不同烤煙品種化學(xué)成分及致香物質(zhì)差異分析

劉濤 曹建敏 郭存 陳剛 文利超 鄧智超 郭永峰 李偉

摘? 要：為探究?jī)?yōu)質(zhì)烤煙核心親本的煙葉質(zhì)量特征差異，選取7個(gè)常用的育種親本，對(duì)其烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分、致香物質(zhì)及感官質(zhì)量進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，氯含量在不同品種中差異較大；兩糖比和鉀氯比均在優(yōu)質(zhì)烤煙適宜范圍；氮堿比除NC82和大白筋599在適宜范圍內(nèi)外，其他品種整體偏高。類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、葉綠素降解產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物和其他類香氣物質(zhì)在紅花大金元中含量最高，苯丙氨酸類降解產(chǎn)物和類西柏烷類降解產(chǎn)物在革新三號(hào)中含量最高。聚類分析將7個(gè)烤煙品種分為3類，G28、K326、小黃金1025、NC82和革新三號(hào)為一類，大白筋599和紅花大金元各為一類。經(jīng)因子分析和OPLS-DA分析后，篩選到17種差異代謝物，其中，β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、反式-2，4-庚二烯醛、5，6-環(huán)氧紫羅蘭酮在紅花大金元中含量較高，巨豆三烯酮-1、巨豆三烯酮-2、巨豆三烯酮-3、巨豆三烯酮-4在NC82和紅花大金元中含量均較高，2-吡咯甲醛在小黃金1025和革新三號(hào)中的含量較高，吡喃酮在小黃金1025中的含量較高，降茄二酮在革新三號(hào)中含量較高，茄酮在NC82、G28和革新三號(hào)中含量較高。這些差異組分主要是由遺傳基礎(chǔ)決定的，可為以后育種工作提供參考。

關(guān)鍵詞：烤煙；品種；化學(xué)成分；致香物質(zhì)

中圖分類號(hào)：S572.03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）02-0074-09

Abstract： In order to explore the differences in quality characteristics of toasted tobacco leaves of core parents of high-quality flue-cured tobacco， we selected 7 commonly used breeding parents， compared and analyzed the conventional chemical components， odorant substances and sensory quality of the toasted tobacco leaves. The results showed that the chlorine content varied greatly among different varieties; the ratio of two sugars and the potassium to chlorine ratio were all within the suitable range of high-quality flue-cured tobacco; the nitrogen-alkali ratio was higher in all varieties except NC82 and Dabaijin599， which were within the suitable range. The contents of carotenoid degradation products， chlorophyll degradation products， browning reaction products and other aroma substances were the highest in Honghuadajinyuan， and the contents of phenylalanine-like degradation products and cembrane-like degradation products were the highest in Gexin3. Based on cluster analysis we could divide the 7 flue-cured tobacco varieties into 3 categories： G28， K326， Xiaohuangjin1025， NC82 and Gexin3 belonged to one category， and Dabaijin599 and Honghuadajinyuan belonged to two separate categories. After factor analysis and OPLS-DA analysis， 17 differential metabolites were identified， with the contents of β-Ionone， Dihydroactinolactone， 2，4-Heptadienal， （E，E）-1 and β-Ionone-5，6-epoxyde breing higher in Honghuadajinyuan， and the contents of Megastigmatrienone-1， Megastigmatrienone-2， Megastigmatrienone-3 and Megastigmatrienone-4 being higher in NC82 and Honghuadajinyuan， the content of 2-Formylpyrrole being higher in Xiaohuangjin1025 and Gexin3， the content of Pyranone being higher in Xiaohuangjin1025， the content of Norsoladione beinghigher in Gexin3， the content of Solanone being higher in NC82， G28 and Gexin3. The characteristics of aromatic substances in different varieties are different， which can provide guidance for aroma breeding.

Keywords： flue-cured tobacco; cultivar; chemical component; aroma components

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，隨著中式卷煙的發(fā)展，卷煙工業(yè)部門對(duì)煙葉的質(zhì)量要求逐漸提高，煙葉的品質(zhì)和香氣質(zhì)量越來(lái)越受到重視。研究表明， 化學(xué)成分是決定煙葉品質(zhì)的內(nèi)在因素，致香物質(zhì)是煙葉香氣品質(zhì)形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]；香氣質(zhì)、香氣量以及香型與煙葉中的致香物質(zhì)成分密切相關(guān)，不同的成分彰顯煙葉不同的品質(zhì)特征[2]。煙葉生產(chǎn)

中，烤后煙葉的質(zhì)量受多種因素影響，如品種、生長(zhǎng)環(huán)境、栽培措施等。在生態(tài)環(huán)境和栽培措施相似的情況下，遺傳因素起決定作用[3]。

目前，關(guān)于不同基因型烤煙化學(xué)成分和致香物質(zhì)差異研究已有許多報(bào)道。張雙雙等[4]比較分析了云南省曲靖煙區(qū)K326、NC297、KRK26、云煙97和云煙87等5個(gè)烤煙品種的常規(guī)化學(xué)成分和中性致香物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同基因型煙葉的中性致香物質(zhì)種類基本相同，但含量存在較大差異；周芳芳等[5]對(duì)云南不同煙區(qū)K326、云煙87和紅花大金元3個(gè)烤煙品種的致香物質(zhì)成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種致香物質(zhì)含量的地域分布特征差異較大，同一地區(qū)內(nèi)K326和云煙87致香物質(zhì)含量的相似性高，均與紅花大金元存在較大差異。以上研究采用的種質(zhì)資源僅包含較少的育種常用的核心種質(zhì)，難以滿足烤煙香氣育種的需求。此外，李晨營(yíng)等[6]通過(guò)對(duì)四川、山東2個(gè)產(chǎn)區(qū)51份烤煙種質(zhì)中致香物質(zhì)的比較分析，初步明確了不同煙區(qū)致香物質(zhì)的差異。但該研究側(cè)重點(diǎn)在于兩個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)之間的比較，對(duì)不同種質(zhì)之間的差異分析較少。鑒于此，本研究選取了7個(gè)優(yōu)質(zhì)烤煙核心親本，包括K326、NC82、G28、紅花大金元、革新三號(hào)、小黃金1025和大白筋599，進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分、致香物質(zhì)及感官質(zhì)量評(píng)價(jià)比較分析。K326、NC82和G28是國(guó)外引進(jìn)的優(yōu)良品種，具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗病的特點(diǎn)[7-8]。有研究表明，以改良煙葉濃香型風(fēng)格為育種目標(biāo)時(shí)，紅花大金元和革新3號(hào)是比較理想的親本[9]。小黃金1025雖然高感黑脛病，但因其香氣量較足，香氣質(zhì)好，是優(yōu)質(zhì)的烤煙育種材料。大白筋599已被證實(shí)含有與其他烤煙品種香氣特性不同的關(guān)鍵致香物質(zhì)賴百當(dāng)二萜冷杉醇[10]。雖然這7個(gè)烤煙品種作為重要的種質(zhì)資源已育出多個(gè)品種（系），如云煙85、云煙87、中煙100、中煙90、遼煙15號(hào)等[11-18]，但是在同樣的生態(tài)條件下，7個(gè)品種的遺傳基礎(chǔ)對(duì)烤后煙葉質(zhì)量的影響尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。因此，本研究在山東臨沂煙區(qū)，對(duì)7個(gè)品種進(jìn)行比較分析，明確不同香型烤煙品種中的主要致香物質(zhì)種類、含量以及關(guān)鍵香氣成分特征，對(duì)烤煙香氣育種具有積極意義。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

烤煙品種K326、NC82、G28、紅花大金元、革新三號(hào)、小黃金1025和大白筋599種質(zhì)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)提供。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 2021年在山東臨沂蒙陰縣桃墟鎮(zhèn)試驗(yàn)田進(jìn)行試驗(yàn)，選擇土壤肥力均一，且地勢(shì)平坦的地塊。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)3行共120株，行距1 m，株距0.5 m，設(shè)保護(hù)行。田間管理嚴(yán)格按照當(dāng)?shù)厣a(chǎn)規(guī)范要求進(jìn)行，所有小區(qū)農(nóng)事操作相同。待中部葉達(dá)到適熟階段，取各小區(qū)成熟度一致的中部葉并掛牌編號(hào)，在同一烤房按照產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)烘烤工藝進(jìn)行烘烤。取烤后C3F等級(jí)的煙葉，去除主脈后，烘干并粉碎，用于測(cè)定化學(xué)成分、致香物質(zhì)，進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.2.2? 煙葉化學(xué)成分測(cè)定? 分別參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159—2019、YC/T 160—2002、YCT 33—1996、YC/T 217—2007和YC/T 162—2011，測(cè)定煙葉水溶性糖（包括總糖和還原糖）、總植物堿、總氮、鉀和鈉含量。

1.2.3? 煙葉致香物質(zhì)測(cè)定? 稱取1.0 g煙末置于頂空瓶中，用微量注射器將乙酸苯乙酯（內(nèi)標(biāo)）滴在頂空瓶?jī)?nèi)側(cè)，密封后置于固相微萃取加熱臺(tái)上平衡；將老化后的萃取頭插入頂空瓶中，頂空采樣一定時(shí)間；從頂空瓶中拔出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸10 min，進(jìn)行GC/MS檢測(cè)。

色譜柱：HP-FFAP石英毛細(xì)管（50 m×0.32 mm×0.50 μm）；載氣：高純氦氣，流速1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，先以10 ℃/min升至130 ℃，再以3 ℃/min升至200 ℃，最后以5 ℃/min升至230 ℃，保持20 min；離子源：EI源；電離電壓：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；掃描方式：全掃描；掃描范圍：33～600 amu。

1.2.4? 感官質(zhì)量評(píng)價(jià)? 感官質(zhì)量評(píng)價(jià)按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 138—1998的方法打分，包括香氣質(zhì)（15?分）、香氣量（20分）、余味（25分）、雜氣（18分）、刺激性（12分）、燃燒性（5分）和灰色（5分），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所評(píng)吸專家組打分。

1.2.5? 數(shù)據(jù)分析? 用Excel 2021對(duì)數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單處理；應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和因子分析；采用SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行OPLS-DA分析和聚類分析。

2? 結(jié)? 果

2.1? 不同烤煙品種常規(guī)化學(xué)成分含量分析

由表1可知，常規(guī)化學(xué)成分在不同品種間存在廣泛變異。6種常規(guī)化學(xué)成分中，鉀的變異系數(shù)最小為10.67%，氯的變異系數(shù)最大為64.93%，說(shuō)明在不同品種中氯含量變化大，主要是紅花大金元和革新三號(hào)的氯含量顯著高于其他5個(gè)品種，導(dǎo)致氯含量數(shù)據(jù)的離散程度變大。兩糖比、鉀氯比和氮堿比是判斷優(yōu)質(zhì)煙葉的重要指標(biāo)，一般認(rèn)為中部煙葉兩糖比≥0.8、鉀氯比≥4、氮堿比0.7～1為優(yōu)質(zhì)煙葉[19]。在本研究中，7個(gè)樣本煙葉的兩糖比和鉀氯比均在適宜范圍，氮堿比除NC82和大白筋599外，其他5個(gè)品種略高于1，小黃金1025的氮堿比顯著高于K326、NC82、G28和大白筋599。

2.2? 不同烤煙品種致香物質(zhì)含量分析

由表2可知，7個(gè)烤煙品種共檢測(cè)出72種致香物質(zhì)，包括類胡蘿卜素降解產(chǎn)物24種，葉綠素降解產(chǎn)物1種，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物24種，苯丙氨酸類降解產(chǎn)物8種，類西柏烷類降解產(chǎn)物3種，其他致香物質(zhì)12種。這些致香物質(zhì)在7個(gè)品種中均檢測(cè)到，含量存在明顯差異。總致香物質(zhì)含量紅花大金元最高，NC82、革新三號(hào)、K326、大白筋599、G28和小黃金1025依次遞減。類胡蘿卜素降解產(chǎn)物紅花大金元最高，顯著高于其他6個(gè)烤煙品種，可能是紅花大金元的類胡蘿卜素合成能力強(qiáng)于其他品種。葉綠素降解產(chǎn)物K326、NC82、紅花大金元、革新三號(hào)和大白筋599含量較高，顯著高于G28和小黃金1025。棕色化反應(yīng)產(chǎn)物紅花大金元含量最高，顯著高于G28、K326和小黃金1025，其他品種含量差異不顯著。苯丙氨酸類降解產(chǎn)物和類西柏烷類降解產(chǎn)物在不同品種中差異顯著，均為革新三號(hào)含量最高，大白筋599含量最低。其他類致香物質(zhì)含量為紅花大金元最高，小黃金1025、革新三號(hào)、K326、NC82、G28和大白筋599依次遞減。

2.3? 致香物質(zhì)OPLS-DA分析和聚類分析

采用有監(jiān)督的模式識(shí)別方法OPLS-DA進(jìn)一步對(duì)致香物質(zhì)進(jìn)行研究，由圖1（a）可知，每個(gè)品種的3個(gè)樣本基本聚集在同一個(gè)區(qū)域，說(shuō)明重復(fù)性較好。其中K326、G28、小黃金1025、NC82和革新三號(hào)5個(gè)品種分布區(qū)域的相對(duì)距離較近，說(shuō)明致香物質(zhì)差異較小，大白筋599和紅花大金元分別分布在不同的區(qū)域。此外，評(píng)價(jià)OPLS-DA模型質(zhì)量有3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，R2X、R2Y和Q2，其中R2X越接近1說(shuō)明模型能代表的樣品信息越多，R2Y和Q2越接近1說(shuō)明模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性越好，該模型的R2X=0.864，R2Y=0.821，Q2=0.816，說(shuō)明模型代表的樣本信息較多，穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性較好。聚類分析是一種多元統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)樣品質(zhì)量特征的相似性逐步聚集樣品。由圖1（b）可知，當(dāng)縱坐標(biāo)為6時(shí)，7個(gè)烤煙品種可聚為3類，K326、G28、小黃金1025、NC82和革新三號(hào)聚為一類，大白筋599和紅花大金元分別聚為一類。以上結(jié)果表明，K326、G28、小黃金1025、NC82和革新三號(hào)的香氣物質(zhì)較為相似，大白筋599和紅花大金元與其他品種相似度較低，OPLS-DA和聚類分析得到了相同的結(jié)論。

2.4? 致香物質(zhì)因子分析及差異代謝物分析

因子分析是一種通過(guò)降維方法將多個(gè)變量轉(zhuǎn)換為少數(shù)綜合變量的統(tǒng)計(jì)方法，從而簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)并解釋大部分原始信息。該方法已廣泛應(yīng)用于煙葉致香物質(zhì)成分的研究[3， 20]。本研究對(duì)7個(gè)烤煙品種72種致香物質(zhì)的含量進(jìn)行因子分析，特征值、方差貢獻(xiàn)率和累積方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表3。前5個(gè)因子的累積方差貢獻(xiàn)率為82.655%，且特征值均大于1，表明前5個(gè)因子可以解釋7個(gè)烤煙品種致香物質(zhì)的大部分變化信息。相應(yīng)得到的因子載荷矩陣，根據(jù)變量在5個(gè)因子上的負(fù)荷，篩選出28種致香物質(zhì)對(duì)香氣成分貢獻(xiàn)較大，包括：類胡蘿卜素降解產(chǎn)物15種，編號(hào)為2、4、5、6、7、8、10、12、13、15、16、18、19、20和22；棕色化反應(yīng)產(chǎn)物7種，編號(hào)為27、29、31、35、36、47和48；苯丙氨酸類降解產(chǎn)物3種，編號(hào)為51、55和56；類西柏烷類降解產(chǎn)物2種，編號(hào)為58和60；其他類致香物質(zhì)1種，編號(hào)為63。

為了更加全面地了解7個(gè)烤煙品種致香物質(zhì)差異，對(duì)28種比較重要的致香物質(zhì)進(jìn)行OPLS-DA分析。該模型中變量權(quán)重VIP可以表明樣品之間的關(guān)鍵差異代謝物，VIP值越大，說(shuō)明該成分對(duì)7組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力越強(qiáng)。以VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)[21]，篩選到17種香氣物質(zhì)（圖2）：β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮-1、巨豆三烯酮-2、巨豆三烯酮-3、巨豆三烯酮-4、3-羥基-β-二氫大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、反式-2，4-庚二烯醛、六氫假紫羅酮、5，6-環(huán)氧紫羅蘭酮、糠醇、2-乙?；量?、2-吡咯甲醛、吡喃酮、麥芽酚、茄酮和降茄二酮。

2.5? 感官質(zhì)量評(píng)價(jià)分析

感官質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果（表4）顯示，不同品種之間的感官質(zhì)量得分差異較小。燃燒性和灰色各品種得分一致，香氣質(zhì)、香氣量、余味、雜氣和刺激性各品種得分差異不大，其中革新三號(hào)的綜合得分相對(duì)較高，突出表現(xiàn)在香氣質(zhì)好，余味舒適，雜氣少。

3? 討? 論

在相同生態(tài)環(huán)境和栽培措施下，煙葉化學(xué)成分和香氣物質(zhì)的差異主要由遺傳因素決定[4，22]。本研究結(jié)果表明，7個(gè)不同品種中部葉的兩糖比和鉀氯比均在適宜范圍，鉀氯比的變異系數(shù)較大，其中K326、NC82、G28、小黃金1025和大白筋599的鉀氯比值較高，這可能與氯離子含量低有關(guān)。7個(gè)烤煙品種氮堿比整體偏高，均在1左右，只有NC82和大白筋599在適宜范圍，分析原因可能是當(dāng)?shù)氐适┯昧窟^(guò)高。

致香物質(zhì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個(gè)烤煙品種的致香物質(zhì)種類完全相同，但含量卻有較大差異。紅花大金元中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物在7個(gè)品種中含量最高，可能與該品種鮮煙葉中類胡蘿卜素含量高有關(guān)[23]。王國(guó)平等[24]通過(guò)SSR標(biāo)記對(duì)60份烤煙種質(zhì)進(jìn)行分類，大白筋599、紅花大金元和革新3號(hào)聚在一類，G28、K326、NC82和小黃金1025聚在一類。軒貝貝等[25]和丁永亮等[26]均證實(shí)了紅花大金元與其他烤煙品種的遺傳相似性很低，有明顯的特異性。本研究通過(guò)烤后煙葉致香物質(zhì)進(jìn)行聚類分析，將7個(gè)烤煙品種分為3類，聚類結(jié)果與前人研究相似，僅革新三號(hào)有差異，可能與其烘烤工藝有關(guān)。17種差異代謝物中，β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、反式-2，4-庚二烯醛和5，6-環(huán)氧紫羅蘭酮等在烤煙中含量較高的香氣物質(zhì)均在紅花大金元中含量最高，顯著高于其他6個(gè)品種。巨豆三烯酮-1、巨豆三烯酮-2、巨豆三烯酮-3和巨豆三烯酮-4在NC82和紅花大金元中含量均較高，這類致香物質(zhì)具有煙草甘甜香氣，可改善煙香，柔和豐滿，掩蓋雜味[27]。2-吡咯甲醛和降茄二酮在革新三號(hào)中含量高于多數(shù)其他品種，僅2-吡咯甲醛在小黃金1025中的含量與革新三號(hào)基本一致。吡喃酮在小黃金1025中的含量最高，且顯著高于紅花大金元和大白筋599。茄酮在NC82、G28和革新三號(hào)中含量較高，顯著高于其他4個(gè)品種。該致香物質(zhì)具有類似胡蘿卜的香味和甘草、茶樣芳香，雖然在烤后煙葉中的含量不是很高，但可提高卷煙香味品質(zhì)[28]?？啡┖望溠糠觾H在大白筋599中含量很低，其他品種之間差異不顯著，糠醛有甜味、似甜杏仁香，麥芽酚具有愉快的焦甜香味[29-30]。

感官質(zhì)量評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，不同品種之間差異較小，可能是因?yàn)榉N植在同一生態(tài)條件下的原因，進(jìn)一步證實(shí)了生態(tài)條件是影響煙葉品質(zhì)的重要因素[31]。雖然紅花大金元的致香物質(zhì)含量最高，但感官質(zhì)量評(píng)價(jià)得分并不高，表明烤后煙葉的感官質(zhì)量是由多種因素共同影響，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4? 結(jié)? 論

對(duì)7個(gè)優(yōu)質(zhì)烤煙核心親本烤后煙葉質(zhì)量比較結(jié)果表明，兩糖比和鉀氯比均在優(yōu)質(zhì)煙葉適宜范圍，大部分品種的氮堿比偏高，可適當(dāng)降低山東臨沂煙區(qū)氮肥施用量，達(dá)到優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)各類致香物質(zhì)含量，可將7個(gè)烤煙品種分為3類，G28、K326、小黃金1025、NC82和革新三號(hào)分為一類，大白筋599和紅花大金元各為一類。因子分析篩選到28種對(duì)7個(gè)烤煙品種香氣貢獻(xiàn)較大的致香物質(zhì)，進(jìn)一步通過(guò)OPLS-DA分析篩選出17種差異物質(zhì)，可根據(jù)香氣育種目的挑選合適的親本。

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