外泌體功能化串晶結(jié)構(gòu)纖維膜的制備及其成骨分化性能

張 宇， 劉來俊， 李超婧， 晉巧巧， 謝千陽， 李佩倫， 王富軍， 王 璐

(1. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201620； 2. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620； 3. 上海交通大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院， 上海 200011； 4. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 牙體牙髓科， 上海 200011； 5. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 口腔外科， 上海 200011； 6. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 口腔正畸科， 上海 200011)

牙周疾病是一種流行率非常高的慢性疾病，如不及時(shí)治療，可能造成牙槽骨等牙周組織破壞甚至牙齒脫落[1]。引導(dǎo)骨再生(GBR)是牙槽骨修復(fù)最常用的策略之一，將GBR膜置于軟組織和骨缺損之間，阻止結(jié)締組織細(xì)胞和上皮細(xì)胞遷移到缺損處，同時(shí)使祖細(xì)胞重新定殖并形成新的骨組織[2]。在礦化過程中，健康的細(xì)胞外基質(zhì)保持理想的機(jī)械結(jié)構(gòu)，并為成骨細(xì)胞的遷移、黏附、增殖和分化提供大量的生化成分[3]。在GBR膜的眾多制備方法中，靜電紡絲法應(yīng)用較為廣泛，其制備的納米纖維支架具有高孔隙率、高比表面積和低剛度等優(yōu)勢(shì)，能夠很好地模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)[4]。靜電紡絲纖維的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)修飾已被證實(shí)具有促進(jìn)骨再生的效果，其對(duì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)主要取決于表面粗糙度的變化[5]。串晶(SK)結(jié)構(gòu)可采用溶劑誘導(dǎo)結(jié)晶法制備而得，其由納米纖維和垂直于纖維軸向的周期性片晶結(jié)構(gòu)共同組成，可以顯著提高纖維的表面粗糙度，通過影響蛋白吸附、調(diào)控各種細(xì)胞活動(dòng)，從而更好地模擬天然膠原纖維的分層納米結(jié)構(gòu)來指導(dǎo)宿主細(xì)胞并調(diào)節(jié)骨再生[6-7]。

增強(qiáng)GBR膜的骨再生效果除了可對(duì)其結(jié)構(gòu)修飾外，還可以將生物活性物質(zhì)結(jié)合到支架中，進(jìn)一步加速移植物與宿主組織的骨整合。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)衍生的外泌體在體內(nèi)外成骨過程中起著至關(guān)重要的作用，可通過傳遞脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和肽等直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化[8]。Liu等[9]的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體(BMSC-Exo)可促進(jìn)骨橋蛋白和骨鈣素基因表達(dá)，M2型巨噬細(xì)胞極化以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)牙周炎大鼠牙周組織修復(fù)和再生。與生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞等相比，外泌體可最大限度地減少對(duì)生物活性誘導(dǎo)分子的需求，有效避免毒性和免疫原性問題[10-11]?；谕饷隗w的治療主要通過靜脈注射[12]，這導(dǎo)致外泌體在體內(nèi)半衰期極短[13]。此外，對(duì)于牙槽骨的修復(fù)，直接注射也不利于外泌體在近中根部位的良好累積[14]。相較于在懸浮培養(yǎng)基中提供外泌體，將外泌體直接固定在移植物表面可更好地促進(jìn)MSCs生長(zhǎng)和成骨分化[15]。Zha等[16]構(gòu)建了工程化的小鼠成軟骨細(xì)胞系衍生外泌體，通過特定的外泌體錨定肽充當(dāng)柔性接頭，將其與3D打印聚己內(nèi)酯(PCL)多孔支架結(jié)合作為成骨基質(zhì)，從而誘導(dǎo)MSCs的成骨分化并可控地釋放基因以重塑血管系統(tǒng)。可見，將外泌體與支架相結(jié)合有利于其在缺損部位進(jìn)行可持續(xù)和穩(wěn)定的治療。

PCL是一種具有良好生物相容性的可降解聚合物，由于具有優(yōu)異的力學(xué)性能和可加工性能已被廣泛用作骨組織修復(fù)材料，利用靜電紡絲技術(shù)可以快速方便地制備PCL納米纖維膜[17]。納米尺度的β-磷酸三鈣(β-TCP)由于其優(yōu)異的生物相容性和骨傳導(dǎo)活性可以改善PCL疏水性、細(xì)胞親和力差和骨傳導(dǎo)活性低等不足[18-19]?；谝陨戏治?，本文通過靜電紡絲技術(shù)制備了PCL/β-TCP有機(jī)/無機(jī)復(fù)合納米纖維膜，并通過溶劑誘導(dǎo)結(jié)晶法制備出串晶結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增加其粗糙度；為提高纖維膜對(duì)細(xì)胞的親和力以及對(duì)外泌體的附著力，對(duì)串晶纖維膜進(jìn)行聚多巴胺(PDA)改性；最終創(chuàng)建了一個(gè)外泌體功能化的串晶納米纖維膜，以期促進(jìn)干細(xì)胞在體外的成骨分化。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

聚己內(nèi)酯(PCL,數(shù)均分子量為80 000 g/mol)、胰酶、雙抗、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)，美國Sigma-Aldrich公司；β-磷酸三鈣(β-TCP,粒徑≤200 nm)，百靈威科技有限公司；三氯甲烷(CF，純度≥99.0%)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF，純度≥99.5%)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris，純度≥99.5%)、鹽酸(HCl，純度為36.0%～38.0%)、十二烷基苯磺酸鈉(SDS，純度≥83.0%)和磷酸鹽緩沖液(PBS)配制所需原料KCl、NaCl、Na2HPO4·12H2O和KH2PO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸戊酯(純度約為99.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸多巴胺(數(shù)均分子量為189.64 g/mol)，北京Solarbio公司；TritonX-100，上海翊圣生物科技有限公司；胎牛血清蛋白(BSA)、BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒，上海生工生物工程有限公司；大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)、完全培養(yǎng)基，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；去外泌體胎牛血清，上海逍鵬生物科技有限公司；堿性磷酸酶(AKP)試劑盒、BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒，南京建成科技有限公司。

TL-Pro-BM型靜電紡絲機(jī)，深圳通力微納科技；SU8010型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)、JEM-2100F型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(FE-TEM)，日本日立公司；NEXUS-670型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，美國Thermo Fisher公司；OCA 20型接觸角測(cè)試儀，德國Dataphysics公司；Axioskop 2 plus型光學(xué)顯微鏡，上海歐波同儀器有限公司；Zetaview納米顆粒跟蹤分析儀，德國Particle Metrix公司。

1.2 串晶納米纖維膜制備

1.2.1 串晶納米纖維膜制備工藝

首先，將PCL顆粒加入至CF和DMF(二者體積比為3∶1)中配制成質(zhì)量濃度為0.12 g/mL的PCL溶液；向PCL溶液中加入β-TCP(占PCL質(zhì)量的5%)，超聲波處理1 h使β-TCP充分分散；在磁力攪拌下形成均勻混合的紡絲液。將上述紡絲液轉(zhuǎn)移至裝有19G針頭的10 mL注射器中在靜電紡絲機(jī)上進(jìn)行紡絲。紡絲電壓為15 kV，推注速度為1.2 mL/h，紡絲距離為15 cm。將所得靜電紡絲纖維膜置于37 ℃真空干燥箱中干燥24 h以充分去除殘留有機(jī)溶劑，將該纖維膜記為PT5。

然后，采用溶劑誘導(dǎo)結(jié)晶法在納米纖維表面制備串晶結(jié)構(gòu)。將PCL顆粒溶于乙酸戊酯中配制0.01 g/mL的PCL稀溶液，在60 ℃溫度下磁力攪拌2 h，冷卻至室溫后滴加于PT5纖維膜上過夜使溶劑自然揮發(fā)，得到具有串晶結(jié)構(gòu)的纖維膜，記為PT5SK。

最后，將制備的PT5和PT5SK靜電紡纖維膜分別浸入2 mg/mL的鹽酸多巴胺和10 mmol/L Tris-HCl(pH值為8.5)中，并在37 ℃和60 r/min搖床中孵育12 h；之后將纖維膜用去離子水超聲波清洗多次至水不變色，然后于37 ℃真空干燥24 h，所得樣品分別記為PT5/PDA和PT5SK/PDA。

1.2.2 結(jié)構(gòu)與性能表征

將真空干燥后的纖維膜噴射鉑金后，采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)其表觀形貌進(jìn)行觀察，并用Image J軟件測(cè)量纖維的直徑。

通過傅里葉紅外光譜儀測(cè)試?yán)w維膜的特征化學(xué)基團(tuán)，分辨率為2 cm-1，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

采用接觸角測(cè)試儀測(cè)量纖維膜的水接觸角以評(píng)價(jià)其表面潤濕性。液滴體積為2 μL，每種樣品測(cè)量3次，取平均值。

對(duì)纖維膜的蛋白吸附能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先，將PT5、PT5SK、PT5/PDA和PT5SK/PDA纖維膜裁剪成直徑為14 mm的圓形并置于24孔板中，用PBS清洗3次，加入1 mg/mL BSA溶液在37 ℃恒溫?fù)u床中以30 r/min孵育12 h。然后吸除多余液體，并用PBS清洗多余BSA溶液，每孔加入1 mL 1% SDS溶液孵育4 h，將樣品上吸附的蛋白剝離，采用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒定量測(cè)量上清液中BSA的濃度。

1.3 rBMSCs外泌體制備

1.3.1 rBMSCs外泌體分離方法

選用第4代rBMSCs在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至80%融合度時(shí)，用PBS清洗舊的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，然后更換為無外泌體的成骨分化培養(yǎng)基(向DMEM中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的去外泌體胎牛血清，體積分?jǐn)?shù)為1%的雙抗，50 μmol/L抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和100 nmol/L地塞米松)，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集成骨分化培養(yǎng)基上清液，-80 ℃下保存直至外泌體分離，所得外泌體記為BMSC-Exo。

采用超濾結(jié)合分子排阻色譜方法從細(xì)胞上清液中提取外泌體。首先，向100 ku超濾管中加入細(xì)胞上清液，離心10 min棄廢液，重復(fù)上述操作直至無法繼續(xù)濃縮為止。用0.1 mol/L PBS沖洗凝膠排阻柱，待凝膠排阻柱平衡好后，向每根柱中加入1 mL預(yù)處理好的細(xì)胞上清液。樣品全部進(jìn)入填料后，添加0.1 mol/L PBS進(jìn)行洗脫，收集對(duì)應(yīng)的外泌體餾分。將收集到的外泌體轉(zhuǎn)移至100 ku超濾管，離心15 min濃縮至200 μL左右，吹打均勻后將外泌體全部吸出用于后續(xù)試驗(yàn)及鑒定。

1.3.2 濃度與結(jié)構(gòu)表征

采用BCA定量試劑盒對(duì)分離的外泌體濃度進(jìn)行測(cè)量。

使用場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(FE-TEM)觀察外泌體的形態(tài)。將重懸于PBS中的BMSC-Exo包埋在碳涂覆的銅網(wǎng)上，并在室溫下干燥10 min,隨后用1%磷鎢酸染色，在80 kV下拍攝FE-TEM照片。

采用ZetaView測(cè)量所提取的外泌體顆粒濃度，并通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)測(cè)量其粒徑分布情況。

1.4 外泌體功能化串晶納米纖維膜制備

1.4.1 外泌體功能化串晶納米纖維膜制備工藝

將PT5SK/PDA纖維膜裁剪成直徑為14 mm的圓形并置于24孔板中，放入酒精熏缸中過夜滅菌，負(fù)載外泌體前用PBS清洗樣品3次。將重懸于PBS中的BMSC-Exo滴加至PT5SK/PDA纖維膜上，每個(gè)樣品的外泌體負(fù)載量約為10 μg，于4 ℃下孵育24 h，所得樣品記為PT5SK/PDA-Exo。

1.4.2 rBMSCs成骨分化表征

為評(píng)估PT5、PT5SK、PT5/PDA、PT5SK/PDA和PT5SK/PDA-Exo促進(jìn)干細(xì)胞體外成骨分化的能力，對(duì)培養(yǎng)在纖維膜上的rBMSCs的堿性磷酸酶(ALP)活性進(jìn)行表征。選用第4代rBMSCs以2×104個(gè)/孔的密度種植在滅菌的PT5、PT5SK、PT5/PDA、PT5SK/PDA和PT5SK/PDA-Exo樣品表面，每種樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(向完全培養(yǎng)基中加入50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和100 nmol/L地塞米松)，培養(yǎng)至成骨誘導(dǎo)7和14 d，每48 h更換新鮮培養(yǎng)基。

通過對(duì)ALP染色定性評(píng)價(jià)其活性。首先，吸出培養(yǎng)基用PBS清洗3次后，加入4%多聚甲醛，在4 ℃下固定3 h，用PBS清洗3次去除多余固定液。然后采用BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒對(duì)各纖維膜進(jìn)行染色。采用數(shù)碼相機(jī)和光學(xué)顯微鏡分別拍攝纖維膜的宏觀和微觀染色情況。

測(cè)試ALP活力定量評(píng)價(jià)其活性。吸除24孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后加入0.5%的TritonX-100裂解液，置于4 ℃下孵育過夜。次日，取出上清液并以2 000 r/min離心5 min，用離心后新的上清液來測(cè)定ALP的活性及總蛋白濃度。根據(jù)AKP試劑盒和BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒對(duì)各樣品的ALP活性進(jìn)行定量測(cè)試。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)得到的各數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，通過單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性差異水平*** 表示P<0.001;** 表示P<0.01；*表示P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性PCL/β-TCP串晶納米纖維膜

2.1.1 微觀形貌分析

靜電紡絲PCL納米纖維膜具有優(yōu)異的力學(xué)性能和高比表面積的固有優(yōu)勢(shì)，可以很好地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，將β-TCP無機(jī)材料引入可降解聚合物中可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)快速礦化和良好的骨再生[20]。圖1示出PT5、PT5SK、PT5/PDA和PT5SK/PDA纖維膜的微觀形貌。由圖1(a)可知，通過靜電紡絲法可獲得表面平滑、隨機(jī)分布且均勻連續(xù)的納米纖維，纖維直徑為(624.48±194.92) nm。由圖1(b)可知，經(jīng)PCL串晶溶液孵育后，PT5纖維表面形成了垂直于纖維軸向的串晶結(jié)構(gòu)，使纖維膜的表面粗糙度增加，從而有利于MSCs的募集和成骨分化。為提高纖維膜對(duì)細(xì)胞的親和力以及對(duì)外泌體的附著力，對(duì)PT5和PT5SK進(jìn)行PDA改性。從圖1(c)和(d)可看出，PDA改性后PT5和PT5SK纖維膜表面存在由多巴胺氧化自聚合產(chǎn)生的PDA顆粒，PT5SK/PDA的串晶結(jié)構(gòu)在PDA改性后仍然存在且未被PDA覆蓋，這說明PDA功能化不影響串晶纖維膜的形貌。

圖1 PDA改性前后PT5和PT5SK纖維膜的SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM images of PT5 and PT5SK fibrous membranes before and after PDA modification

2.1.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖2 β-TCP、PCL、PT5、PT5/PDA、 PT5SK和PT5SK/PDA的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of β-TCP, PCL, PT5, PT5/PDA, PT5SK and PT5SK/PDA

2.1.3 表面浸潤性分析

PT5、PT5SK、PT5/PDA及PT5SK/PDA的表面浸潤性評(píng)價(jià)結(jié)果如圖3所示。由于PCL的疏水性，PT5和PT5SK纖維膜均表現(xiàn)出疏水性，水接觸角分別為(134.4±2.69)°和(126.6±1.45)°。串晶結(jié)構(gòu)的形成使PT5SK的接觸角有所降低，這可能是由于串晶的存在使纖維膜的孔徑增加，從而有利于水分子的滲入。改性引入的PDA使PT5和PT5SK纖維膜的親水性得到極大的提高，接觸角分別降低至(104.9±1.17)°和(95.7±0.39)°。這是由于PDA中存在鄰苯二酚、氨基等親水性基團(tuán)[25]，使得改性后纖維膜的表面浸潤性顯著改善。PT5SK/PDA纖維膜由于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和PDA修飾的雙重作用，相比其他3組具有最優(yōu)的表面浸潤性(P<0.001)，有利于改善纖維膜的生物相容性以及細(xì)胞的黏附和增殖。盡管PCL/β-TCP纖維表面的串晶結(jié)構(gòu)已被證實(shí)具有促進(jìn)成骨分化的作用，但PCL仍因其疏水性和缺乏活性官能團(tuán)削弱了生物礦化的效果。而PDA修飾則可以彌補(bǔ)這一不足，賦予材料良好的親水性、細(xì)胞相容性和成骨活性[26]。

圖3 PDA改性前后PT5和PT5SK纖維膜的水接觸角Fig.3 Water contact angles of PT5 and PT5SK fibrous membranes before and after PDA modification

2.1.4 蛋白吸附分析

生物材料表面的蛋白吸附是決定其生物相容性的一個(gè)重要因素，細(xì)胞在材料表面的附著、遷移和生長(zhǎng)是由蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，通常與Integrin β1和Vinculin等細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白有關(guān)，因此，吸附的蛋白量增加有利于提高細(xì)胞在支架表面的快速黏附和鋪展[25,27]。為評(píng)價(jià)支架的生物學(xué)特性，研究了納米纖維膜的微觀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和表面化學(xué)性能對(duì)蛋白吸附性能的影響。PT5、PT5SK、PT5/PDA、PT5SK/PDA纖維膜的蛋白吸附情況如圖4所示。

圖4 PT5、PT5SK 、PT5/PDA、PT5SK/PDA 纖維膜的蛋白吸附情況Fig.4 Protein adsorption of PT5, PT5SK, PT5/PDA and PT5SK/PDA fibrous membranes

由圖4可知，相比于PT5纖維膜的平滑纖維，PT5SK的蛋白吸附量顯著增加(P<0.05)，主要是因?yàn)榇ЫY(jié)構(gòu)的存在能夠提高材料的比表面積和表面粗糙度，從而提高對(duì)蛋白質(zhì)的吸附效率，而且親水性的增加也促進(jìn)了蛋白吸附。材料的表面潤濕性在蛋白吸附中起著重要作用[28]，PDA改性后的纖維膜由于親水性顯著增加，蛋白吸附量也相應(yīng)增加，整體趨勢(shì)與表面浸潤性的趨勢(shì)一致。更重要的是，PDA層可以作為表面功能化的輔助平臺(tái)，將各種類型的生物活性因子固定在基材上，從而賦予材料卓越的性能[29]。外泌體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，蛋白吸附的增加也有利于提高纖維膜對(duì)外泌體的吸附能力并長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定的附著。

2.2 外泌體功能化串晶納米纖維膜

2.2.1 外泌體結(jié)構(gòu)分析

對(duì)提取的外泌體進(jìn)行表征，結(jié)果如圖5所示。從FE-TEM照片可以看出，BMSC-Exo表現(xiàn)為杯狀囊泡，具有清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)。NTA結(jié)果表明，外泌體顆粒平均粒徑為142.4 nm，粒徑主峰為126.7 nm。以上結(jié)果初步證實(shí)了細(xì)胞上清液提取物是納米級(jí)外泌體。

圖5 BMSC-Exo的FE-TEM照片和粒徑分布圖Fig.5 FE-TEM image (a) and particle size distribution (b) of BMSC-Exo

2.2.2 成骨分化分析

ALP是成骨分化早期的標(biāo)志物，通過染色和定量可對(duì)rBMSCs的體外成骨分化情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。rBMSCs在纖維膜上成骨誘導(dǎo)7和14 d的ALP染色和定量結(jié)果如圖6、7所示。誘導(dǎo)7 d時(shí)，PT5和PT5SK纖維膜上細(xì)胞數(shù)量較少，且ALP染色較淺，經(jīng)過PDA改性后的PT5/PDA和PT5SK/PDA的ALP染色面積有所增加、藍(lán)紫色加深，且二者存在顯著性差異(P<0.01);BMSC-Exo的加入顯著提高了ALP活性(P<0.001)，誘導(dǎo)14 d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增加并且顏色變深，負(fù)載了外泌體的PT5SK/PDA-Exo仍表現(xiàn)出最深的染色以及最高的ALP活力(P<0.001)。串晶結(jié)構(gòu)和PDA改性使得纖維膜表面粗糙度和表面浸潤性增加，從而有利于蛋白吸附、細(xì)胞生長(zhǎng)和成骨礦化基質(zhì)的形成。外泌體功能化后，ALP活性進(jìn)一步增加，這歸因于其自身的骨誘導(dǎo)作用。外泌體中富含的microRNA等物質(zhì)可通過絲裂原活化蛋白激酶、Wnt等信號(hào)通路促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)[30]，因此，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、PDA改性以及外泌體3個(gè)因素共同促進(jìn)了rBMSCs在纖維膜表面的成骨分化。此外，外泌體可以在體內(nèi)缺血或壞死微環(huán)境中起到減少細(xì)胞凋亡、趨化和增殖的作用，同時(shí)募集MSCs并促進(jìn)其增殖和成骨分化，促進(jìn)血管形成[31]，這也有利于其在體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)綜合的牙周組織再生效果。

圖6 rBMSCs在纖維膜上成骨誘導(dǎo)7和14 d的ALP染色圖Fig.6 ALP staining of rBMSCs osteogenic on fibrous membranes at 7 d and 14 d

圖7 rBMSCs在纖維膜上成骨誘導(dǎo)7和14 d的ALP活力Fig.7 ALP activity of rBMSCs osteogenic on fibrous membranes at 7 d and 14 d

3 結(jié) 論

本文通過靜電紡絲法制備了聚己內(nèi)酯/β-磷酸三鈣(PCL/β-TCP)復(fù)合納米纖維膜，采用溶劑誘導(dǎo)結(jié)晶法成功制備出串晶結(jié)構(gòu)。對(duì)PCL/β-TCP串晶纖維膜進(jìn)行聚多巴胺(PDA)修飾，PCL/β-TCP/PDA串晶纖維膜表面浸潤性和蛋白吸附能力顯著提高。外泌體通過PDA的黏附作用負(fù)載于纖維膜上，該功能化纖維膜顯示出最利于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)成骨分化的特性，顯著促進(jìn)堿性磷酸酶(ALP)活性的增加，有望應(yīng)用于體內(nèi)加速牙槽骨愈合。