牛源肺炎克雷伯氏菌的生物學(xué)特性研究※

●李 彬 彭樹德 白和平 吳同壘 史秋梅

（1. 秦皇島撫寧區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 河北 秦皇島 066004；2.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測中心 河北 唐山 063000；3.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 秦皇島 066004；4.唐河縣和杰農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社 河南 南陽 473000）

肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏陰性、需氧、無動(dòng)力桿菌，是一種條件性致病菌，屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬?？死撞暇且环N重要的人畜共患條件性致病菌，長期存在于動(dòng)物腸道及上呼吸道，通常在機(jī)體免疫力低下時(shí)或環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí)引起繼發(fā)性感染，近年來陸續(xù)報(bào)道出該菌引起不同動(dòng)物源性疾病[1]。2021 年11 月河北秦皇島某奶牛養(yǎng)殖場出現(xiàn)母牛化膿性乳房炎及犢牛呼吸道癥狀，從臨床樣品中分離出2 株致病性肺炎克雷伯氏菌，本研究通過莢膜型血清型分型、毒力基因與耐藥基因檢測以及藥物敏感性試驗(yàn)，研究牛源肺炎克雷伯氏菌的生物學(xué)特性，以期為該病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

LB 培養(yǎng)基，均購自北京陸橋；PCR 試劑均購自天根公司；抗生素藥敏紙片（大觀霉素、多粘菌素B、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、頭孢曲松、卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、乙酰甲喹、氟苯尼考、磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、頭孢拉定），均購自杭州微生物試劑有限公司；肺炎克雷伯氏菌基因組DNA，在河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取、保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

合成肺炎克雷伯氏菌K1、K2、K5、K20、K54、K57 等6 種主要莢膜血清型鑒定引物；毒力基因黏附素（mrkD、FimH、UreA、allS）、脂多糖（WabG）、莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因（RmpA、MagA）、鐵載體基因（Aerobactin、Uge）特異性鑒定引物，耐藥基因碳青霉烯酶（KPC、OXA、NDM）、產(chǎn)頭孢菌素β-內(nèi)酰胺類酶（DHA）、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺類酶（CTX-M1、TEM）特異性鑒定引物。由上海生工生物科技有限公司合成[2-4]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 莢膜血清型檢測采用PCR 法擴(kuò)增K1、K2、K5、K20、K54、K57 等6 種主要莢膜血清型，PCR 反應(yīng)體系為：2×Tqmaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，超純水7 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃終延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小符合目標(biāo)條帶大小即為陽性。

1.3.2 毒力基因與耐藥基因檢測采用PCR 法檢測分離菌的毒力基因與耐藥基因，PCR 體系為2×Taq PCR MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物1 μL（終濃度為10 μmol/L）、模板各1 μL，同時(shí)設(shè)置陰性對照。PCR 條件為：95℃ 5 min；95℃45 s， 50℃ 45 s，72℃ 1 min，30 個(gè) 循 環(huán)；72℃10 min。PCR 結(jié) 束 后 取 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物5 μL，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶符合預(yù)期即判斷為陽性。

1.3.3 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）所述的 K-B 紙片法進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，取過夜培養(yǎng)的菌液200 μL 均勻涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基，干燥3～5 min，將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況，測量抑菌圈直徑，并根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI-M100-S19）判斷該分離菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 莢膜血清型檢測結(jié)果

采用PCR 法檢測肺炎克雷伯氏菌的主要血清型，獲得血清型特異性基因大小為640 bp（圖1），與肺炎克雷伯氏菌血清型K2 特異性基因的大小一致，說明本次分離的2 株肺炎克雷伯氏菌均為K2 型。

2.2 毒力基因與耐藥基因檢測結(jié)果

對分離菌株進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌的9 種毒力基因的PCR 檢測結(jié)果，見表1。

由表1 可知，兩株分離菌均攜帶黏附素（mrkD、FimH）脂多糖（WabG）毒力基因；另外kp-1 株攜帶鐵載體基因（Aerobactin），kp-2 不攜帶。

耐藥基因檢測結(jié)果，見表2。

表2 耐藥基因檢測結(jié)果

由表2 可知，分離菌株攜帶產(chǎn)頭孢菌素β-內(nèi)酰胺類酶（DHA-1）、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺類酶（TEM、SHV），此外kp-1 株攜帶碳青霉烯酶（KPC）耐藥基因。

2.3 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果，見表3。

表3 抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，2 株分離菌均對大觀霉素敏感，對多粘菌素B、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、乙酰甲喹中敏，對氟苯尼考、磺胺間甲氧、磺胺二甲氧耐受。其中菌株kp-1 對頭孢曲松中敏，對頭孢拉定耐受；菌株kp-2 對頭孢曲松敏感，對頭孢拉定中敏。

3 討論與結(jié)論

王哲紅[5]在新疆地區(qū)集約化牛場進(jìn)行該菌檢測，其中鼻拭子樣本檢出率為11.52%（57/495），肛拭子檢出率為28.46%（150/527）；賈麗等[6]在肺炎克雷伯菌所致奶牛肺炎的病原分析及治療的研究中，從84 份鼻拭子樣品中分離到32 株肺炎克雷伯菌，檢出率為38.1%（32/84）；買爾哈巴·吾斯曼[7]對我國部分省市規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場收集患乳腺炎奶牛的奶樣進(jìn)行肺炎克雷伯菌的檢測，檢出率達(dá)26.5%（131/495）；Katsande 等[8]的研究顯示肺炎克雷伯菌占奶牛乳腺炎細(xì)菌病原的15.5 %；Aslan 等[9]研究證實(shí)肺炎克雷伯氏菌占呼吸道細(xì)菌性疾病的20%。以上結(jié)果表明了國內(nèi)外牛源性肺炎克雷伯氏菌的高分離率及致病率。

近年來，由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致菌株耐藥性不斷增強(qiáng)，有多重耐藥表現(xiàn)，耐藥性的增強(qiáng)主要由于兩個(gè)方面，一方面是耐藥基因的垂直傳播，傳給下一代；另一方面是基因重組到質(zhì)粒上，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、接合的方式傳播其耐藥基因。本研究耐藥基因檢測顯示分離菌攜帶TEM、SHV、DHA-1、KPC耐藥基因，表明分離菌可能具有進(jìn)行種內(nèi)或種間傳播以上幾種耐藥基因的能力。此外耐藥基因檢測結(jié)果與耐藥表型不完全一致，這可能由于養(yǎng)殖場日常使用抗生素較多，藥物間相互作用，抑制了相關(guān)耐藥基因的表達(dá)，也可能是耐藥基因發(fā)生突變導(dǎo)致具有同種耐藥基因的菌株，對同種抗生素表現(xiàn)的耐藥性不同。目前，疫苗被認(rèn)為是控制傳染性疾病的有效手段，但肺炎克雷伯氏菌具有較多血清型，這可能是目前該病原菌性疫苗尚未上市的原因之一，鑒于此對肺炎克雷伯氏菌的日常防控顯得尤為重要。