廣豐千金薯煙草花葉病毒lncRNA 測(cè)序鑒定、原核蛋白表達(dá)及其序列分析4

尹明華，張艷紅，李淑娟，段 俊，蔣曉峰

1. 上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001

2. 上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001

3. 上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001

4. 上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001

廣豐千金薯DioscoreapolystachyaTurczaninow.cv. Guangfeng Qianjin 為薯蕷科薯蕷屬多年生草本植物，原產(chǎn)于江西省上饒市廣豐區(qū)少陽鄉(xiāng)，為上饒市地方特色山藥品種[1]。廣豐千金薯肉質(zhì)根狀莖可菜藥兼用，菜用綿密粉嫩、軟糯爽口，藥用可健脾養(yǎng)胃、滋腎益精、預(yù)防心血管病、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老，是老少皆宜的滋補(bǔ)佳品，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷到東南亞和日本等國(guó)，深受消費(fèi)者青睞[2]。在生產(chǎn)中，廣豐千金薯由于長(zhǎng)期采用營(yíng)養(yǎng)繁殖，病毒感染嚴(yán)重，造成種性退化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、薯塊變小、畸形、賣相差，農(nóng)民收入受損[3]。因此，開展健康種苗研究，采用生物技術(shù)的方法脫除病毒，提純復(fù)壯，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)已成為廣豐千金薯生產(chǎn)中亟待解決的問題。而脫除病毒的前提是需要鑒定廣豐千金薯的病毒種類及其病毒基因序列信息。廣豐千金薯的病毒種類及其基因序列信息一旦探明，即可利用分子生物學(xué)的手段去廣豐千金薯試管苗脫毒效果進(jìn)行快速鑒定。目前，對(duì)廣豐千金薯的研究?jī)H限于高產(chǎn)栽培[3]、微型塊莖萌發(fā)[4]、離體快繁[2]、干旱脅迫[1]、遺傳穩(wěn)定性[5]、光合生理[6]等方面，但廣豐千金薯病毒種類及其蛋白原核表達(dá)和基因序列分析方面的研究尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通擬過lncRNA 測(cè)序鑒定廣豐千金薯病毒種類及其相關(guān)基因，利用大腸桿菌重組技術(shù)表達(dá)廣豐千金薯病毒蛋白，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行序列分析，旨在為廣豐千金薯脫毒苗的培育和鑒定提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

樣品采自江西省上饒市廣信區(qū)少陽鄉(xiāng)，由上饒師范學(xué)院王艾平教授鑒定為千金薯D.polystachyaTurczaninow. cv. Guangfeng Qianjin 試管苗。

1.2 儀器

Illumina Hiseq 4000 測(cè)序系統(tǒng)（美國(guó)Illumina公司）、DK-S22 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、GL-21M 型高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、LX-B150L 型不銹鋼立式滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）、SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰有限公司）、ZQLY-180 型恒溫?fù)u床（上海知楚有限公司）、JY 92-IIN 型超聲破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、DW-86L626 型超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）、蛋白純化儀（美國(guó)Bio-rad公司，NGC Quest? 10 Plus）、DYCZ-24DH 型SDS-PAGE 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Qubit 3.0 型核酸蛋白定量?jī)x（美國(guó)Life 公司-美國(guó)生命技術(shù)公司）。

2 方法

2.1 廣豐千金薯煙草花葉病毒種類及其蛋白基因的確定

2.1.1 RNA 提取 從江西鉛山紅芽芋試管苗植株上各采集100 mg 左右幼嫩葉組織，混合后提取小RNA。

2.1.2 RNA 質(zhì)檢 完成RNA 抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的質(zhì)量。

2.1.3 RNA 片段化 采取約400～500 bp 樣品放入Covaris M220 儀器中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.1.4 文庫(kù)構(gòu)建 cDNA 片段末端補(bǔ)平，加A，加測(cè)序接頭；瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段篩選，將目標(biāo)區(qū)域的片段回收；通過PCR 擴(kuò)增篩選未加上接頭的片段；PCR 產(chǎn)物純化，質(zhì)檢。試劑為TruSeq? DNA Sample Prep Kit。

2.1.5 橋式PCR DNA 片段的一端與芯片上引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近的另一種引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋（bridge）”；PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA 簇；線性化成為單鏈。試劑為Hiseq PE Cluster Kit v4 cBot。

2.1.6 Illumina Hiseq 4000 測(cè)序 加入改造過的DNA 聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只摻入單種堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第1 輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3’端黏性，繼續(xù)聚合第2 個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA 片段的序列。

利用SOAPdenovo v2.04（http://soap.genomics.org.cn/）拼接軟件對(duì)質(zhì)控后的全部clean data 進(jìn)行denovo 初步組裝，將組裝得到的全部contig 與病毒數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選得到來自病毒的contig；然后利用MITObim v1.6 通過迭代比對(duì)，將測(cè)序的所有clean reads mapping 到這些contig 上進(jìn)行延伸，通過gap close 獲得病毒的全基因組序列。

利用DOGMA 軟件（http://dogma.ccbb.utexas.edu/）對(duì)基因組中包含的gene 進(jìn)行預(yù)測(cè)。將預(yù)測(cè)基因的蛋白序列與Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp 比對(duì)（BLAST 2.2.28+），初步判斷廣豐千金薯的病毒種類及其相關(guān)基因。

2.2 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白基因的生物信息學(xué)分析

使用BioEdit 軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用ProtParam 預(yù)測(cè)酶的理化性質(zhì)，用ProtScale 預(yù)測(cè)酶的疏/親水性。使用GOR I 軟件在線預(yù)測(cè)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MOLD 在線預(yù)測(cè)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用WoLFPsort 在線預(yù)測(cè)基因的表達(dá)部位。通過軟件DNAMAN 和Bioedit 進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA5.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2.3 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白的大腸桿菌重組表達(dá)

2.3.1 感受態(tài)轉(zhuǎn)化及陽性克隆篩選 從超低溫冰箱中取出BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化；加入質(zhì)粒（pET-28a，5 μg），輕輕吹吸充分混勻，冰上放置30 min；水浴鍋42 ℃熱擊90 s，冰上放置1 min；加入800 μL 預(yù)熱LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃158 r/min 培養(yǎng)50 min；6000 r/min 離心4 min，去部分上清（800 μL 體積），剩余菌液混勻后涂至氨芐抗性平板上；倒置平板，37 ℃培養(yǎng) 12～16 h 可見出現(xiàn)菌落（陽性克?。?。

2.3.2 陽性克隆小量表達(dá)與鑒定 挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3 mL LB 液體培養(yǎng)基（氨芐抗性）中，37 ℃培養(yǎng)過夜后-20 ℃保種；分別挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3 mL LB 液體培養(yǎng)基（氨芐抗性）中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至A600約0.6；取部分菌液作為對(duì)照組，余下菌液加入IPTG 誘導(dǎo)劑（終濃度0.1 mmol/L），16 ℃震蕩培養(yǎng)12 h；分別取2 組菌液0.15 mL，12 000×g離心2 min，菌體沉淀以 40 μL 1×loading buffer 重懸裂解，SDS-PAGE 檢測(cè)。

2.3.3 蛋白大量表達(dá)及破菌檢測(cè) 取保存于-20 ℃的菌種100 μL 接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基（氨芐抗性）中震蕩培養(yǎng)過夜；取100 mL 菌液接種于 2000 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)至A600約0.6，降低培養(yǎng)溫度到30 ℃；加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.1 mmol/L，16 ℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)12 h；8000 r/min 離心3 min 收集菌體，重懸于50 mL預(yù)冷NTA-0 緩沖液中，冰浴30 min；超聲破碎菌體，參數(shù)設(shè)置為功率200 W、工作3 s、暫停4 s、99 個(gè)循環(huán)；16 000 r/min，4 ℃離心50 min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)，剩余上清及沉淀至于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)經(jīng)過質(zhì)量剪切前后的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行測(cè)序總堿基數(shù)、文庫(kù)平均插入長(zhǎng)度、Q20、Q30、平均測(cè)序深度統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。由表1 可知，建立的文庫(kù)準(zhǔn)確率很高。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Sequencing data statistics

3.2 基因組組裝

利用SOAPdenovo v2.04 拼接軟件對(duì)質(zhì)控后的全部clean data 進(jìn)行denovo 初步組裝，將組裝得到的全部contig 與病毒數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選得到來自病毒的contig；然后利用MITObim v1.6 通過迭代比對(duì)，將測(cè)序的所有clean reads mapping 到這些contig 上進(jìn)行延伸，通過gap close 獲得病毒的全基因組序列，最終組裝結(jié)果的統(tǒng)計(jì)，廣豐千金薯病毒種類是1 個(gè)，該病毒的總長(zhǎng)度為6395 bp，其GC 含量為43.35%。

3.3 Gene 查找

利用DOGMA 軟件對(duì)基因組中包含的gene進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后在進(jìn)行人工矯正。gene 預(yù)測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)可知，基因數(shù)量為6 個(gè)，基因總長(zhǎng)度為6264 bp，基因平均長(zhǎng)度為1043，基因間區(qū)GC 含量為44.65%。

3.4 基因功能注釋

將預(yù)測(cè)基因的蛋白序列與Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp比對(duì)（BLAST 2.2.28+），從而獲得預(yù)測(cè)基因的注釋信息。注釋結(jié)果如表2 所示。由表2 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白基因包括復(fù)制酶1（replicase，ORF1）、復(fù)制酶2（ORF2）、RNA 聚合酶（RNA polymerase）、運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein，MP）、帶電蛋白（charged protei）和外殼蛋白（coat protein，CP）。

表2 基因功能注釋結(jié)果Table 2 Gene function annotation results

3.5 廣豐千金薯煙草花葉病毒基因cDNA 序列

廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 基因cDNA 總長(zhǎng)度和（G+C）含量見表3。廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 基因序列結(jié)果已經(jīng)上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，基因登陸號(hào)為OL944011。

表3 廣豐千金薯煙草花葉病毒基因cDNA 序列Table 3 cDNA sequence of tobacco mosaic virus gene from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.6 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白氨基酸序列

Protparam 預(yù)測(cè)顯示廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2氨基酸序列分析見表4。由表4 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 分別由159、268、474、40、1613 和1114 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量分別為17 649.81、29 981.75、54 573.87、4 845.84、183 048.95 和125 860.14，等電點(diǎn)分別為5.09、8.90、6.83、11.89、6.57、6.53。

表4 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白氨基酸序列Table 4 Amino acid sequence of tobacco mosaic virus protein from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.7 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白親疏水性分析

經(jīng)ProtScale 軟件分析，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白除ORF5 為疏水性蛋白質(zhì)外，其余如ORF6、ORF4、ORF3、ORF1 和ORF2 均為親水性蛋白質(zhì)。

3.8 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過GOR 軟件預(yù)測(cè)，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析見表5。由表5 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF5 二級(jí)結(jié)構(gòu)由β-片層和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，ORF6、ORF4、ORF3、ORF1 和ORF2 的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α 螺旋、β-片層、無規(guī)則卷曲構(gòu)成。

表5 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 5 Secondary structures of tobacco mosaic virus proteins from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.9 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)顯示廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2三級(jí)結(jié)構(gòu)均為單體（圖1）。

圖1 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Tertiary structure of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.10 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白亞細(xì)胞定位

采用WoLFPsort 在線軟件對(duì)廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5和ORF6 分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、葉綠體中。

3.11 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

從構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖2）中可見，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6 與煙草花葉病毒CP 在一個(gè)分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6 在進(jìn)化上與煙草花葉病毒CP 的親緣關(guān)系較近，同源性為99.79%；廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF4 與煙草花葉病毒MP 在一個(gè)分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF4 在進(jìn)化上與煙草花葉病毒MP 的親緣關(guān)系較近，同源性為99.38%；廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF3 與煙草花葉病毒RNA 聚合酶在一個(gè)分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒RNA 聚合酶（ORF3）在進(jìn)化上與煙草花葉病毒 RNA 聚合酶的親緣關(guān)系較近，同源性為99.23%；廣豐千金薯煙草花葉病毒帶電蛋白（ORF5）與煙草花葉病毒帶電蛋白在一個(gè)分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒帶電蛋白（ORF5）在進(jìn)化上與煙草花葉病毒帶電蛋白的親緣關(guān)系較近，同源性為100%。廣豐千金薯煙草花葉病毒復(fù)制酶（ORF1）與煙草花葉病毒復(fù)制酶在一個(gè)分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒復(fù)制酶（ORF1）在進(jìn)化上與煙草花葉病毒復(fù)制酶的親緣關(guān)系較近，同源性為99.38%。廣豐千金薯煙草花葉病毒復(fù)制酶（ORF2）與煙草花葉病毒復(fù)制酶在一個(gè)分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒復(fù)制酶（ORF2）在進(jìn)化上與煙草花葉病毒復(fù)制酶的親緣關(guān)系較近，同源性為99.49%。

圖2 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.12 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白的序列比對(duì)信息

廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 同源蛋白的序列比對(duì)信息見圖3。圖3 中“*”號(hào)區(qū)域是該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。從圖3 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 的序列與煙草花葉病毒相似，同源性均在99.49%以上，因此，可以利用煙草花葉病毒基因序列來進(jìn)行廣豐千金薯煙草花葉病毒的種類鑒別。

圖3 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白氨基酸序列的同源性比較Fig. 3 Homology comparison of amino acid sequences of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.13 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白的大腸桿菌重組表達(dá)

轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑選AMP 抗性平板上長(zhǎng)出的陽性斑進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)與表達(dá)純化，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，除了ORF5 蛋白太?。?85 000）無法正常表達(dá)外，其他5 個(gè)蛋白（ORF1、ORF2、ORF3、ORF4 和ORF6）都成功表達(dá)，蛋白大小分別為183 050、125 860、54 570、29 980 和17 650。這說明，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白基因的lncRNA 測(cè)序結(jié)果是準(zhǔn)確的。

圖4 廣豐千金薯煙草花葉病毒的蛋白表達(dá)Fig. 4 Protein expression of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

4 討論

目前報(bào)道的山藥病毒病害主要為山藥花葉病毒病，生長(zhǎng)初期為害癥狀不明顯，到生長(zhǎng)中后期癥狀嚴(yán)重，葉上出現(xiàn)褪綠斑，隨后綠色花斑隆起，呈斑駁花葉、凸凹卷曲畸形、黃化或壞死，嚴(yán)重時(shí)整株矮化，生長(zhǎng)緩慢，地下莖縮小，畸形，產(chǎn)量下降[7]。鄢明峰等[8]發(fā)現(xiàn)日本山藥花葉病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）為瑞昌山藥花葉型病毒的病毒原，江西瑞昌、廣西和日本共32 個(gè)JYMV 分離物按其地域來源形成了3 個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化組群，表明JYMV 的進(jìn)化與其地理來源具有明顯的相關(guān)性。張蕾等[9]和Zou 等[10]均利用RT-PCR 手段檢測(cè)到淮山藥感染山藥溫和花葉病毒（Yam mild mosaic virus，YMMV）。Silva 等[11]利用RT-PCR 技術(shù)確定西非山藥的主要危害病毒為山藥花葉病毒。在本試驗(yàn)中，通過lncRNA 測(cè)序鑒定廣豐千金薯煙草花葉病毒基因，并利用大腸桿菌重組技術(shù)成功表達(dá)了廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白，第1 次確定了廣豐千金薯的主要危害病毒為煙草花葉病毒。

研究表明，山藥花葉病毒（yam mosaic virus，YMV）是一種具有大約785 nm 長(zhǎng)的彎曲絲狀顆粒，由一種單鏈RNA 和一種外殼蛋白組成，很難傳播到小范圍的宿主，由蚜蟲以非持久性方式傳播，在熱帶地區(qū)的山藥種植中造成了重要的經(jīng)濟(jì)損失[12]。YMV 基因組RNA 長(zhǎng)度為9608 個(gè)核苷酸，包含編碼3103 個(gè)氨基酸（aa）多蛋白的一個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）[13]，具有馬鈴薯Y 病毒屬特征，是馬鈴薯Y 病毒屬的一個(gè)獨(dú)特成員[14]。史躍偉等[15]通過RT-PCR 的方法獲得了貴州煙草花葉病毒CP基因，該基因全長(zhǎng)為507 bp，并利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)了貴州煙草花葉病毒CP 蛋白，為后期單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。煙草花葉病毒南瓜分離物CP基因與GenBank 上其他TMV 分離物CP基因核苷酸序列的同源性為86.5%～99.0%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為93.7%～99.4%，煙草花葉病毒南瓜分離物CP基因與原核表達(dá)載體pET-22b（+）連接，在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 誘導(dǎo)表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量約20 000 的融合蛋白[15]。云南5個(gè)不同地區(qū)煙草花葉病毒CP基因均為480 個(gè)堿基，編碼 159 個(gè)氨基酸，與TMV-U1、P、B 株和福建分離物有較高的同源率（90%以上），而與TMV 中國(guó)株系的同源率較低（70%～80%），與TMV 中國(guó)株應(yīng)屬于同種病毒不同的株系[16]。李凡等[17]的研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，再次確認(rèn)煙草花葉病毒云南分離物CP基因?yàn)?80 個(gè)堿基，編碼159 個(gè)氨基酸，并指出煙草花葉病毒云南分離物CP基因與T MV-U1 株系和TMV 韓國(guó)普通株系核苷酸同源性均為100%。但也有研究表明，云南煙草花葉病毒CP基因含477 個(gè)核苷酸，編碼159 個(gè)氨基酸[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，廣豐千金薯煙草花葉病毒CP基因cDNA 總長(zhǎng)度為480 bp，編碼159 個(gè)氨基酸組成，與煙草花葉病毒CP基因親緣關(guān)系較近。

煙草花葉病毒的致病性是由CP基因及3’端非編碼區(qū)以外的基因（如MP基因、復(fù)制酶基因等）決定的。煙草花葉病毒MP基因決定植物病毒在寄主植物細(xì)胞間的移動(dòng)從而可決定病毒對(duì)寄主的侵染性。有研究表明，煙草花葉病毒蠶豆分離MP基因由807 個(gè)核苷酸組成，編碼268 個(gè)氛基酸，煙草花葉病毒的MP基因在不同株系中非常保守，同源性極高[19]。王得元等[20]對(duì)廣東煙草花葉病毒MP基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得了一條0.8 kb的特異擴(kuò)增產(chǎn)物，與已發(fā)表的TMVMP基因編碼區(qū)803 bp 大小相近。余曉紅等[21]克隆了煙草花葉病毒MP基因，發(fā)現(xiàn)MP基因含有1 個(gè)507 bp 的閱讀框架，編碼268 個(gè)氨基酸，與國(guó)外發(fā)表的TMVU1 株運(yùn)動(dòng)蛋白基因cDNA 的核昔酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列相比，同源率均高達(dá)98 以上，再次表明煙草花葉病毒MP基因在同一病毒的不同株系中是相當(dāng)保守的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，廣豐千金薯煙草花葉病毒MP基因的cDNA 總長(zhǎng)度為807 bp，編碼268 個(gè)氨基酸，與煙草花葉病毒MP基因親緣關(guān)系較近。

因此，廣豐千金薯煙草花葉病毒與煙草花葉病毒的親緣關(guān)系較近，同源性在99%以上。表明廣豐千金薯煙草花葉病毒不屬于馬鈴薯Y 病毒屬，與煙草花葉病毒同源性極高，氨基酸序列及核酸序列與煙草花葉病毒其他植物分離物相似度高，在進(jìn)化上高度保守。因此，可以利用煙草花葉病毒基因序列來進(jìn)行廣豐千金薯煙草花葉病毒的種類鑒別。

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