蜱傳人獸共患無形體和立克次體的分子生物學(xué)鑒定

任 晴，李美辰，張家銘，杜孌英，郭文平*，謝廣成*

(1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.秦皇島市第一醫(yī)院)

立克次氏體目（Rickettsiales）在分類上屬于α變形桿菌綱細(xì)菌，是嚴(yán)格寄生在真核細(xì)胞內(nèi)的原核細(xì)胞型微生物。立克次氏體目細(xì)菌主要通過蜱、跳蚤和螨類等節(jié)肢動物傳播媒介將病原體傳播給人類，引起人獸共患性傳染病[1]。蜱是專性寄生在哺乳動物體表的吸血節(jié)肢動物，所傳染的疾病多為自然疫源性疾病，易在自然界流行。在過去幾十年里，蜱傳疾病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加，在中國內(nèi)陸已發(fā)現(xiàn)了33種蜱相關(guān)病原體，據(jù)報(bào)道[2]有15種可引起人類感染。作為立克次氏體目細(xì)菌重要的傳播媒介，由蜱傳播且可引起疾病的立克次氏體目細(xì)菌主要包括無形體科中的無形體（Anaplasma）、埃立克體（Ehrlichia）、新埃立克體（CandidatusNeoehrlichia）以及立克次體科立克次體屬（Rickettsia）?？梢鹑祟惛腥镜尿鐐鳠o形體包括羊無形體（A. ovis）、山羊無形體（A. capra）、扁平無形體（A. platys）和嗜吞噬細(xì)胞無形體（A. phagocytophilum）等[3]；埃立克體主要為查菲埃立克體（E. chaffeensis）和新埃立克體中的米庫爾新埃立克體（CandidatusN. mikurensis）。引起人類感染的蜱傳立克次體主要包括斑點(diǎn)熱群（spotted fever group rickettsia, SFGR）中的黑龍江立克次體（R. heilongjiangiensis）、西伯利亞立克次氏體（R. sibirica）、饒氏立克次體（R. raoultii）以及近年來新發(fā)現(xiàn)的新塔拉塞維奇立克次體等[4]。我國是受立克次體目細(xì)菌相關(guān)疾病嚴(yán)重影響的國家，上述病原體在蜱、儲存宿主以及患者中均有發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著我國的公共衛(wèi)生安全[5]。

承德市近年來旅游業(yè)發(fā)展迅速，人們的生活和工作環(huán)境經(jīng)常侵入到蜱的生活地，加大了蜱媒病原體的傳播風(fēng)險(xiǎn)。然而，承德地區(qū)蜱源立克次體疾病與無形體疾病的報(bào)道甚少。本研究采用分子流行病學(xué)研究的方法對承德地區(qū)蜱攜帶的立克次體、無形體的情況進(jìn)行調(diào)查，分析承德地區(qū)人獸共患無形體和立克次體種類及其遺傳特征，為蜱源立克次氏體目細(xì)菌引起相關(guān)疾病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

DNA提取試劑盒（美國OMEGA生物技術(shù)公司），凝膠純化回收試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），2×PCR Taq Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），DL2000 DNA Marker（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）。

超凈工作臺（上海智城分析儀器制造公司），PCR基因擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司），核酸電泳儀（美國Bio-Rad公司），Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），4℃離心機(jī)（美國Thermo公司）。

1.2 蜱的采集

2020年4月～2020年8月，在承德市周邊的三溝鎮(zhèn)和六溝鎮(zhèn)采集蜱標(biāo)本。隨機(jī)選擇自然放養(yǎng)的家畜，如牛、山羊和綿羊等，在其體表用鑷子采集蜱，每個動物體表只采集1只蜱。采集的蜱經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行病原體的檢測。

1.3 蜱DNA的提取

將采集到的蜱放置于75%乙醇溶液中，浸泡10 min后再用PBS緩沖液沖洗3次，待自然干燥后以單只蜱為一組置于1.5 mL離心管中。DNA的提取按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行提取，提取后的總DNA 50μL，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 無形體與立克次體的分子生物學(xué)檢測與鑒定

為了增強(qiáng)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，提高檢測的靈敏度，使擴(kuò)增結(jié)果更準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR擴(kuò)增無形體科和立克次體屬的16S rRNA基因進(jìn)行病原體的檢測，檢測的引物序列見表1。PCR的反應(yīng)體系如下：第1輪PCR反應(yīng)采用20 μL的反應(yīng)體系，包括2×Taq DNA聚合酶10 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），DNA模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR的反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40s，50℃退火40s，72 ℃延伸50s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。待第1輪反應(yīng)結(jié)束后，以第1輪的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同第一輪。反應(yīng)體系為40 μL：2×Taq DNA聚合酶20 μL，上下游引物各1.6 μL（10 μmol/L），DNA模板2.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至40 μL。

表1 本研究中用到的引物

擴(kuò)增groEL進(jìn)行無形體屬物種的鑒定，擴(kuò)增外膜蛋白A（ompA）基因進(jìn)行立克次體的鑒定（表1）。PCR擴(kuò)增同上述擴(kuò)增16S rRNA基因的體系與程序。

1.5 序列測定與同源性比對分析

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，然后使用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果，將符合目的條帶大小的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因測序。將測序獲得的序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行BLASTn比對。采用DNAstar軟件進(jìn)行同源性分析，采用MEGA7.0軟件進(jìn)行最佳核酸替代模型計(jì)算與系統(tǒng)發(fā)育分析。使用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并進(jìn)行Bootstrap驗(yàn)證，分析采用1000次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料以(n,%)表示，使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異分析，以P＜0.05為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 蜱感染無形體和立克次體的流行情況

本研究在承德六溝鎮(zhèn)和三溝鎮(zhèn)共采集到336只蜱樣本，其中六溝鎮(zhèn)192只，三溝鎮(zhèn)144只。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，所有蜱樣本均為長角血蜱。經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增16S rRNA、測序以及BLASTn搜索比對，在承德六溝鎮(zhèn)和三溝鎮(zhèn)檢測出無形體屬樣本共85份。其中，六溝鎮(zhèn)蜱感染無形體的陽性率為31.3%（60/192），三溝鎮(zhèn)的陽性率為17.4%（25/144），六溝鎮(zhèn)蜱感染無形體的陽性率顯著高于三溝鎮(zhèn)（P=0.004）。另外，共檢測到立克次體陽性樣本58份，其中六溝鎮(zhèn)蜱感染立克次體的陽性率為15.1%（29/192），三溝鎮(zhèn)的陽性率為20.1%（29/144），三溝鎮(zhèn)蜱感染立克次體的陽性率顯著高于六溝鎮(zhèn)（P=0.02）?？偟膩砜矗瑑蓚€鎮(zhèn)蜱感染無形體的陽性率為25.3%（85/336），立克次體的陽性率為17.3%（58/336），蜱感染無形體的陽性率顯著高于立克次體（P=0.01）。

2.2 蜱感染無形體和立克次體的物種鑒定及進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步確定無形體和立克次體的物種，分別擴(kuò)增了groEL基因與ompA基因進(jìn)行鑒定。在groEL基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上，本研究中擴(kuò)增到的所有序列分成兩個進(jìn)化分支。第一個進(jìn)化分支包括來自28個陽性標(biāo)本的序列，與山羊無形（A. capra）之間的親緣關(guān)系最近（圖1）。這28條序列之間的同源性為99.5%～100%，與山羊無形體已知groEL基因序列之間的同源性為99.67%～100%。第二個進(jìn)化分支包括來自57個陽性標(biāo)本的序列，與羊無形體之間的親緣關(guān)系最近（圖1），這57條序列之間的同源性是99.50%～100%，與羊無形體已知groEL基因序列之間的同源性為99.31%～100%。根據(jù)groEL基因序列的同源性與系統(tǒng)發(fā)生分析，本研究中檢測到的無形體分別是山羊無形體和羊無形體，陽性率分別為8.3%和17.0%，具有顯著的差異性（P=0.0001）。

圖1 根據(jù)groEL基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

在立克次體ompA基因部分核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上，發(fā)現(xiàn)本研究中擴(kuò)增到的58條序列分成3個進(jìn)化分支（圖2）。第一個進(jìn)化分支包括12條序列，與西伯利亞立克次體（R. sibirica）的親緣關(guān)系最近。這12條序列之間的同源性為99.1%～100%，與西伯利亞立克次體之間的同源性為99.63%～100%。第二個進(jìn)化分支包括25條序列，與Ca. R. jingxinensis 暫定種和河北立克次體（Ca.R.hebeiii）的親緣關(guān)系最近。這25條序列之間的同源性是99.90～100%，與Ca. R. jingxinensis暫定種和河北立克次體的ompA基因序列之間的同源性為99.30%～100%。第三個進(jìn)化分支包括21個陽性標(biāo)本，與饒氏立克次體的親緣關(guān)系最近。這21條序列之間的同源性為99.6%～100%，與饒氏立克次體之間的同源性為99.93%～100%。根據(jù)ompA基因序列的同源性與系統(tǒng)發(fā)生分析，本研究中檢測到的立克次體包括3種，分別是西伯利亞立克次體、Ca. R.jingxinensis和饒氏立克次體，陽性率分別為3.6%、7.4%和6.3%。Ca. R. jingxinensis和饒氏立克次體顯著高西伯利亞立克次體（P＜0.05）。

圖2 根據(jù)ompA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

我國流行的蜱傳立克次氏體目細(xì)菌種類眾多，其中多數(shù)是人獸共患病的病原體。此外，傳播這些病原體的蜱種包括硬蜱屬、血蜱屬、扇頭蜱屬、革蜱屬中的五十余種蜱[9]。河北省幅員遼闊，地形地貌多種，適合蜱的生存，目前至少發(fā)現(xiàn)了17種蜱[10]。雖然蜱的種類眾多，但河北省關(guān)于蜱傳立克次體目細(xì)菌的研究較少，目前只報(bào)道了河北立克次體的流行[11]。本研究中從承德市周邊三溝鎮(zhèn)和六溝鎮(zhèn)的農(nóng)村地區(qū)采集的蜱種均為長角血蜱，是通過吸血將立克次氏體目細(xì)菌傳播給人類和脊椎動物的主要媒介[9]。在本研究中，我們通過分子生物學(xué)的方法對立克次氏體目細(xì)菌進(jìn)行檢測，共檢測到羊無形體、山羊無形體、西伯利亞立克次體、Ca. R. jingxinensis和饒氏立克次體在內(nèi)的5種立克次氏體目細(xì)菌。更為重要的是，這5種立克次氏體目細(xì)菌均是能感染人的人獸共患病原體。

2015年我國學(xué)者首次報(bào)道了我國黑龍江省人感染山羊無形體的病例[12]，此后，分子流行病學(xué)調(diào)查顯示其在我國廣泛分布[2]。2010年，羊無形體被首次報(bào)道可以感染人，是人獸共患病的病原體，但迄今為止有關(guān)羊無形體感染人的報(bào)道較少[13]。羊無形體在我國分布更廣，幾乎大部分的省份均有報(bào)道[2]。山羊無形體和羊無形體的傳播媒介比較類似，包括硬蜱屬、血蜱屬、扇頭蜱屬和革蜱屬中的多個蜱種[2]。在本研究中，經(jīng)過groEL基因序列的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析，承德地區(qū)周邊農(nóng)村流行的無形體主要為山羊無形體和羊無形體，并且攜帶率較高。雖然我國尚無人感染羊無形體的報(bào)道，但其在蜱中的感染率較高，應(yīng)加強(qiáng)對羊無形體的流行監(jiān)測。長角血蜱是羊無形體和羊無形體的傳播媒介，并且其為三宿主蜱，居住在農(nóng)村地區(qū)的人與蜱接觸的可能性更大，更容易被感染，因此需要進(jìn)一步開展人感染無形體的監(jiān)測來評估這些無形體對人的健康所造成的威脅。

研究[2,11]顯示，河北省張家口市、唐山市和秦皇島市的長角血蜱中發(fā)現(xiàn)了一個立克次體新種，后被命名為河北立克次體，陽性率為6.7%～7.9%，但在承德采集的長角血蜱中沒有檢測該立克次體。本研究發(fā)現(xiàn)承德地區(qū)立克次體的陽性率為17.3%，明顯高于周邊城市，表明立克次體在承德地區(qū)可能是一個日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。Ca.R.jingxinensis和Ca. R. longicornii是立克次體中的兩個暫定種，課題組前期研究顯示二者實(shí)為一個物種[14]。在本研究中，我們經(jīng)過同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)河北立克次體與上述兩個物種也應(yīng)為同一個物種。因此，本次研究共發(fā)現(xiàn)3種蜱傳立克次體，分別為西伯利亞立克次體、Ca.R. jingxinensis和饒氏立克次體。尤為重要的是，這3種立克次體均可感染人，并且在我國都有感染人的報(bào)道[2,15]，是對我國影響比較大的立克次體種類。本研究結(jié)果提示，承德地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)不明原因發(fā)熱的病人中立克次體的監(jiān)測，以期更好地預(yù)防和控制該地區(qū)蜱與蜱媒疾病。

本研究明確了承德農(nóng)村地區(qū)媒介蜱種與立克次氏體的種類，確定流行的立克次氏體目細(xì)菌的遺傳多樣性，所得到的研究結(jié)果為承德地區(qū)蜱傳立克次體的預(yù)警和防控提供科學(xué)依據(jù)。