甜菊糖苷的性質(zhì)、提取、分離與結(jié)構(gòu)鑒定研究現(xiàn)狀

◎ 韓羽彤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083）

甜菊糖苷是從菊科植物甜葉菊葉片中提取的一種糖苷，屬于二萜苷，自然界中存在的糖苷類一般是無(wú)味的，但甜菊糖苷的甜度是蔗糖的250 ～300 倍，具有低熱量、高甜度等特點(diǎn)，可以作為天然甜味劑。研究表明，除了可以作為甜味劑外，甜菊糖苷還具有降血壓、抗癌和抗菌等功效[1]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)人體健康的關(guān)注與日俱增，甜菊糖苷作為一種功能性糖苷類具有良好的市場(chǎng)前景。本文對(duì)甜菊糖苷的性質(zhì)、提取、分離與結(jié)構(gòu)鑒定等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，并展望了未來(lái)研究的方向，為甜菊糖苷的合成及其在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 甜菊糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

甜菊糖苷屬于四環(huán)二萜類化合物，包括甜菊苷、萊鮑迪甙A（Reb A）、萊鮑迪甙B（Reb B）、萊鮑迪甙C（Reb C）、萊鮑迪甙E（Reb E）、萊鮑迪甙F（Reb F）、甜茶苷、杜克苷和甜菊雙糖苷等，這些甜味成分具有相同的苷元——甜菊醇（圖1），其碳十三位槐糖基是主要功能基，碳十九位酯基為助味基，這兩個(gè)位點(diǎn)上連接數(shù)量不等的葡萄糖基、鼠李糖基或木糖基，形成味質(zhì)、理化性能各異的甜菊糖苷。

圖1 甜菊醇苷元結(jié)構(gòu)圖

甜菊糖苷純品為白色結(jié)晶性粉末，分子式為C38H60O18，熔點(diǎn)是198 ℃，易溶于水，還可溶于甲醇、乙醇、四氫呋喃，但不溶于苯、醚、氯仿等有機(jī)溶劑，有較好的耐熱性和穩(wěn)定性，見(jiàn)光不易分解[2]。甜菊糖苷耐鹽性好，無(wú)美拉德褐變，不被微生物同化和發(fā)酵，因此可延長(zhǎng)其制品的保質(zhì)期。

2 甜菊糖苷的提取與分離

2.1 甜菊糖苷的提取

甜菊糖苷的傳統(tǒng)提取方法有浸漬法、溶劑提取法等。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，研究人員改良優(yōu)化了傳統(tǒng)的提取方法，開(kāi)發(fā)出超聲波提取法和微波輔助提取法等新型提取法。

2.1.1 溶劑提取法

甜菊糖苷易溶于水和醇，采用溶劑提取法時(shí)選用的提取劑多為水和乙醇，其具體的做法為浸提法、煎煮法等。浸提法生產(chǎn)周期長(zhǎng)、工藝較為復(fù)雜；煎煮法的生產(chǎn)周期短、工藝操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)品質(zhì)量較優(yōu)。隨著社會(huì)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，研究人員對(duì)甜菊糖苷的溶劑提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。陳虎等[3]采取壓榨萃取方式提取甜菊糖苷，該工藝具有萃取時(shí)間短、萃取效率高的特點(diǎn)。俞堅(jiān)[4]采取加壓溶劑法萃取甜菊糖苷，具有效率高、設(shè)備易于操作和低污染的優(yōu)點(diǎn)，符合當(dāng)前甜葉菊萃取物現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的發(fā)展方向。

2.1.2 新型提取法

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，甜菊糖苷的新型提取方法逐漸被發(fā)掘出來(lái)，包括超聲波提取法和微波輔助提取法。其中，超聲波能使植物細(xì)胞壁破裂，其中的生物活性物質(zhì)被釋放提取，具有提取率高、操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短及有效成分破壞少等優(yōu)點(diǎn)，有很好的發(fā)展前景。鐘利葉等[5]通過(guò)正交試驗(yàn)研究甜菊糖苷的超聲波法最佳提取工藝條件，用蒽酮比色法進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在料液比為1 ∶60（g ∶mL）、超聲時(shí)間為60 min、超聲功率為150 W、超聲溫度為55 ℃、提取3 次的條件下，甜菊糖苷提取率為27.32%，提取率高，成本低。

微波輔助提取法是通過(guò)樣品及溶劑中的偶極分子在高頻微波能作用下的提取方法，該方法具有時(shí)間短、提取率高、設(shè)備簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣以及低污染的優(yōu)點(diǎn)。俞堅(jiān)等[6]用響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，研究最佳微波輔助提取甜菊糖苷的工藝條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微波輔助提取甜菊糖苷工藝除了提取液料比的選擇外，提取時(shí)間和微波功率也至關(guān)重要。如果提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)增加甜葉菊中水溶性物質(zhì)和其他雜質(zhì)的溶解，還會(huì)增加微波設(shè)備的維護(hù)成本；如果提取功率太高，高能量產(chǎn)生的瞬時(shí)高溫會(huì)導(dǎo)致糖苷類化合物降解或部分降解。

2.2 甜菊糖苷的分離純化

隨著甜菊糖苷分離檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)共發(fā)現(xiàn)35種不同結(jié)構(gòu)的甜菊糖苷，包括異甜菊醇的糖基化產(chǎn)物及其同分異構(gòu)體和8 種甜菊醇，它們有相似的框架，但不同位點(diǎn)添加了不同數(shù)目和類型的糖基。糖基數(shù)目和種類的差異是造成不同糖苷的口感和甜度差異的主要原因。甜菊糖苷的分離純化方法有重結(jié)晶法、色譜法和離子交換樹(shù)脂法等，以上多種方法也常常在一個(gè)甜菊糖苷提取工藝中綜合使用。例如，趙聰敏等[7]將中壓色譜與重結(jié)晶法結(jié)合，達(dá)到分離甜菊糖苷的目的，為甜菊糖結(jié)晶母液開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。劉宗林等[8]將離子交換樹(shù)脂法與重結(jié)晶法結(jié)合對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行分離純化，建立了具有工業(yè)化發(fā)展前景的甜菊糖苷純化工藝。

2.2.1 重結(jié)晶法

重結(jié)晶法主要根據(jù)甜菊糖苷中的甜葉菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C 等在甲醇與水混合溶液中的溶解度存在差異而進(jìn)行分離，通過(guò)調(diào)整混合溶液中甲醇和水的比例或加入其他的溶劑，使甜菊糖苷中的主要組分純化分離。

2.2.2 薄層色譜法

薄層色譜是用涂布于支持板上的支持物作為固定相，用合適的溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)混合樣品分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)，該技術(shù)已被廣泛用于甜葉菊中各種苷類物質(zhì)的分離、鑒別和含量測(cè)定。例如，周瑩婷等[9]創(chuàng)新式地篩選理想的薄層色譜展開(kāi)劑[（氯仿∶甲醇∶水=65 ∶35 ∶10 下層液，1 mL 甲酸）與（正丁醇∶醋酸∶水=4 ∶1 ∶5 上層液）]，建立二維垂直展開(kāi)方法，可以實(shí)現(xiàn)4 種甜菊糖苷的有效分離鑒定。

2.2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。孫蕊等[10]研究使用高效親水液相色譜分離組分，采用紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，在確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和色譜柱壽命的同時(shí)，可以大量測(cè)定甜菊糖苷的含量，樣品前處理簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)、可移植性好。

2.2.4 離子交換樹(shù)脂法

離子交換樹(shù)脂法是利用交換劑與溶液中的離子發(fā)生交換進(jìn)行分離的方法。該法分離效率高、應(yīng)用范圍廣、再生處理方便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于純化和分離甜菊糖苷。

3 甜菊糖苷的結(jié)構(gòu)鑒定

甜菊糖苷的結(jié)構(gòu)鑒定需要色譜法、質(zhì)譜法和核磁共振法等多種手段聯(lián)合使用。在分離純化樣品后，對(duì)于不同種類的甜菊糖苷，可以用薄層色譜、高效液相色譜法等多種柱層析色譜進(jìn)行分離鑒定，隨后利用質(zhì)譜法、核磁共振法等方法確定分離得到的各成分結(jié)構(gòu)。

3.1 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按質(zhì)荷比進(jìn)行分離后進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)出離子準(zhǔn)確質(zhì)量，確定離子的化合物組成。一般的液相色譜法可以很好地分離不同的甜菊糖苷，但其紫外檢測(cè)設(shè)備吸收光僅在200～300 nm，對(duì)于某些甜菊糖苷的檢測(cè)靈敏度較差，而質(zhì)譜儀具有較高的檢測(cè)靈敏性，可以解決這一問(wèn)題。朱靜雯等[11]利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)多種甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品和“鑫豐3 號(hào)”甜葉菊葉片粗提物進(jìn)行分析測(cè)定，確定了不同甜菊糖苷的出峰時(shí)間和順序，獲得更多種類的甜菊糖苷紫外檢測(cè)圖譜，完善了甜菊糖苷測(cè)定的研究，為進(jìn)一步研究甜葉菊及甜菊糖苷提供了理論依據(jù)。

呂博等[12]建立了一種利用電噴霧質(zhì)譜法鑒定甜葉菊中甜菊糖苷類結(jié)構(gòu)的方法，與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不同，該方法可以在多種混合物中快速檢測(cè)出其中的糖苷成分，得出較為完整的結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)這些信息能夠快速確定出糖苷結(jié)構(gòu)，不需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理。該方法為研究甜菊糖苷及衍生物的結(jié)構(gòu)修飾和代謝反應(yīng)提供了極有價(jià)值的信息。

3.2 核磁共振法

核磁共振法是利用波長(zhǎng)為10 ～100 nm 的電磁波照射樣品，研究處于強(qiáng)磁場(chǎng)中的原子核對(duì)射頻輻射的吸收進(jìn)而獲得有關(guān)化合物分子結(jié)構(gòu)信息的分析方法。該方法通常與薄層色譜和質(zhì)譜法等方法進(jìn)行聯(lián)用，楊全花[13]在分離多種甜菊糖苷后，用薄層層析色譜法確定化合物的純度，質(zhì)譜法確定其分子量，核磁共振法確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，成功對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。莊昊儒[14]用AuCl3-叔丁腈催化體系高立體選擇性地構(gòu)建β-糖苷鍵，制備瑞鮑迪苷A家族的甜菊糖苷天然產(chǎn)物，同時(shí)用核磁共振法確定產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為甜菊糖苷類化合物的合成提供依據(jù)。

4 展望

近年來(lái)，低糖健康的飲食理念獲得了人們的廣泛關(guān)注，因此高甜度、低熱量的甜菊糖苷因?yàn)槠渚薮蟮膽?yīng)用價(jià)值和廣闊開(kāi)發(fā)前景，逐漸成為研究熱點(diǎn)。

在甜菊糖苷的提取分離與純化方面，研究的趨勢(shì)是對(duì)提取分離方法的不斷改良，以達(dá)到提高提取率、降低成本等目的。例如，陳虎等[3]改進(jìn)傳統(tǒng)的溶劑提取方法；鐘利葉等[5]開(kāi)發(fā)新的超聲波提取法方法；趙聰敏等[7]將多種改進(jìn)的提取方法聯(lián)合使用，探究最適宜的提取條件。在結(jié)構(gòu)鑒定方面，同樣運(yùn)用質(zhì)譜法等多種方法，不斷優(yōu)化鑒定方法，如呂博等[12]對(duì)質(zhì)譜法進(jìn)行改進(jìn)，建立電噴霧質(zhì)譜法鑒定甜菊糖苷類結(jié)構(gòu)的方法。但從植物中提取天然的甜菊糖苷受到作物生長(zhǎng)周期、甜菊糖苷含量的限制和提取率的限制，隨著對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究，甜菊糖苷的生物合成逐漸成為研究的重點(diǎn)，其產(chǎn)量的提高也成為未來(lái)的研究發(fā)展方向。

此外，隨著甜菊糖苷被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，其甜味成分的研究也可能成為未來(lái)發(fā)展方向。在甜菊糖苷化合物中，甜葉菊苷和萊苞迪甙A 的含量占比大且甜度高，但萊鮑迪苷C 帶有一定的后苦味道，影響甜菊糖苷的味質(zhì)。在最新的研究中，郝志林等[15]利用增甜型酵母抽提物中的游離氨基酸、5'-核苷酸等成分增強(qiáng)甜菊糖苷的甜味感知；邢琳琳等[16]研究大豆分離蛋白-大豆多糖體系對(duì)甜菊糖苷苦味的抑制效果。未來(lái)，研究人員將通過(guò)研究多種生物化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行改性，進(jìn)一步提高甜菊糖苷的感官品質(zhì)。