵溫度不同，如在發(fā)酵椰奶時，發(fā)酵溫度為39℃[24]。利用植物乳桿菌R23 發(fā)酵蘋果酸時的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃，其產量是優(yōu)化前的2.3 倍[25]。目前對于高生產效率植物乳桿菌的低溫篩選和馴化也是科研和生產人員共同在研究探討的問題。

2.2.2 pH 植物乳桿菌的生長很大程度上取決于于酸性環(huán)境，當pH 大于7. 5 或小于4. 5 時，細菌生長緩慢或停止。生長過程中植物乳桿菌利用碳水化合物（主要指葡萄糖）產生大量乳酸[26]，菌體的生長代謝和乳酸的產生都會隨終產物——乳酸的積累而受到抑制[27]。由于各乳酸菌所適應的pH值環(huán)境有所差別，菌株對培養(yǎng)環(huán)境中氫離子濃度的適應能力也有一定的范圍。接種植物乳桿菌B23 時，pH 為7.0 時，活菌數(shù)最高，這個值也是MRS 培養(yǎng)基的自然pH[28]。將植物乳桿菌培養(yǎng)基置于不同pH，37℃下恒溫培養(yǎng)18h 后發(fā)現(xiàn)pH 為7.0~7.5 時活菌數(shù)最高[29]。適當?shù)乃嵝原h(huán)境壓力可以改變微生物的生物合成和新陳代謝[30]，在培養(yǎng)植物乳桿菌299 時，為減少鹽的產生，將pH 定為5.5。發(fā)酵BLPS-9 的最佳pH 為6，這兩種菌體培養(yǎng)pH 均低于MRS自然pH，但可以明顯提高菌體凍干存活率[31]。因此，對于不同菌株的pH 仍需通過實驗或生產實踐進行進一步驗證。

2.2.3 發(fā)酵時間 菌種發(fā)酵需要一定的時間，時間過短時活菌數(shù)不高；時間過長時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的水分流失增加，導致含水量下降，不利于菌體生長。Plackett-Burman 試驗結果中時間對植物乳桿菌LPL-1 菌株的發(fā)酵有顯著影響，發(fā)酵時間為32 h 時，最有利于菌體產細菌素[32]。通常情況下，細菌素生產與細菌生長同步，細菌素只在菌體生長時合成。植物乳桿菌B002 培養(yǎng)4 h后進入對數(shù)生長期，菌體快速生長繁殖，隨后進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)到20 h 時菌體密度達到最大值[33]。發(fā)酵時間可在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)生改變，植物乳桿菌200655 在培養(yǎng)24 h 與優(yōu)化前的時間縮短了2 h，因此對于不同菌株的具體培養(yǎng)時間，需要根據菌株特點進行進一步確定。

2.2.4 接種量 接種量的大小是決定菌種在發(fā)酵過程中的生長繁殖速度的關鍵，相對較大的接種量會促進菌體發(fā)酵，減少雜菌污染；但是接種量過大時菌體生長過快，導致衰老細胞增加，發(fā)酵后勁不足；過低的接種量會延長遲緩期，增加發(fā)酵周期，也更易污染雜菌[23]。不同的接種量會影響菌株的生長代謝，找到適合的接種比例與生產過程中活菌數(shù)的多少呈直接關聯(lián)性[28]。關秀艷等[34]對植物乳桿菌LP1103 的接種量進行處理分析時發(fā)現(xiàn)，不同的接種量對活菌數(shù)的影響呈曲線分布，菌體活菌數(shù)在接種量為5% 時達到最高。但對變異菌株植物乳桿菌P1881 進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其接種量為4%時，菌株生長性能最佳，且代謝產物苯乳酸的產量顯著性增加[35]。

2.2.5 接種的菌齡 每種菌株生長速度不同，因此最適菌齡也不同。菌株過嫩，會導致生物量太少，微生物生長緩慢；培養(yǎng)時間過長，菌種老化，培養(yǎng)基失水嚴重，菌種干縮，活力下降，也會影響菌種的生長[17]。試驗發(fā)現(xiàn)菌齡為6 h時，菌株經干燥后的發(fā)酵活菌數(shù)值較低，但菌齡為8 h 時，干燥后活菌數(shù)較6 h 增加0.65 倍。植物乳桿菌在辣椒汁發(fā)酵培養(yǎng)基中菌齡為21 h，發(fā)酵周期為27 h，活菌數(shù)可以達到4.9 1010CFU/mL[36]。

2.2.6 液態(tài)發(fā)酵裝液量 裝液量不同對菌株的生長也有較大影響。植物乳桿菌LP-S2 菌體濃度在不同裝液量下差別較大：于35 mL 容器中進行發(fā)酵，裝液量為10 mL時菌體濃度達到最大值；隨著裝液量的增加，菌體濃度逐漸降低[37]。主要因為裝液量對培養(yǎng)基的溶氧有影響，裝液量增加，培養(yǎng)基內溶氧量升高，促使酶活性提高，從而導致營養(yǎng)物質過多消耗，影響菌體正常生長[38]。

2.2.7 固態(tài)發(fā)酵裝料量 固態(tài)發(fā)酵時，固態(tài)培養(yǎng)基的質量會影響菌株生長環(huán)境中的空氣含量、水分含量，進而影響菌體對營養(yǎng)的利用與吸收；為避免固體發(fā)酵培養(yǎng)基攪拌不均勻，對裝料量進行了試驗比對，實驗結果表明，400 mL 的罐頭瓶中添加40 g 固體發(fā)酵培養(yǎng)基有利于乳酸菌的生長，高度約為4 cm[23]。但在生產實踐中，具體的發(fā)酵裝料量需根據生產容器體積、裝料量和接種體積等具體確定。

2.2.8 生長因子 通過固態(tài)發(fā)酵純培養(yǎng)植物乳桿菌的研究相對較少，原因在于植物乳桿菌的穩(wěn)定性較差，干燥后菌體失活率較高，研究難度大；需要在培養(yǎng)基中加入一定量的生長因子后，通過固態(tài)發(fā)酵獲得較高的生物量[23]。微生物生長所需的生長因子包括維生素、氨基酸、嘧啶和嘌呤；植物乳桿菌YSQ 添加300mL/L 的番茄汁，其細胞生長速度和菌落總數(shù)增加，可能是番茄汁中含有維生素和有機酸，促進乳酸菌的生長[39]。熊濤等[40]在研究中發(fā)現(xiàn)添加質量分數(shù)同為0.5%的番茄汁、玉米漿和維生素C 3 種生長因子，番茄汁促進菌體生長的效果最佳。邴狄祥等[41]發(fā)現(xiàn)采用1.0% 的番茄粉和0.5% 的菊粉作為復合促生長因子，其菌體數(shù)高達137 108CFU/g，大約是單獨添加這兩種因子的2 倍。有研究證明菊粉中的水溶性纖維可促進短鏈脂肪酸的產生，更有利于菌體的生長[42]。

2.2.9 中和劑 植物乳桿菌在生長過程中會產生大量乳酸及其他一些酸性物質，雖然適宜的酸性條件會促進菌體生長，但隨著菌體的生長繁殖，會導致酸性物質積累過多，從而會阻礙乳酸菌生長，導致培養(yǎng)基中活菌數(shù)降低[9]。植物乳桿菌在高密度培養(yǎng)過程中會產生大量的有機酸，為緩解環(huán)境中的酸抑制作用，延長菌體的生長期，通常會在菌體對數(shù)生長末期補料時向培養(yǎng)基中添加一定量的中和劑，將pH 調至7. 0 左右[11]。但在酸奶發(fā)酵過程中，選取2%磷酸氫二鈉+磷酸二氫鈉作為最佳緩沖劑體系，并在培養(yǎng)13 h 開始每隔2 h 添加一次的情況下，最有利于菌體生長[43]。發(fā)酵植物乳桿菌ZJ316 時同樣選用了磷酸氫二鈉+磷酸二氫鈉作為緩沖鹽，但發(fā)酵后的菌體濃度明顯不如添加量為0.12 mol/L磷酸氫二鈉+檸檬酸緩沖劑組合[44]。分析其可能原因是ZJ316 常用于生產細菌素，其過程中產生大量酸性代謝物，增強了菌體酸性環(huán)境[45]，而檸檬酸的氧化能力較強，在氧化過程中會有堿性物質產生，使菌液pH 上調速度更快，從而促進菌體的生長[46]。

2.2.10 水蘇糖 水蘇糖是自然界存在的一種益生元，屬-低聚半乳糖，通過產生乳酸、乙酸和短鏈脂肪酸等酸性物質，降低腸道pH，來達到抑制腸道病原菌生長繁殖的效果，同時誘導合成促細胞分裂素，促進益生菌的增殖。有研究表明，乳糖作為碳源發(fā)酵4 h添加0.6%水蘇糖，植物乳桿菌RB1 增殖效果最佳；優(yōu)化發(fā)酵條件前，RB1 活菌數(shù)為2.19 109CFU/mL；優(yōu)化后，發(fā)酵液中RB1 活菌數(shù)為1.86 1010CFU/mL，接近優(yōu)化前活菌數(shù)的10 倍[47]。

2.2.11 超聲波 發(fā)酵前期乳酸菌數(shù)量快速增加，發(fā)酵中后期乳酸菌數(shù)量趨勢變得緩慢甚至下降；合適的低強度超聲處理可加速微生物細胞生長，促進次級代謝產物的生成，發(fā)酵液pH 快速下降[48]。經過25 w/L 和30 w/L 超聲處理的發(fā)酵液在36 h 中植物乳桿菌的數(shù)量達到1.7 108CFU/mL 和1.9 108CFU/mL，明顯高于對照組（4.0 107CFU/mL）[49]。

3 展望

不同發(fā)酵底物和條件下所獲得的菌體量及代謝產物大不相同，不斷優(yōu)化發(fā)酵條件是提高菌株在發(fā)酵、飼料等行業(yè)中應用的關鍵。但由于不同來源的植物乳桿菌其生長特性或代謝產物有所差別，其影響因素在發(fā)酵過程中對量的需求有所變化，在生產過程中要注意根據菌體的生長需求將發(fā)酵條件調整到最佳適宜量，將菌體的擴大再生產達到最大化，并減少因控制量不明確而導致的資源浪費。為此，我們常在篩選影響菌體生長因素過程采用單因素試驗，將培養(yǎng)基成分確定后結合Plackett-Burman 試驗設計、中心優(yōu)化組合、響應面法及CCD試驗設計綜合考慮各因素及其交互作用，進一步確定培養(yǎng)基各成分的最佳添加水平。目前來看，大多優(yōu)化方案結合以上幾種試驗設計來達到促進菌體增殖的效果，使得植物乳桿菌在畜牧、食品加工、醫(yī)療等行業(yè)的應用更加廣泛。