降解聚乙烯真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）的篩選和鑒定

曹萌萌 朱利霞 桑成琛 栗婷軒 張艷君

摘 ?要：從長期覆膜農(nóng)田土壤中篩選出一種能夠降解聚乙烯的菌株——哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.將篩選出的哈茨木霉接種到以聚乙烯為唯一碳源的培養(yǎng)基中培育30天，聚乙烯失重率約為10%，聚乙烯薄膜表面出現(xiàn)明顯的孔洞和裂痕.

關(guān)鍵詞：聚乙烯；地膜；哈茨木霉；降解

[ ? 中圖分類號 ? ?]X172[ ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼 ? ] ?A

Screening and Identification of Polyethylene-degrading Fungus Trichoderma harzianum

CAO Mengmeng，ZHU Lixia*，SANG Chengchen，LI Tingxuan，ZHANG Yanjun

（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

Abstract：A Trichoderma harzianum strain capable of degrading polyethylene was isolated from soil collected from a field with long-term plastic film mulching.After the fungus was isolated，Trichoderma harzianum was incubated for 30 days in a liquid medium with polyethylene film as the sole carbon source.The results showed that the weight loss of polyethylene film was about 10% after the incubation，obvious erosion holes and cracks appeared on the surface of degraded polyethylene film.

Key words：polyethylene；plastic film；Trichoderma harzianum；degradation

聚乙烯地膜殘留在土壤中嚴(yán)重影響土壤生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為了實(shí)現(xiàn)環(huán)保高效降解聚乙烯殘膜，亟需篩選可降解聚乙烯的微生物.地膜是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的生產(chǎn)資料之一，自地膜覆蓋技術(shù)被引入到我國后，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中地膜的用量逐年增長，我國成為全球地膜覆蓋面積最大的國家.聚乙烯是一種穩(wěn)定性好、抗腐蝕性強(qiáng)的高分子聚合物，是農(nóng)業(yè)地膜最常用的塑料.[1]聚乙烯地膜可以改善土壤水熱狀況，提高作物產(chǎn)量，然而當(dāng)季作物收獲后，聚乙烯地膜常常由于風(fēng)化破敗而無法繼續(xù)使用，導(dǎo)致大量聚乙烯地膜殘留在土壤中，造成白色污染[2] ，導(dǎo)致土壤生產(chǎn)力的降低和生態(tài)環(huán)境的破壞，影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.目前解決聚乙烯殘膜污染的方法主要是焚燒、填埋、回收利用等.聚乙烯農(nóng)用地膜厚度過薄，回收成本較高，焚燒和填埋成為處理聚乙烯殘膜的主要方法，而焚燒和填埋聚乙烯殘膜又會造成嚴(yán)重的二次污染.[3]探尋清潔高效的聚乙烯殘膜降解途徑，解決由聚乙烯殘膜引起的環(huán)境問題至關(guān)重要.微生物生長繁殖速度快，代謝旺盛，代謝類型多，是一種有效降解聚乙烯的途徑.[4]對單一菌種的降解效果研究表明，真菌的菌絲可以更好地附著在聚乙烯殘膜的表面并能穿透殘膜，其降解效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于細(xì)菌.[5]因此，真菌在緩解聚乙烯殘膜造成的環(huán)境問題方面具有更大的潛力.[6]本研究從長期覆蓋地膜的農(nóng)田土壤中分離出一株能有效降解聚乙烯塑料的真菌.

1 材料和方法

1.1 供試材料

2021年11月，采集周口市川匯區(qū)農(nóng)田的土壤，該農(nóng)田從2009年以來長期種植蔬菜并覆蓋聚乙烯地膜，土壤中殘留大量聚乙烯薄膜.

試驗(yàn)所用聚乙烯為農(nóng)貿(mào)市場購置的農(nóng)用地膜，在實(shí)驗(yàn)開始前將其剪成4 cm×4 cm的方塊形，依次用1%十二烷基硫酸鈉溶液、95%乙醇和75%乙醇浸泡并滅菌，在超凈工作臺中風(fēng)干，備用.

培養(yǎng)基為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基和固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基.固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基由液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加1.8%的瓊脂制得.馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂制成，pH值自然.

1.2 聚乙烯降解菌的分離純化

將采集的土壤樣品5 g加入45 mL無菌生理鹽水中，150 r/min振蕩30 min，制得土壤稀釋液.移取20 μL土壤稀釋液于100 mL以1%聚乙烯為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，用于分離以聚乙烯為唯一碳源的菌株.移取20 μL土壤稀釋液于100 mL不添加聚乙烯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中作為對照.將接種過的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，振蕩（150 r/min）培養(yǎng)10天.棄去聚乙烯膜，將所得培養(yǎng)液用無菌生理鹽水梯度稀釋后取稀釋液0.2 mL，涂布法接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用平板劃線法進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接，獲得菌株的純培養(yǎng).

將得到的菌株以涂布法接種到鋪有4 cm×4 cm聚乙烯的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，觀察聚乙烯膜片周圍菌落的形成情況，篩選出具有潛在降解聚乙烯能力的菌株.

1.3 聚乙烯降解菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定 參考楊合同[7]等的分類方法，對PDA培養(yǎng)皿上的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察對比，初步判定其分類地位.

分子生物學(xué)鑒定[8-9] ?將篩選到的菌株采用生工生物工程（上海）有限公司柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，測定ITS序列.采用ITS通用引物ITS1 （5′-TCCGTACCTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將檢測合格的PCR產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司測序.測序結(jié)果用Bioedit軟件分析，截取可信度較高的序列，使用NCBI-BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將截取序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)ITS序列的相似度鑒定菌株. 采用鄰接法用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株之間的親緣關(guān)系.

1.4 聚乙烯降解菌降解效能分析

聚乙烯失重率測定 在無菌條件下將純化的菌株以5%的接種量接種到含聚乙烯片的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min培養(yǎng)30天，分別在第5，10，15，20，25和30天測定聚乙烯片的失重率.用去離子水反復(fù)清洗聚乙烯片，去除其表面附著的菌體，并將聚乙烯片置于50 ℃烘箱中干燥過夜，冷卻稱重.根據(jù)培養(yǎng)前后聚乙烯膜片的質(zhì)量變化計(jì)算失重率.

培養(yǎng)基中降解菌生長情況 將菌株P(guān)T1的菌懸液按照體積比10%的比例接種到以聚乙烯為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，聚乙烯薄膜加入量按照1%的質(zhì)量比加入聚乙烯薄膜，在28 ℃條件下振蕩（150 r/min）培養(yǎng)30天，分別記錄第5，10，15，20，25和30天液體培養(yǎng)基的光密度值（OD600）.

掃描電鏡觀察聚乙烯微觀形態(tài) 將降解30天的聚乙烯薄膜清洗去除其表面附著的菌膜及其他雜質(zhì)后，自然風(fēng)干，用掃描電子顯微鏡觀察接種與未接種菌株P(guān)T1培養(yǎng)基中聚乙烯薄膜的特征，比較聚乙烯薄膜表面微觀形態(tài)變化情況.

2 結(jié)果和分析

2.1 聚乙烯降解菌的篩選

將接種土壤懸液的無機(jī)鹽培養(yǎng)基置于28 ℃，150 r/min培養(yǎng)10天后，含有聚乙烯片的培養(yǎng)基明顯渾濁，未加聚乙烯片的培養(yǎng)基清澈.采用平板劃線法分離純化獲得菌株，將其命名為PT1.

2.2 菌株P(guān)T1的鑒定

在28 ℃條件下，聚乙烯降解菌PT1菌株在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上的菌落氣生菌絲呈白色絨毛狀，中心部位有產(chǎn)孢簇，初始顏色綠色，之后逐漸加深（圖1），這與楊合同[7]等描述的木霉屬菌落特征基本一致.初步判定該菌株為木霉屬微生物.

將提取的DNA序列擴(kuò)增后回收測序，序列片段長度為618 bp.將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸序列比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與哈茨木霉的ITS序列同源性高于99%，從親緣關(guān)系上判定菌株P(guān)T1為木霉屬哈茨木霉.構(gòu)建PT1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)T1與哈茨木霉（Trichoderma harzianum，Genebank ID： AF345950.1）位于同一分支.因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)特征，判定該聚乙烯降解菌株P(guān)T1為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）.

2.3 哈茨木霉對聚乙烯的降解效能

在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基光密度值OD600呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢（圖3A）.在培養(yǎng)前10天，OD600較小（OD600<0.05），培養(yǎng)液中菌株濃度較低，這可能是菌株適應(yīng)培養(yǎng)液環(huán)境的過程，根據(jù)微生物生長發(fā)育規(guī)律，此時菌株處于延滯期；在10～20天，OD600增加較快，此時哈茨木霉已經(jīng)適應(yīng)該環(huán)境，菌株大量增長并以聚乙烯為碳源進(jìn)行生長繁殖，菌株處于快速生長期；在第20～30天，OD600增加緩慢，培養(yǎng)液中菌體數(shù)量下降，可能是由于此時培養(yǎng)液中無機(jī)鹽含量逐漸減少，成為菌株生長的限制因子，且菌株代謝產(chǎn)物的積累抑制其自身的生長繁殖，導(dǎo)致此時菌株生長處于衰亡期.此外，菌株在生長過程中為了利用碳源而大量附著在聚乙烯片表面也可能導(dǎo)致培養(yǎng)液中菌株濃度下降.

比較聚乙烯薄膜在接種哈茨木霉前后的質(zhì)量損失，評價聚乙烯薄膜的表觀降解狀況.經(jīng)過30天的培養(yǎng)后，聚乙烯薄膜失重率約為10%，表明哈茨木霉能夠降解聚乙烯（圖3B）.

哈茨木霉接種于聚乙烯薄膜為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)中30天后，用掃描電鏡檢測聚乙烯表面微觀形態(tài)的變化（圖4）.聚乙烯片表面結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，出現(xiàn)孔洞和裂痕，未接種哈茨木霉的聚乙烯片表明光滑，無變化，說明哈茨木霉能夠附著在聚乙烯片表面并以聚乙烯為碳源進(jìn)行生長繁殖，哈茨木霉能夠有效降解聚乙烯.

3 討論

聚乙烯由乙烯單體經(jīng)過聚合反應(yīng)形成，是一種高分子聚合物，具有耐用、抗腐蝕的特點(diǎn)，被廣泛用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域.農(nóng)膜的使用使得大量聚乙烯殘留在土壤中，影響土壤生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展.本研究從長期覆蓋聚乙烯薄膜的土壤中篩選出一株聚乙烯降解真菌——哈茨木霉，該菌株能夠降解低密度聚乙烯.哈茨木霉是一種腐生真菌，隸屬于盤菌亞門、肉座菌目、肉座菌科、木霉屬.哈茨木霉具有降解纖維素的能力，能夠分泌促生因子，降解多環(huán)芳烴等.[10]已有的降解聚乙烯的真菌主要為曲霉屬真菌，也有關(guān)于青霉屬真菌降解聚乙烯的報道，關(guān)于木霉屬真菌的報道較少.李夏[11]等分離出一種能夠降解聚乙烯農(nóng)膜的枯青霉，培養(yǎng)100天后，聚乙烯薄膜結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，在該條件下枯青霉對聚乙烯的降解速度較慢.

聚乙烯微生物降解過程是微生物附著、菌絲生長、產(chǎn)酶降解最終被分解為CO2和水的過程.[12]在聚乙烯降解的整個過程中，哈茨木霉菌株處于寡營養(yǎng)條件下，30天后聚乙烯失重率10%左右.微生物在寡營養(yǎng)條件下會啟動適應(yīng)機(jī)制以維持自身生長[13]，菌株在聚乙烯無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長濃度較高，可能是由于菌株在生長過程中啟動了適應(yīng)機(jī)制，缺乏有效碳源的條件下微生物會改變其對碳源的利用偏好[14]，由此，哈茨木霉以聚乙烯為碳源進(jìn)行生長代謝活動.由于哈茨木霉能夠以聚乙烯作為碳源，經(jīng)過30天的培養(yǎng)后，大量菌絲侵入并穿透聚乙烯薄膜，使得聚乙烯出現(xiàn)明顯的破損和孔洞，這直接證明了哈茨木霉能夠有效降解聚乙烯.

目前已發(fā)現(xiàn)的菌株對聚乙烯等塑料的降解效率較低，具有高效生物降解性能的菌株還很稀少，尋找高效的聚乙烯降解微生物和酶系統(tǒng)，豐富降解菌種資源庫的研究亟待加強(qiáng).Khan[15]等發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中額外添加2%葡萄糖，可大大提高賓曲霉對塑料地膜的降解能力.此外，在利用微生物降解塑料制品試驗(yàn)中，可以通過調(diào)節(jié)pH值、控制培養(yǎng)溫度、添加金屬離子及其他化學(xué)物質(zhì)等改善菌株對聚乙烯等塑料的降解效果，挖掘其降解潛能.由于微生物在降解聚乙烯過程中會分泌相應(yīng)的降解酶（如水解酶、氧化還原酶），這就使得了解降解酶及其產(chǎn)生過程顯得更為重要.因此，在今后的研究中，我們將從哈茨木霉在降解聚乙烯過程中產(chǎn)生降解酶及調(diào)控降解酶產(chǎn)生的基因入手，深入了解哈茨木霉降解聚乙烯的機(jī)制，挖掘其在降解聚乙烯方面的潛能，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù).

4 結(jié)論

從長期覆膜的農(nóng)田土壤中分離篩選出1株能夠有效降解聚乙烯塑料的菌株，通過形態(tài)學(xué)特征和ITS序列同源性比對，初步鑒定該菌株為木霉屬哈茨木霉.通過失重法、培養(yǎng)液光密度值和表面微觀形態(tài)等方法驗(yàn)證了該菌株能夠有效降解聚乙烯.本研究中篩選出的菌株尚未進(jìn)行降解條件的優(yōu)化及其降解機(jī)制的研究，后期我們將探究如何提高該菌株對聚乙烯的降解效能，以期為農(nóng)田聚乙烯殘膜的高效環(huán)保降解提供參考.

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編輯：琳莉