基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實驗驗證探討黃連素治療非酒精性脂肪性肝炎的作用機(jī)制

黃燕萍，伍月蘭，孫明瑜1，，張 琴

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院（上海 201203）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院（上海 200336）；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)（上海 201203）

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是由多種因素導(dǎo)致的肝臟疾病，其特征為肝細(xì)胞脂肪變性和肝細(xì)胞損傷，伴或不伴肝纖維化，與心腦血管疾病、肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。NASH的發(fā)病是多種病理過程共同作用的結(jié)果，如脂毒性、氧化應(yīng)激、免疫細(xì)胞調(diào)控失常、肝細(xì)胞凋亡，涉及多個靶點，最終導(dǎo)致肝免疫細(xì)胞浸潤和炎癥，肝星狀細(xì)胞激活［1-3］。臨床首選生活方式干預(yù)治療本病，但多數(shù)患者無法從中獲益，需采用藥物治療。然受限于“一種基因，一種藥物，一種疾病”思維，臨床尚無合適的單一藥物治療本病，因此具有實質(zhì)藥理活性的多靶點天然產(chǎn)物具有潛在優(yōu)勢［4］。

黃連素對糖脂代謝有獨特的藥理作用，如抗氧化、抗炎、肝細(xì)胞保護(hù)，可有效治療糖尿病、脂肪肝，臨床應(yīng)用廣泛［5-9］，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)、體外細(xì)胞實驗探討黃連素治療NASH 的潛在機(jī)制，以期為黃連素的臨床應(yīng)用及NASH的防治研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分的收集與篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）［10］獲取黃連素的藥代動力學(xué)參數(shù)，以及吸收、分布、代謝和排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME）特征性信息［11-12］。

1.2 潛在靶點的預(yù)測 通過比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD，http：//ctdbase.org/）［13］篩選黃連素的候選靶基因，設(shè)置閾值化學(xué)-基因相互作用≥1，并去除非人源基因。在人類基因綜合數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.genecards.org）中搜索“non-alcoholic steatohepatitis”以獲得NASH 相關(guān)基因。借助Bioinformatics 工具獲得黃連素靶基因與NASH 相關(guān)基因的交集，即為黃連素靶向NASH的基因。

1.3 “黃連素-目標(biāo)基因-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 使用Cytoscape v3.6.1 軟件（https：//www.nigms.nih.gov/）構(gòu)建“黃連素-目標(biāo)基因-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因互作網(wǎng)絡(luò)分析 將靶基因?qū)隚eneMANIA（http：//www.genemania.org）和String（https：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫，分析黃連素作用于NASH 的相關(guān)基因，探討基因互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系并得到網(wǎng)絡(luò)中的hub基因。

1.5 靶點的通路分析 借助WebGestalt（http：//www.webgestalt.org）數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行基因本體（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因探針（GSEA）通路富集分析［14］。

1.6 分子對接 使用webina 數(shù)據(jù)庫（https：//durrantlab.pitt.edu/webina/）［15］進(jìn)行分子對接，上傳PDB 格式的候選基因的晶體結(jié)構(gòu)和黃連素MOL2格式信息至webina，相關(guān)參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值，用于分析黃連素與多種蛋白的結(jié)合潛力。

1.7 體外細(xì)胞實驗驗證

1.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 小鼠正常肝細(xì)胞（AML12）購自美國菌種保藏中心（ATCC）（批號：CRL-2254），采用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.7.2 藥物與試劑 黃連素，美國TargetMol 公司（批號：T4S0797）；DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，中國中喬新舟生物科技有限公司（批號：ZQ-606）； 二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma-Aldrich公司（批號：C6164-50ML）；TRIzol，生工生物工程（上海）股份有限公司（批號：B511311-0100）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒，日本Takara株式會社（批號分別為RR047B、RR820B）。

1.7.3 主要儀器 PCR 熱循環(huán)儀（型號：A24811）、實時熒光定量PCR 儀（型號：A31665），美國Thermo Fisher公司。

1.7.4 細(xì)胞分組與干預(yù) AML12 細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后傳代培養(yǎng)于含有棕櫚酸（PA）200 μmol/L 的培養(yǎng)基中，設(shè)為模型組；在此基礎(chǔ)上，給予梯度濃度的黃連素（6.25、12.5、25、50 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)，分別設(shè)為黃連素6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L 組；另取AML12 細(xì)胞培養(yǎng)于不含PA 的正常培養(yǎng)基中，正常培養(yǎng)不予處理，設(shè)為空白組。各組均培養(yǎng)誘導(dǎo)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.7.5 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTqPCR）法檢測相關(guān)基因表達(dá) 取適量AML12 細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至EP 管中，加入TRIzol 提取總RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測各組AML12 細(xì)胞中前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、CC趨化因子配體2（CCL2）和Toll 樣受體4（TLR4）mRNA 的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s；40 個循環(huán)。擴(kuò)增引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列見表1。各組均設(shè)3 個復(fù)孔。以2-ΔΔCt法表示PTGS2、CCL2和TLR4mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有分析均使用所用工具的默認(rèn)值進(jìn)行。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。CTD 的查詢結(jié)果中僅顯示得分≥1 的預(yù)測候選目標(biāo)蛋白。所有報告的P值均為雙尾，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連素的藥代動力學(xué)特性 借助TCMSP 共得到黃連素的12種AMDE特性。見表2。

表2 黃連素的藥理和分子特性

2.2 潛在靶點的預(yù)測 借助CTD 數(shù)據(jù)庫篩選黃連素的靶基因，去除非人源基因后，共得到250 個黃連素作用的靶基因。借助GeneCards 數(shù)據(jù)庫共得到NASH 相關(guān)基因501 個。通過Bioinformatics 工具獲得黃連素靶基因與NASH 相關(guān)基因的交集，即為黃連素靶向NASH的基因，主要包括炎癥因子及轉(zhuǎn)錄因子。見表3、圖1。

圖1 黃連素治療非酒精性脂肪性肝炎（NASH）靶點

表3 黃連素靶向非酒精性脂肪性肝炎的基因（度數(shù)前10者）

2.3 “黃連素-目標(biāo)基因-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 根據(jù)目標(biāo)和途徑分析，我們借助Cytoscape v3.6.1 軟件構(gòu)建了“黃連素-目標(biāo)基因-通路”網(wǎng)絡(luò)，包括65 個節(jié)點和217個邊緣。見圖2。

圖2 “黃連素-目標(biāo)基因-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 基因互作網(wǎng)絡(luò)分析 將靶基因?qū)隚eneMANIA，發(fā)現(xiàn)37.05%的基因具有物理相互作用，20.16%發(fā)揮了共定位作用，19.43%具有相似的共表達(dá)特性，其他還有相關(guān)途徑、共有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和遺傳相互作用。見圖3。

圖3 基因互作網(wǎng)絡(luò)

將靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫（PPI得分>0.7）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)由84 個交互節(jié)點和517 個交互邊緣組成（見圖4）。本研究選取了度數(shù)最大的10 個節(jié)點作為關(guān)鍵基因，分別是白介素-10（IL-10）、PTGS2、血紅素加氧酶1（HMOX1）、CCL2、重組人白介素8（CXCL8）、TLR4、JUN 原癌基因（JUN）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素-6（IL-6）。見圖5。

圖4 黃連素治療非酒精性脂肪性肝炎的靶點基因互作網(wǎng)絡(luò)示例

圖5 黃連素治療非酒精性脂肪性肝炎的靶基因

2.5 靶點的通路分析 如圖6 所示，GO 分析富集在前面的功能分別是炎癥反應(yīng)（GO：0006954）、外部刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)（GO：0032101）、蛋白質(zhì)代謝過程的負(fù)調(diào)控（GO：0051248）、壓力反應(yīng)的調(diào)節(jié)（GO：0080134）、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程的負(fù)調(diào)控（GO：0032269）、免疫系統(tǒng)過程的調(diào)控（GO：0002682）、分子功能正調(diào)控（GO：0044093）、防御反應(yīng)（GO：0006952）、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控（GO：1902531），這些功能性術(shù)語與脂代謝、抗炎反應(yīng)高度相關(guān)。

圖6 黃連素治療非酒精性脂肪性肝炎靶點的GO富集分析

KEGG 通路分析顯示，靶基因顯著富集在AGERAGE 糖尿病并發(fā)癥的信號通路（hsa04933）及非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）（hsa04932）、胰島素抵抗（hsa04931）、動脈粥樣硬化的流體剪切力（hsa05418）、乙型肝炎（hsa05161）等通路。NASH 的主要病理是肝細(xì)胞脂肪變和炎癥，伴有肝細(xì)胞的壞死和炎癥細(xì)胞浸潤。上述生物學(xué)過程或病理變化可能參與NASH 的致病，而這些病理變化可采用黃連素進(jìn)行治療。見圖7。

圖7 黃連素治療非酒精性脂肪性肝炎靶點的KEGG通路分析

2.6 分子對接 上傳黃連素的MOL2結(jié)構(gòu)信息至webina，用于分析其與IL-10、PTGS2、HMOX1、CCL2、CXCL8、TLR4、JUN、MMP9、TNF、IL-6的結(jié)合潛力。結(jié)果表明，黃連素與TLR4、CCL2、MMP9、CXCL8蛋白之間存在強(qiáng)相互作用，提示黃連素對NASH具有治療作用。見圖8。

圖8 分子對接示意圖

2.7 體外細(xì)胞實驗驗證 體外細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組PTGS2、CCL2和TLR4mRNA 表達(dá)升高（P<0.01）；與模型組比較，黃連素各劑量組PTGS2、CCL2和TLR4mRNA 表達(dá)降低（P<0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴趨勢。見圖9。

圖9 黃連素對小鼠正常肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

NASH 是造成肝臟損傷、肝臟不良結(jié)局的常見疾病，近年來其患病率呈不斷上升趨勢［16］。深入了解疾病的病因和發(fā)病機(jī)制十分必要，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥多成分、多途徑和多靶點的作用機(jī)制研究提供了參考［17］。藥代動力學(xué)特性是藥物最重要的特征［18］，Lipinski 的5條規(guī)則認(rèn)為，滿足分子量介于180～500 Da、油水分配系數(shù)<5、氫鍵供體<5、氫鍵受體<10 的化合物更具有可藥性［19］。我們從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得了黃連素的12個非常重要的藥代動力學(xué)特性，滿足Lipinski 規(guī)則，這意味著黃連素治療NASH具有一定的前景。

在藥物開發(fā)中，目標(biāo)基因鑒定是第一步。本研究共鑒定出與NASH 相關(guān)的基因501 個，匹配后得到與黃連素靶點重疊的基因84 個。GeneMANIA 可以提供有關(guān)物理相互作用、共定位、共表達(dá)以及共有蛋白結(jié)構(gòu)域的信息，由此提示靶標(biāo)及其相互作用蛋白可能具有相同或相似的功能。為了更深入地了解黃連素對NASH的影響，我們對靶基因進(jìn)行了GO 功能分析和KEGG 通路富集分析。GO 分析結(jié)果表明，黃連素靶基因主要與炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)過程、代謝過程的負(fù)調(diào)控及免疫系統(tǒng)的調(diào)控等相關(guān)。KEGG通路分析結(jié)果表明，黃連素靶基因顯著富集在NAFLD 信號通路、胰島素抵抗信號通路、AMPK信號通路、乙型肝炎信號通路，上述途徑參與了NASH 進(jìn)程中的關(guān)鍵步驟。已有研究［20-21］表明，黃連素可以通過激活凋亡途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)脂代謝、抗氧化、抗炎，甚至抗腫瘤等藥理作用。脂肪肝及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多靶標(biāo)的藥物治療更為有效。本研究中的藥物目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)揭示了黃連素具有多靶標(biāo)、多層次作用的特點，具有多種藥理活性。這與既往研究［22］結(jié)果一致，即黃連素可以通過靶向多種蛋白質(zhì)和途徑發(fā)揮系統(tǒng)的藥理作用。

已有研究證實，NASH 患者的基因表達(dá)會發(fā)生變化，這些研究多聚焦在細(xì)胞或動物中基因的轉(zhuǎn)錄水平。PTGS2 是合成前列腺的關(guān)鍵速率限制酶，也是重要的促炎因子和治療炎癥疾病的核心目標(biāo)。PTGS2 參與了NASH 的發(fā)展，選擇性PTGS2 抑制劑可以顯著改善NASH 模型小鼠的肝脂肪變性、炎癥和肝損傷；作為炎癥和氧化應(yīng)激的橋梁，PTGS2 不僅能夠產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，也是脂質(zhì)代謝中的重要酶［23］。CCL2 是CC 趨化因子家族的小分子量細(xì)胞因子，在NASH 的發(fā)展過程中，CCL2 及其受體在肝臟中的水平上調(diào)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的積聚，發(fā)生炎癥、纖維化和脂肪變性，可見CCL2 與肝臟炎癥密切相關(guān)［24-25］。NASH 患者的循環(huán)血CCL2 水平持續(xù)升高，提示高CCL2 水平可以促進(jìn)NASH的進(jìn)展［26-27］。TLR4 是TLR 家族中最有特色的成員，通常起模式識別受體的作用，與NASH 的發(fā)病密切相關(guān)［28］。TLR4 激活后，核因子（NF）-κB 途徑隨之被一系列下游信號激活，從而產(chǎn)生促炎分子［29］。黃連素可以通過抑制TLR4活性來發(fā)揮肝臟保護(hù)作用［30-31］。本研究中的體外細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組PTGS2、CCL2、TLR4mRNA 表達(dá)升高；黃連素干預(yù)后，PTGS2、CCL2、TLR4mRNA 表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性降低，為臨床用藥提供理論了一定依據(jù)。

綜上，黃連素可以靶向調(diào)控NASH 發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而發(fā)揮系統(tǒng)藥理作用，有望被開發(fā)為一種安全有效的抗NASH藥物。