帕金森病患者血清代謝組學(xué)初步研究

蘭甜甜,常 樂(lè),侯莉微,王珍珍,李東初,陳桂生

帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病率及死亡率正在逐年增加。如果能找到與帕金森病發(fā)生發(fā)展過(guò)程相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物,盡早明確診斷并采取干預(yù)措施,將在很大程度上改善帕金森病患者的預(yù)后[1]。以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)為核心的代謝組學(xué)分析技術(shù)是研究代謝物變化規(guī)律的有力手段[2]。本研究使用基于LC-MS的非靶向代謝組學(xué)研究方法,通過(guò)分析帕金森病患者的血清代謝物水平,試圖找出與帕金森病相關(guān)的差異代謝物變化并進(jìn)行代謝通路分析,從而初步篩選出可能用于帕金森病臨床診斷的潛在生物標(biāo)志物,為探索帕金森病可能的致病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2020年3月至2021年12月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診的30例原發(fā)性帕金森病患者為實(shí)驗(yàn)組(PD組)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①患者年齡在18～80歲;②按照《中國(guó)帕金森病的診斷指南(2016版)》實(shí)施帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①帕金森疊加綜合征、多種因素引起的帕金森綜合征及遺傳性帕金森病綜合征;②嚴(yán)重的全身性疾病。選取同時(shí)期就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院體檢中心的15名受試者為健康對(duì)照組(HC組)。本研究已獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合《赫爾辛基宣言》要求,所有參與者在參與研究前均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 血清樣本的處理:使用一次性真空負(fù)壓采血管抽取空腹?fàn)顟B(tài)下45名受試者靜脈血液5 mL,將100 μL試樣放入試管,加入300 mL抽提液,攪拌30 s,超聲波10 min,-40 ℃放置1 h,離心15 min,取上清液并立即保存在-80 ℃低溫冰箱中等待后續(xù)的上機(jī)檢測(cè)[2]。

1.3 數(shù)據(jù)處理:采用 ProteoWizard軟件把原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為 mzXML,再用 XCMS實(shí)現(xiàn)峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊、整合等處理,再將該物質(zhì)與BiotreeDB(V2.1)自行建立的第二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配[2]。

2 結(jié)果

2.1 一般情況:本研究共收集了45份血清樣本,其中15份來(lái)自HC組,30份來(lái)自PD組。2組受試者年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心血管疾病等一般情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。

2.2 代謝組學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 質(zhì)量控制:用質(zhì)控(QC)樣本間的反應(yīng)峰高差來(lái)判定樣本檢測(cè)過(guò)程的穩(wěn)定性[3],QC樣本反應(yīng)強(qiáng)度的穩(wěn)定性良好。QC樣本具有良好的聚合性能。

2.2.2 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA):我們應(yīng)用OPLS-DA對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析[2],2組樣本區(qū)分非常顯著,樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。

2.2.3 差異代謝物的篩選:使用P值以及OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP值)來(lái)篩選差異代謝物[4],篩選出的差異代謝物必須同時(shí)滿(mǎn)足VIP值大于1和P值小于0.05。差異代謝物的篩選結(jié)果如表1所示,在PD組與HC組的對(duì)比中,一共篩選出30個(gè)差異代謝物。

表1 差異代謝物基本信息

2.2.4 差異代謝物分類(lèi)統(tǒng)計(jì):本研究篩選出的差異代謝物包括脂類(lèi)及類(lèi)脂分子、苯類(lèi)、有機(jī)酸及衍生物、有機(jī)氮化合物、有機(jī)氧化合物、有機(jī)雜環(huán)化合物及聚酮類(lèi)等,其中脂類(lèi)及類(lèi)脂分子(甘油磷脂類(lèi)為主)占比最高。

2.2.5 差異代謝物KEGG富集分析:本研究利用 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)將30個(gè)差異代謝物所對(duì)應(yīng)的代謝通路進(jìn)行分類(lèi)[5]。差異代謝物主要富集在13條代謝通路上。

2.2.6 差異代謝物代謝通路分析:對(duì)差異代謝物所在代謝通路進(jìn)行綜合分析[4]。圖中富集程度高、影響因子大的深色大氣泡代表了8條與差異代謝物相關(guān)性高的關(guān)鍵通路,它們分別是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,鞘脂代謝,嘌呤代謝,嘧啶代謝,精氨酸和脯氨酸代謝,原發(fā)性膽汁酸生物合成,葉酸生物合成和甘油磷脂代謝。

3 討論

本次研究中共發(fā)現(xiàn)了30個(gè)差異代謝物,其中甘油磷脂類(lèi)(GP)占比最大。GP主要用于構(gòu)成生物膜及作為信號(hào)分子調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)[6],其可分為磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰膽堿 (PC)和磷脂酰肌醇(PI)[7]。

PE參與組成哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜,有研究資料指出帕金森病患者出現(xiàn)了PE含量顯著下降的情況[8],PE是α-突觸核蛋白和生物膜相互作用的關(guān)鍵橋梁,PE的缺乏可導(dǎo)致α-突觸核蛋白穩(wěn)定狀態(tài)受損,這提示我們 PE的缺乏可能會(huì)加快 PD的病情進(jìn)展[7]。PS在多種信號(hào)通路中發(fā)揮作用,有研究發(fā)現(xiàn)利用抗PS抗體阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用可以發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用[9]。CL主要存在于線粒體內(nèi)膜,有資料指出導(dǎo)致帕金森病發(fā)展的主要風(fēng)險(xiǎn)因子是線粒體功能障礙和異常蛋白質(zhì)形成,PTEN誘導(dǎo)的激酶1(PINK1)基因表達(dá)突變會(huì)引起線粒體功能障礙,補(bǔ)充CL可修復(fù)線粒體功能[10]。

本研究還發(fā)現(xiàn)包括鞘脂代謝在內(nèi)的8條關(guān)鍵代謝通路的紊亂可能參與了帕金森病的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明,鞘脂代謝穩(wěn)態(tài)的破壞與神經(jīng)退行性病變中進(jìn)行性神經(jīng)元毒性變化有著很大關(guān)聯(lián)[7]。鞘脂代謝通路的紊亂影響了細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)等多種細(xì)胞過(guò)程。鞘脂在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,其代謝產(chǎn)物(神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、鞘氨醇1-磷酸酯)也起著調(diào)節(jié)信號(hào)分子的作用。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬來(lái)促進(jìn)帕金森病的發(fā)生[11]。鞘氨醇激酶(Sphk1/2)主要負(fù)責(zé)合成鞘氨醇-1-磷酸,有研究發(fā)現(xiàn)在帕金森病小鼠模型中,Sphk2在小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)的含量顯著下降[12]。有研究表明,葡糖基神經(jīng)酰胺、鞘氨醇等與代謝病相關(guān)的鞘脂可在體外促進(jìn)α-突觸核蛋白聚集,這表明鞘氨醇是人類(lèi)神經(jīng)元內(nèi)源性α-突觸核蛋白聚集體形成的誘因[13]。

綜上所述,帕金森病患者與健康對(duì)照組的代謝譜存在顯著差異。初步確定可能與帕金森病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物有30個(gè),其中甘油磷脂類(lèi)占比最大,這為進(jìn)一步研究將甘油磷脂類(lèi)代謝物作為帕金森病生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力提供了一定的依據(jù)。此外,本研究還進(jìn)一步觀察到有8條代謝通路的紊亂可能是PD的潛在發(fā)病機(jī)理,其中鞘脂代謝障礙可能是帕金森病的關(guān)鍵代謝事件,上述發(fā)現(xiàn)在一定程度上提高了我們對(duì)帕金森病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí),并有助于治療干預(yù)的靶向篩選。本研究的局限性在于樣本量少,未來(lái)還需要多中心多樣本的臨床研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證并與其他神經(jīng)退行性疾病的血清或血漿進(jìn)行比較,以便篩選出帕金森病患者特異性的生物標(biāo)志物。